định danh bằng hình thái một số chủng nấm bào ngư xám thương mại được bán ở thị trường thành phố hồ chí minh

Còn tại Malaysia, số lượng loài của Pleurotus cũng khá đa dạng, được chia thành nhiều nhóm dựa trên các đặc điểm khác nhau và hình thái, gồm nhóm A là các loài có hệ sợi dimitic với các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐỊNH DANH BẰNG HÌNH THÁI MỘT SỐ CHỦNG NẤM BÀO NGƯ XÁM THƯƠNG MẠI ĐƯỢC BÁN Ở

THỊ TRƯỜNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔI TRƯỜNG

GVHD: TS HỒ BẢO THÙY QUYÊN SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH MSSV: 1553010162

Khóa: 2015 – 2019

TPHCM, ngày 13 tháng 5 năm 2019

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần để em có cơ hội học tập tốt

Lời tiếp theo em xin cảm ơn đến các thầy cô và bạn bè mà em có cơ hội tiếp xúc và học hỏi trong suốt quãng thời gian em ngồi trên ghế nhà trường, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học nói chung và các thầy cô trong chuyên ngành Nông nghiệp - Môi trường nói riêng của Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Qua sự hướng dẫn và truyền đạt tận tình của quý thầy cô em đã hoàn thành xong khóa luận tốt nghiệp của mình với đề tài: “Định danh bằng hình thái một số chủng nấm bào ngư xám thương mại được bán ở thị trường thành phố Hồ Chí Minh” Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc và chân thành của mình đến cô TS Hồ Bảo Thùy Quyên – là giảng viên khoa Công nghệ sinh học, chuyên ngành Nông nghiệp và cũng là giảng viên hướng dẫn em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp Cô đã luôn dành thời gian để đồng hành cùng em, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình để em hoàn thành tốt đề tài của mình Không những chỉ dạy những kiến thức chuyên ngành mà cô còn chia sẻ cho em những kinh nghiệm làm việc, dạy cách làm việc như thế nào cho đạt hiệu quả cao Em xin chúc cô luôn khỏe mạnh, hạnh phúc và đạt được nhiều thành công trong cuộc sống

Và nhân dịp này em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ba mẹ người đã sinh thành, nuôi nấng và dạy dỗ em nên người, đã lo lắng cho em để em có cơ hội học hỏi và tiếp xúc với cuộc sống

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và các anh chị, bạn bè những người đã hỗ trợ, luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ cho em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này

Và sau cùng, kinh phí thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này được tài trợ từ nguồn kinh phí của Đề tài Khoa học công nghệ cấp Bộ năm 2018 – Mã số B2018-MSB-09 của Bộ Giáo dục và Đào tạo

1.1 Giới thiệu về nấm Bào ngư 3

1.2 Phân bố của nấm bào ngư 4

1.3 Các khóa phân loại thường sử dụng 5

1.3.1 Khóa phân loại nấm đến cấp chi bằng các đặc điểm đại thể 5

1.3.2 Khóa phân loại dựa trên sự kết hợp các đặc điểm hiển vi của các chi Friesian với khóa phân loại của Singer 5

1.3.3 Khóa phân loại của Daniel E Stuntz 5

1.3.4 Khóa phân loại mới nhất của Largent 6

1.3.5 Khóa phân loại của Lê Bá Dũng về các loài thuộc chi Pleurotus phân bố ở Tây Nguyên 6

1.4 Phân loại một số loài thuộc chi Pleurotus dựa trên đặc điểm hình thái 7

Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland 7

Pleurotus cystidiosus O.K Mill 8

Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr 10

Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél 11

Pleurotus ostreatus (Jacq.) P Kum 13

Phân biệt Pleurotus pulmonarius và Pleurotus ostreatus 14

1.5 Phương pháp định danh nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử 15

1.5.1 Phương pháp PCR 15

1.5.2 Phương pháp PCR sequencing 15

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18

2.2 Sơ đồ thí nghiệm 18

2.3 Đối tượng nghiên cứu 18

2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 19

2.4.1 Thiết bị 19

2.4.2 Dụng cụ 19

2.4.3 Môi trường và hóa chất 20

2.5 Phương pháp nghiên cứu 20

2.5.1 Thu thập và xử lý mẫu 20

2.5.2 Phân lập và giữ giống mẫu 21

2.5.3 Phân tích hình thái và định danh nấm 21

2.5.4 Định danh các chủng vi nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử 21

