đánh giá khả năng kiểm soát sinh học bệnh rụng lá corynespora bằng vi khuẩn bacillus spp tự do và nội sinh cây cao su từ in vitro đến ex vivo

Biện pháp kiểm soát sinh học nấm bệnhC.cassiicola trên cây cao su mang lại nhiều lợi ích tiềm năng về phòng ngừa, điều trị cũng như hạn chế khả năng gây hại cho môi trường, là một biện p

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH- SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH SVTH: Lê Thanh Quỳnh Như

MSSV: 1253012264 KHÓA: 2012-2016

Bình Dương, 05/2016

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ MSSV: 1253012264

KHÓA: 2012 – 2016

Bình Dương, 05/2016

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô đã giảng dạy và tạo điều kiện cho em học tập trong suốt các năm học ở Khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh đã hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài Khoảng thời gian làm việc cùng thầy, em đã được rèn luyện bản thân rất nhiều Em cũng cảm ơn cô Dương Nhật Linh, cô không chỉ dạy em những kiến thức khô khan trên giảng đường mà còn là những bài học bổ ích về cuộc sống Em cảm ơn Thầy Cô đã luôn trao cơ hội cho em

Bên cạnh đó, em xin cảm ơn chị Phan Thị Hoài Thương và các em trong phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn bạn bè đã luôn bên tôi, là điểm tựa tinh thần khi tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài cũng như trong cuộc sống

Con cảm ơn Ba, Mẹ với những bài học quý giá giúp con thêm tự tin đứng vững trên đôi chân mình

Một lần nữa, em xin gửi đến tất cả các thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn chân thành nhất

Sinh viên thực hiện

LÊ THANH QUỲNH NHƯ

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN CÂY CAO SU 4

1.1.1 Sơ lược nguồn gốc 4

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM Corynespora cassiicola 9

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.3.3 Môi trường – hóa chất – thuốc nhuộm 16

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.4.1 Quy trình thí nghiệm 17

2.4.2 Tái phân lập và giải trình tự hỗ trợ định danh chủng vi sinh vật thử

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 TÁI PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH 28

3.2 THỬ KHẢ NĂNG KHÁNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH 30

3.3 ĐỌC KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM CORYNESPORA CASSIICOLA TRÊN LÁ CẮT RỜI VÀ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT 31

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Cấp độ bệnh trên lá gây nhiễm tách rời 24 Bảng 3.1 Kết quả phân lập 28 Bảng 3.2 Khả năng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 30

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Đường kính vòng kháng nấm của dịch nguyên và dịch tách chiết 31

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình toàn bộ thí nghiệm 17 Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết chất kháng nấm 21

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Triệu chứng bệnh hại trên cây cao su 5

Hình 1.2 Chu trình gây nhiễm nấm Corynespora cassiicola 11

Hình 2.1 Kết quả kháng nấm của vi khuẩn 23

Hình 2.2 Cấp độ bệnh trên lá gây nhiễm tách rời 25

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể (A) và vi thể (B) của vi khuẩn Bacillus sp T3 (100X) 28

Hình 3.2 Hình ảnh đại thể (A) và vi thể (B) của vi khuẩn Bacillus sp S29 (100X) 29

Hình 3.3 Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng Bacillus sp T3……… 30

Hình 3.4 Kết quả dựng cây phát sinh loài chủng Bacillus sp T3 31

Hình 3.5 Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng Bacillus sp S29 32

Hình 3.6 Kết quả dựng cây phát sinh loài chủng Bacillus sp S29 33

Hình 3.7 Kết quả kháng bằng giếng khuếch tán chủng Bacillus sp T3 ………… 33

Hình 3.8 Kết quả kháng bằng giếng khuếch tán chủng Bacillus sp S29 ………… 34

Hình 3.9 Kết quả gây nhiễm trên lá tách rời….……… 36

Hình 3.10 Kết quả phân tích tế bào xâm nhiễm……… 36

Hình 3.11 Kết quả kháng nấm chủng Bacillus sp T3 ……… 37

Hình 3.12 Kết quả kháng nấm chủng Bacillus sp S29……… … 37

Hình 3.13 Kết quả phân tích mẫu bệnh sau xử lý……… 38

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C cassiicola Corynespora cassiicola