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả làm thuần 25

3.2 Kết quả phân tích hình thái các mẫu nấm 25

3.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA1a 25

3.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA2b 27

3.2.3 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XBT3b 29

3.2.4 Phân tích đặc điểm hình thái nấm XLA4a 32

3.3 Định danh dựa trên vùng trình tự ITS 34

3.3.1 Kết quả BLAST 34

3.3.2 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài 37

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ITS Internal Transcribed Spacer

NCBI National Center for Biotechnology Informatic PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextro Agar MYA Malt Yeast Agar

TAE Tricacetic ethylene diamine tetra acetate TE Tris ethylene diamine tetra acetate CTAB Cetyl threemetylamomnium bromide dNTP Deoxynucleotide triphosphate

CIA Chloroform-Isoamylalcohol

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH II DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Pleurotus cornucopiae (Paulet) Roland 8

Hình 1.2 Pleurotus cystidiosus O.K Mill 10

Hình 1.3 Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr 11

Hình 1.4 Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél 12

Hình 1.5 Pleurotus ostreatus (Jacq.) P Kum 14

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 18

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự ITS 23

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA1a 26

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA2b 28

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái giống nấm XBT3b 30

Hình 3.4 Bào tử đảm XBT3b 31

Hình 3.5: Đặc điểm hình thái giống nấm XLA4a 33

Hình 3.6 Kết quả BLAST của chủng XLA1a 35

Hình 3.7 Kết quả BLAST của chủng XLA2b 35

Hình 3.8 Kết quả BLAST của chủng XBT3b 36

Hình 3.9 Kết quả BLAST của chủng XLA4a 36

Hình 3.10 Cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood (ML) của các chủng Pleurotus 38

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH III

Hình 3.11 Cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbour Joining (NJ) của các

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ trước đến nay, nấm vốn là loại thực phẩm được ưa chuộng trong những bữa ăn hàng ngày bởi những lợi ích mà nó mang lại Nấm chứa nhiều chất dinh dưỡng, protein cùng nhiều loại vitamin như vitamin B1, B2, PP,… và các axit amin thiết yếu, giúp không gây xơ cứng động mạch và không làm tăng lượng cholesterol trong máu Bên cạnh đó, nấm còn có nhiều tác dụng dược lý hỗ trợ cơ thể như: tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng ung thư và kháng virus, ngăn ngừa và trị liệu các bệnh tim mạch, hạ đường máu, chống phóng xạ, chống oxy hóa, giải độc và bảo vệ tế bào gan, an thần, rất có lợi cho việc điều chỉnh hoạt động của hệ thần kinh trung ương (Nguyễn Hữu Hỉ và cộng sự, 2015)

Thời gian qua đã có nhiều mô hình sản xuất, kinh doanh nấm có hiệu quả ở nhiều quy mô khác nhau từ quy mô hộ gia đình, trang trại, gia trại đến hợp tác xã, tổ hợp tác, doanh nghiệp sản xuất, sơ chế, chế biến, kinh doanh nấm Ở Việt Nam, ngành nuôi trồng nấm ăn đang từng bước phát triển theo hướng chuyên nghiệp, quy mô hàng hóa; gắn kết đồng bộ và ứng dụng các phương tiện kỹ thuật vào các khâu sản xuất, sơ chế, bảo quản, tiêu thụ (Nguyễn Hữu Hỉ và cộng sự, 2015) Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long là một trong những khu vực mà nghề trồng nấm đang phát triển mạnh mẽ nhờ các lợi thế về điều kiện thời tiết, nguồn nhân công dồi dào, và nguồn cơ chất trồng nấm phong phú Nhiều loài nấm ăn đã được sản xuất với sản lượng lớn đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu, trong đó có nấm bào ngư (Ngô Thị Phương Dung và cộng sự, 2011)

Trong các loại nấm ăn hiện nay, nấm Bào ngư Pleurotus là một trong những

giống nấm nuôi trồng quan trọng nhất của thế giới Các loài nấm này không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn chứa nhiều thành phần có tác dụng sinh dược học và ứng

dụng trong ngành môi trường Xét về sản lượng, nấm Pleurotus luôn nằm trong số các

loài nấm được nuôi trồng nhiều nhất trên thế giới và cũng là một trong các loài nấm nuôi trồng phổ biến tại Việt Nam (Cohen và cộng sự, 2002)