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây cao su là loài cây có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế và xã hội ở nhiều nước châu Á như Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc và nhiều quốc gia khác ở châu Phi (Pu Jinji và cs, 2007) Ở Việt Nam, sản lượng và năng suất khai thác cao su không ngừng tăng lên trong 10 năm qua, Việt Nam hiện là một trong những nước dẫn đầu thế giới về sản lượng và xuất khẩu cao su Tại đại hội Hiệp hội Cao su Việt Nam nhiệm kỳ 4 (2015-2017) được tổ chức tại TP.HCM chiều 31/7/2015, ông Trần Ngọc Thuận - Chủ tịch hiệp hội cho biết tính đến cuối năm 2014 Việt Nam xếp thứ 3 về sản lượng cao su thiên nhiên trên thế giới với thị phần khoảng 7,9%

Bệnh rụng lá Corynespora, gây ra bởi nấm Corynespora cassiicola là một trong

những căn bệnh nghiêm trọng nhất của cây cao su ở các quốc gia châu Á và châu Phi (Ismail và Jeyanayagi, 2003) Bệnh xuất hiện lần đầu tại Sierra Leone (châu Phi) vào năm 1936 tiếp đó là Ấn Độ năm 1958 (Ramakirishnan và Pillai, 1961) Bệnh ảnh hưởng ở cả lá trưởng thành và lá non và gây rụng lá trong suốt cả năm Điều này dẫn đến chậm phát triển ở cây non, giảm sản lượng ở cây trưởng thành hay thậm chí gây chết trên các dòng

cao su mẫn cảm Năm 1998, bệnh được ghi nhận xuất hiện ở Việt Nam Từ lúc phát hiện

bệnh cho đến nay, số lượng dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên đáng kể Bên

cạnh đó, các dòng vô tính cao su đang ngày càng trở nên mẫn cảm với Corynespora

cassiicola, điển hình là ở Việt Nam bệnh ban đầu chỉ xuất hiện ở hai dòng vô tính RRIC

103 và RRIC 104 nhưng theo số liệu điều tra của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, năm 2006, 148/148 dòng vô tính được điều tra điều bị nhiễm bệnh với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Nguyễn Anh Nghĩa và Vũ Thị Quỳnh Chi, 2011) Ở Sri Lanka, dòng vô tính RRIC 110 được trồng đại trà và là dòng kháng bệnh trước đó thì nay đã trở nên mẫn cảm với bệnh (Jayashinghe và Silva, 1996) Tất cả những điều trên cho thấy có sự tồn tại của

các nòi sinh lý nấm C cassiicola khác nhau đang gây hại trên cây cao su và/hoặc là sự tiến hóa của mầm bệnh đang diễn ra và làm hình thành nên các nòi nấm C cassiicola

mới

Hiện nay việc kháng lại nấm bệnh C cassiicola chủ yếu sử dụng biện pháp hóa

học để kiểm soát, điều này đã gây nên không ít tác hại đối với môi trường, suy thoái đất

và dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở cây cao su (Zhao và cs., 2010, Narayanan và Mydin, 2012) hoặc ảnh hưởng đến sức khỏe người trồng Biện pháp kiểm soát sinh học

nấm bệnhC.cassiicola trên cây cao su mang lại nhiều lợi ích tiềm năng về phòng ngừa,

điều trị cũng như hạn chế khả năng gây hại cho môi trường, là một biện pháp tốt, có nhiều triển vọng trong tương lai (Houdart và cs., 2009) tuy nhiên lại chưa nhận được sự quan tâm từ các nhà khoa học trên thế giới

Nhiều nghiên cứu và tài liệu chứng minh Bacillus là nhóm vi sinh vật có khả năng kiểm soát sinh học với nấm bệnh trên cây trồng như kiểm soát Aspergillus flavus trên đậu phộng (Kong và cs., 2010), kiểm soát Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua (Ebtsam và cs., 2009) Nhiều chi Bacillus có khả năng tạo ra nhiều hợp chất sinh học như

chất kháng nấm và kháng khuẩn, các enzym ngoại bào, các chất kích thích sinh trưởng thực vật và các chất hoạt động bề mặt (Bottone và cs., 2003)

Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu chứng tỏ khả năng kiểm soát sinh học của

Bacillus đối với C cassiicola, ức chế in vitro 100% nấm C cassiicola và tiêu diệt được

nấm ở nồng độ nguyên chất của dịch nuôi cấy Những sàng lọc bước đầu này đã được công bố tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc tại Hà Nội (Tô Hồng Sơn và cs., 2013), tạp chí Sinh học (Nguyễn Văn Minh và cs., 2013) Bên cạnh đó, nghiên cứu được

công bố gần đây nhất đã tối ưu hóa môi trường cho Bacillus sp T3 sinh hợp chất kháng

nấm cao nhất được công bố trong Hội nghị nấm học và ứng dụng (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014)

Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành đề tài “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM

SOÁT SINH HỌC ex-vivo BỆNH RỤNG LÁ CAO SU CORNESPORA BẰNG VI KHUẨN Bacillus spp TỰ DO VÀ NỘI SINH CÂY CAO SU”

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CAO SU

1.1.1 Sơ lược nguồn gốc

Cây cao su (Hevea brasiliensis) là một loại cây thân gỗ thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae) là cây duy nhất được chọn để trồng và khai thác trên quy mô lớn trong

số rất nhiều họ cây cao su khác nhau (Nguyễn Hữu Trí, 2004)

Cây cao su có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone – Nam Mỹ (Souza và cs., 2013), được H.Wickham du nhập vào châu Á và châu Phi năm 1876 Cao su lần đầu tiên đưa vào Đông Dương do J.B.Louis Pierre trồng tại Thảo cầm viên Sài Gòn năm 1877 Sau nhiều lần thất bại, năm 1897, bác sĩ Yersin đã thành công khi đưa cao su trồng tại Suối Dầu – Nha Trang Đầu thập niên 50 một số diện tích cao su cũng định hình tại Tây Nguyên và miền Trung (Nguyễn Hữu Trí, 2004)

1.1.2 Vai trò

Cao su có tầm quan trọng kinh tế lớn do chất lỏng tiết ra như nhựa cây của nó gọi là nhựa mủ - latex được thu thập lại và có giá trị cao trong sản xuất cao su tự nhiên (Trần Đức Viên, 2008)

1.1.3 Tình hình chung

Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật, quy trình khai thác Tuy nhiên, những thiệt hại do bệnh cũng gia tăng đáng kể Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài vi sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế Đồng thời, có 24 loại bệnh hại cho cây cao su Việt Nam (Nguyễn Hải Đường, 1997)

1.2 TỔNG QUAN BỆNH RỤNG LÁ CAO SU Corynespora

1.2.1 Biểu hiện bệnh

Triệu chứng trên cây trưởng thành: lá xuất hiện vệt như xương cá là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh rụng lá Corynespora, được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới

bao gồm Sri Lanka, Indonesia, Malaysia và châu Phi (Jayasinghe và cs, 1999) Khi quan sát trên vườn cây có thể thấy lá vàng ở cả tầng giữa và tầng lá trên, nhìn từ dưới lên có thể thấy lá bệnh vàng lốm đốm, lá non xoắn cuộn lại Triệu chứng bệnh tùy thuộc vào tính mẫn cảm của dòng vô tính, điều kiện thời tiết, giai đoạn trưởng thành của cây, nơi canh tác và các vị trí bị hại

Triệu chứng trên lá: lá non có các vết bệnh hình tròn chuyển từ xám đến nâu có vòng vàng bao xung quanh Rụng lá lặp đi lặp lại nhiều lần dẫn đến chết cây (Liyanage và cs, 1986) Với những lá có màu xanh, triệu chứng đặc trưng với vết bệnh màu vàng chuyển sang đen, đường kính khoảng 1-3 mm, phân bố dạng xương cá dọc theo gân lá Nếu gặp điều kiện thuận lợi các vết bệnh phát triển rộng gây chết từng phần sau đó toàn bộ lá và bắt đầu rụng lá chét (Phan Thành Dũng, 2010)

Triệu chứng trên chồi và cuống lá: dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây Trên cuống lá có vết nứt màu đen có chiều dài từ 0,5- 3,0 mm Nếu cuống bị hại thì toàn bộ lá chét bị rụng mặc dù không có bất cứ triệu chứng nào trên phiến lá (Phan Thành Dũng, 2010)

Hình 1.1 Triệu chứng bệnh hại trên cây cao su;

A dạng bệnh đốm và xương cá; B đốm có lỗ và viền vàng; C héo và bạc đầu lá; D dạng xương cá và cháy phiến lá (Phan Thành Dũng, 2010)

1.2.2 Ảnh hưởng của bệnh

Bệnh rụng lá Corynespora được gây ra do tác nhân nấm Corynesporaa cassiicola

Đây là loại bệnh gây thiệt hại rất nặng nề và trở thành đại dịch ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam Ngoài việc gây rụng lá hàng loạt, nấm Corynespora còn ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây con và giảm sản lượng mủ của cây đang thu hoạch

Bệnh xuất hiện lần đầu tại Sierra Leone (châu Phi) vào năm 1936 tiếp đó là Ấn Độ năm 1958, Malaysia năm 1961,…Tại Malaysia, Thái Lan và Indonesia gây ra hàng ngàn ha cao su bị hại nặng có khi chết toàn bộ cây (Phan Thành Dũng, 2009)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện trên cây cao su tại Đông Nam Bộ và Tây Nguyên vào tháng 8 năm 1999 Dịch hại xuất hiện gây hại cho gần 3.000 ha cây cao su tại Quảng Nam và Sa Thầy vào năm 2009 Năm 2010, bệnh đã phát sinh trên diện rộng ở một số tỉnh Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và miền Trung, tập trung trên các dòng vô tính cao su RRIV 4 (Nguyễn Anh Nghĩa và Phan Thành Dũng, 2011)

Ở Sri Lanka, chỉ một năm sau lần phát hiện đầu tiên, bệnh rụng lá Corynespora đã trở thành dịch bệnh và kéo dài từ năm 1986 đến 1988 Hơn 4.000 ha cao su mà chủ yếu là dòng vô tính RRIC103 và một vài dòng vô tính mẫn cảm khác đã bị nhiễm bệnh nghiêm trọng Chính phủ Sri Lanka đã phải chi ra hơn 530.000 USD để bồi thường cho khoảng 3.000 hộ tiểu điền bị ảnh hưởng để loại bỏ các dòng vô tính này và trồng lại bằng các dòng vô tính kháng bệnh (Liyanage và cs., 1989)

Ở Indonesia, sau khi phát hiện bệnh vào năm 1980, bệnh rụng lá Corynespora đã dần lan sang các vùng trồng cao su khác Từ năm 1996, bệnh Corynespora đã xuất hiện ở tất cả các vùng trồng cao su ở nước này Trong những năm 1980, gần 1.200 ha cao su đã bị nhiễm bệnh nặng, trong đó 400 ha phải bị loại bỏ hoàn toàn với thiệt hại kinh tế lên đến 200 tỉ Rupiah (hơn 20 triệu USD) (Liyanage và cs., 1989)

Ở Ấn Độ, từ năm 1996 toàn bộ các vùng trồng cao su đều xuất hiện bệnh Corynespora Dịch bệnh rụng lá Corynespora được ghi nhận lần đầu tiên tại Viện nghiên cứu cao su Ấn Độ (RRII) và Trạm Nghiêncứu Giống cao su ở Nam Karnataka (Rajalakshmy và Kothandaraman, 1996) Kế tiếp, vào năm 1999, bệnh Corynespora trở nên nghiêm trọng với tỉ lệ bệnh lên đến 50 – 70 % ở một số vùng trồng cao su Hơn 10.000 ha cao su bị ảnh hưởng và phải phun thuốc diệt nấm (Jacob, 2006)

Tháng 8 năm 1999, bệnh Corynespora được phát hiện ở Việt Nam ngay tại Trạm Thực nghiệm cao su Lai Khê thuộc Viên Nghiên cứu cao su Việt Nam (RRIV) Đến tháng 9/1999, bệnh được phát hiện ở các khu vực trồng cao su khác ở Đông Nam Bộ, chủ yếu là hai dòng vô tính RRIC 103 và RRIC 104 Triệu chứng đặc trưng của bệnh được tìm thấy ở cây cao su thời kỳ kiến thiết cơ bản lẫn cây cao su trưởng thành Các dòng vô tính khác cũng dược xác định là rất mẫn cảm với bệnh là LH 88/372, RRIC 103 và RRIC104 (Dung and Hoan, 1999) Tháng 1 năm 2000, bệnh bùng phát và lây lan nhanh chóng tại công ty cao su Lộc Ninh, hơn 200 ha cao su đang trong thời kỳ kiến thiết cơ bản của dòng vô tính RRIC 104 rụng lá hoàn toàn, buộc phải thanh lý và thiêu hủy để hạn chế mầm bệnh lây lan Từ lúc phát hiện cho đến nay, số lượng dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên rất đáng kể Theo số liệu điều tra của bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, năm 2006, 148/148 dòng vô tính được điều tra đều bị nhiễm bệnh với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Nguyễn Anh Nghĩa và Vũ Thị Quỳnh Chi, 2011)

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trước tình hình dịch bệnh này, tại Việt Nam cũng đã có một số hội thảo và tin tức trên các báo chí về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su như:

- Tháng 9/2010, tại Thủ Dầu Một, hội thảo “Phòng trừ bệnh rụng lá cao su do

nấm Corynespora gây ra ở Việt Nam” được Cục Bảo vệ thực vật và Viện

nghiên cứu Cao su Việt Nam phối hợp với Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT) tỉnh Bình Dương tổ chức

- Ngày 15/09/2010 trên trang vietstock có bài “Cao su lảo đảo trong đại dịch”-

“tính đến tháng 9-2010, toàn tỉnh Bình Phước hiện có hàng ngàn ha cao su bị

nhiễm bệnh vàng rụng lá, theo Chi cục Bảo vệ Thực vật (BVTV) tỉnh, bệnh

không loại trừ một huyện, thị xã nào trong toàn tỉnh và tập trung chủ yếu ở huyện Đồng Phú, Hớn Quản, mỗi huyện gần 1.000 ha.Ước tính thiệt hại hàng trăm tỉ đồng”

- Ngày 24/10/2013, trên trang điện tử của sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông

Thôn tỉnh Bình Phướccó bài “Bệnh vàng rụng lá Corynespora trên cây cao su

có chiều hướng diễn biến bất thường trong mùa mưa”

- Ngày 20/07/2014, trên trang điện tử của sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông

Thôn tỉnh Bình Phước có bài “Bình Phước: Bệnh vàng rụng lá, nấm hồng

trên cây cao su có xu hướng tăng”

Giải pháp về bệnh rụng lá Corynespora hiện nay là dùng các chất hóa học Một số sản phẩm hoá học hiện đang được sử dụng như: thuốc thuộc gốc hexaconazole (Anvil 5SC, Hexin 5SC, Saizole 5SC, Vivil 5SC, Callihex 5SC,…); gốc carbendazim (Vicarben 50SC, Carbenzim 500FL, Carbenvil 50SC, Carban 50 SC, Benzimidin 50SC…); thuốc phối trộn gốc carbendazim và gốc hexaconazole (Vixazol 275SC, Hexado155SC, Arivit 250SC, Calivil 55SC, …)

Việc sử dụng quá nhiều thuốc trị bệnh có nguồn gốc hóa học có thể dẫn đến suy thoái đất,dẫnđến hiện tượng kháng thuốc và không hiệu quả (Zhao và cs., 2010, Narayanan và Mydin, 2012) Hơn nữa do cây cao su có tán cao, việc phun xịt thuốc hoá học độc hại đem lại nhiều nguy hại cho sức khoẻ cho con người Trong thực tế, khi bệnh rụng lá Corynespora xảy ra, người dân sử dụng hoá học để kiểm soát của nấm cũng cần phun xịt 3 lần liên tiếp mới có hiện tượng suy giảm và như vậy cây cao su cũng đã bị giảm năng suất

Trong khi đó, phòng trừ sinh học hứa hẹn nhiều tiềm năng về lợi ích như có thể phòng ngừa và lẫn điều trị, là hướng giải pháp được khuyến khích phát triển hiện nay trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su chưa có giải pháp nào được công bố Các nhà khoa học trong và ngoài nước chỉ mới tập trung nghiên cứu về tình trạng của bệnh rụng lá Corynespora và nghiên

cứu các giống cao su mới có khả năng kháng C.casiicola

Cùng hướng nghiên cứu này có 1 nhóm nhà khoa học từ Ấn Độ, họ đã có một số

thành công về phòng trừ sinh học bệnh rụng lá mùa mưa trên cây cao su do Phytophthora

gây ra từ vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) với công trình công bố vào năm 2013 là

“Novel bacterial endophytes from Hevea brasiliensis as biocontrol agent against

Phytophthora leaf fall disease”trên tạp chí “International Organization for Biological Control (IOBC)”

1.3 TỔNG QUAN NẤM Corynespora cassiicola

1.3.1 Phân loại

Theo nghiên cứu phân loại gần đây nhất (Kirk và cs., 2004) thì nấm

Corynespora cassiicola được phân loại như sau:

Trong điều kiện bình thường C cassiicola khó sinh bào tử nên có thể kích thích bằng

cách chiếu tia cực tím trong thời gian ngắn hay chiếu liên tục bằng ánh sáng huỳnh quang để tăng hình thành bào tử (Chee và cs., 1988)

Môi trường PDA là môi trường tối ưu cho sự phát triển của C cassiicola

(Jayasinghe và cs., 1988) Hình dạng và màu sắc của tản nấm thay đổi tùy vào điều kiện nuôi cấy, trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang nấm phát triển dàn mỏng và rộng Nấm

thường phát triển tụ lại, dày lên khi phát triển trong môi trường tối C cassiicola phát

ẩm 80% - 90% và luân phiên chiếu sáng (12 giờ sáng và 12 giờ trong tối) Khối lượng sợi nấm lớn nhất sau 15 ngày nuôi cấy

Tản nấm phát triển trên môi trường PDA có màu xám hoặc màu nâu, mặt dưới là màu xám hoặc màu đen, có những vòng tròn đồng tâm

1.3.3 Con đường xâm nhập và khả năng gây bệnh

Nấm C.cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men (cellulose) giúp phân hủy màng tế bào Trong quá trình sinh trưởng nấm còn tiết ra chất độc (CC toxin), hợp chất này rất độc cho cao su, cho nên chỉ

với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá, nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và non cũng như cuống lá và chồi Hơn nữa, do xảy ra quanh năm và suốt chu kỳ sống của cây cao su nên có tác hại lớn, nhất là cho các dòng vô tính mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 1995) Ngoài cây cao su, nấm còn là ký sinh của trên 150 loại cây trồng thuộc nhiều họ khác nhau trên 80 nước thuộc nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và có khả năng gây hại trên tất cả các bộ phận của cây từ lá đến rễ Chưa có ghi nhận nấm

từ cây cao su gây hại cho cây khác và ngược lại(Phan Thành Dũng, 2000)

Nấm C cassiicola có thể tồn tại trong đất, trên các xác bã thực vật, vết bệnh trong

thời gian dài, nấm vẫn có khả năng gây bệnh trên lá cao su khô trong 3 năm (Chee và cs.,

1988) Khi có điều kiện thích hợp (lá ẩm và độ ẩm tương đối cao 80% hoặc hơn), C

cassiicola sẽ xâm nhập vào kí chủ, chủyếu ởmặt dưới của lá qua lớp biểu bì và khí

trên thân và rễ khi cây ởgiai đoạn cây con Tổn thương lớn hình thành trên rễ chính ở

15oC và sự tăng trưởng của rễ phụ chậm Thời tiết khô có thể ức chế sự xâm nhiễm của

C cassiicola vào lá và rễ cây

Hình 1.2 Chu trình gây nhiễm nấm gây bệnh hại trên cây cao su

(Nguồn: Fulmer A., 2012)

Chi: Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn (có 51 loài được xác định chính xác và nhiều loài khác

chưa phân loại rõ ràng) và đa dạng, thuộc họ Bacillaceae Đặc trưng của loài này là sinh nội bào tử (Nguyễn Văn Thanh, 2009)

1.4.2 Đặc điểm

1.4.2.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm cụ thể về chi này được mô tả như sau: tế bào hình que thẳng hoặc gần

mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả

năng di động trong mỗi loài, roi điển hình nằm hai bên Hình thành nội bào tử chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào, hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí Trao đổi chất kiểu hô hấp nghiêm ngặt hoặc cả hô hấp và lên men đồng thời, đòi hỏi nhiều thành phần Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hoá hô hấp là oxi phân tử Hầu hết cho catalase dương tính (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008)

1.4.2.2 Đặc điểm sinh học

Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25ºC – 75ºC, khoảng pH rộng 2 – 11, nồng độ muối từ dưới 2% – 25% (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008).Khi gặp điều

kiện bất lợi hay trong chu trình phát triển tự nhiên, Bacillus có khả năng hình thành nội

bào tử Quá trình hóa bào tử bắt đầu vào cuối thời kỳ sinh trưởng, phát triển, khi gặp điều kiện thức ăn cạn kiệt hoặc có tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất có hại Đặc điểm nổi bật

của bào tử Bacillus là có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và men phân giải nhờ có lớp vỏ bào tử Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, Bacillus tiết ra kháng sinh

tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh Kháng sinh đó làm phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn lân cận, giải phóng chất dinh dưỡng và dùng làm thức ăn cho nó, đồng thời chất dinh dưỡng đó có thể giúp nó quay trở lại dạng sinh dưỡng (Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2009)

1.4.3 Ứng dụng

Trên thế giới Bacillus là một nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều và được

chứng minh có khả năng kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh như kiểm soát nấm

Aspergillus flavus trên cây đậu phộng (Kong và cs., 2010), kiểm soát Fusarium solani

gây bệnh trên cây cà chua (Ebtsam và cs., 2009), kiểm soát nấm Fusarium oxysporum f

sp spinaciae (Zhao và cs., 2013) Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc Bacillus

kiểm soát nấm C cassiicola gây bệnh rụng lá trên cây cao su

Tại Việt Nam, đã có những nghiên cứu chứng tỏ khả năng kiểm soát sinh học của

Bacillus đối với C cassiicola, ức chế in vitro 100% nấm C cassiicola và tiêu diệt được

nấm ở nồng độ nguyên chất của dịch nuôi cấy Những sàng lọc bước đầu này đã được công bố tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc tại Hà Nội (Tô Hồng Sơn và cs., 2013), tạp chí Sinh học (Nguyễn Văn Minh và cs., 2013) Bên cạnh đó, nghiên cứu được

công bố gần đây nhất đã tối ưu hóa môi trường cho Bacillus sp T3 sinh hợp chất kháng

nấm cao nhất được công bố trong Hội nghị nấm học và ứng dụng (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014)

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

− Thời gian: từ tháng 09/2015 – 02/2015

Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chủng vi khuẩn thử nghiệm

cao su tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3)

Chủng vi khuẩn Bacillus sp S29 phân lập từ vùng đất trồng cao su tại huyện

Chơn Thành, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3)

2.2.2 Chủng nấm thử nghiệm

Chủng nấm Corynespora cassiicola BP5 gây bệnh trên cây cao su phân lập tại Thị xã

Đồng Xoài, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

2.3 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - MÔI TRƯỜNG

− Nutrient broth (NB), Nutrient agar

(NA)

− Cồn 96o, cồn 70o, NaCl, HCl, NaOH

− Thuốc nhuộm crystal violet, lugol,

safanin O, lactophenol

− Nguồn đường: D - glucose

− Nguồn nitơ: amoni nitrat (NH4NO3)

− Nguồn muối khoáng: K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Quy trình thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu đề tài, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ:

Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm 2.4.2 Tái phân lập chủng vi sinh vật thử nghiệm

Phương pháp kiểm tra

Nguyên tắc

Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (–) làm cho khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003)

Thực hiện

Thao tác nhuộm Gram gồm các bước sau:

− Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô

− Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước

− Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có

cytochrome đều có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzym này là một

trong những enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức theo với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng

trong chuỗi truyền điện tử, tạo H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroside (H2O2) thành H2O và O2 ngăn chặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước, 2010)

Kiểm tra các sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự với mồi xuôi và mồi ngược

So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank:

Sau khi hiệu chỉnh các sai lệch, trình tự bảo tồn (consensus) được rút ra từ hai kết quả giải trình tự đã kiểm tra các sai lệch Trình tự consensus là trình tự tương đối chính xác cho đoạn DNA khảo sát Tuy nhiên, kết quả này cần được kiểm tra một lần nữa trên các cơ sở dữ liệu nucleotide như GenBank bằng BLASTn Các sai lệch nếu có giữa trình tự trên cơ cở dữ liệu và trình tự truy vấn cần được xem xét và kiểm tra tín hiệu huỳnh quang ở các vị trí này một lần nữa để xác nhận kết quả giải trình tự Ngoài ra, việc thực hiện BLAST còn giúp kiểm tra sự nhiễm mẫu và