Tuy nhiên, dù được sản xuất và tiêu thụ rộng rãi, các dòng nấm bào ngư khác nhau chỉ được phân biệt đơn giản dựa vào màu sắc, mùi vị hay nơi sản xuất Các nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu tập trung về những kỹ thuật nuôi trồng, môi trường, thành phần dinh dưỡng, hoạt tính của nấm Các dòng thuần ở mức độ giống và loài chưa được xác

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 2

định nhiều Vì thế, việc nghiên cứu phân lập, định danh các loại nấm bào ngư xám góp phần cung cấp những thông tin làm cơ sở khoa học nghiên cứu giải quyết hiệu quả vấn đề trong quá trình sản xuất meo giống, đồng thời giúp nhà trồng nấm chủ động hơn trong công nghệ sản xuất meo giống (Ngô Thị Phương Dung và cộng sự, 2011)

Mục tiêu :

Định danh bằng hình thái một số chủng nấm bào ngư xám thương mại được bán ở thị trường thành phố Hồ Chí Minh

Giới hạn của đề tài

Nghiên cứu chỉ được thực hiện trên phạm vi các mẫu nấm bào ngư xám thương mại được bán ở thị trường thành phố Hồ Chí Minh

Nội dung nghiên cứu

˗ Thu thập và xử lý mẫu ˗ Phân lập và giữ giống mẫu

˗ Phân tích các đặc điểm hình thái và định danh nấm

˗ Định danh các chủng vi nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm Bào ngư

Nấm Bào ngư (nấm Sò: Oyster) rất phong phú và đa dạng, bao gồm khoảng 40

loài, cho đến nay hầu như các nhà nghiên cứu đều thống nhất chúng thuộc chi Pleurotus

(Fr.) Kummer Một số nhà nấm học coi chúng là một họ riêng Pleurotaceae Các nấm

Bào ngư Pleurotus spp có khả năng chuyển hoá các chất xơ sợi giàu cellulose và lignin

- thực chất là khả năng phân hủy các polysacchride tự nhiên để tạo nên nguồn carbon cho nấm sinh trưởng phát triển (Lê Xuân Thám, 2010) Loại nấm này có tính thích nghi rộng và có thể trồng được trên các loại phế phẩm công - nông nghiệp khác nhau như bông vải, rơm rạ, mùn cưa, thân cây gỗ, thân lõi ngô, trấu và bã mía (Lê Vĩnh Thúc, 2015) nhờ đó hầu hết các loại phụ phế liệu, các chất phế thải của nông, lâm, công nghiệp đều có thể được nấm Bào ngư sử dụng hiệu quả Đây là nguồn tài nguyên nấm quý đang được công nghệ hóa rộng rãi ở Việt Nam, góp phần phát triển nông thôn, miền núi và giải quyết các loại phụ, phế liệu công, nông, lâm nghiệp giàu chất xơ, góp phần cung cấp sinh khối có giá trị kinh tế cao, bã thải lại là nguồn phân bón sinh học sạch sinh thái Do vậy, sản lượng nấm Bào ngư nuôi trồng trên thế giới từ 1986-1991 đã tăng rất nhanh: gần 450% (1993), đến 2005 đã tăng tới hơn 3 triệu tấn Không chỉ có giá trị là thực phẩm

giàu dinh dưỡng, nấm Bào ngư còn là nguồn dược liệu có tính kháng sinh (P griseus, ) và phòng chống ung thư với polysaccharides liên kết protein tách từ Pleurotus ostreatus (Fr.) Quél., P sajor-caju (Fr.) Sing., P citrinopileatus Sing., (Lê Xuân Thám, 2010)

Với hơn 20 loài và chủng được nuôi trồng trên toàn thế, chi Pleurotus là một

trong những nhóm nấm trồng đa dạng nhất Cho đến nay, quan hệ di truyền, cũng như

việc phân loại các loài thuộc chi Pleurotus vẫn chưa được hiểu rõ và chưa thống nhất Kirk và cộng sự (2008) đã phân loại các loài thuộc chi Pleurotus thành khoảng 20 loài

Nguyên nhân khiến việc phân loại nhóm nấm này trở nên phức tạp và thường xuyên bị nhầm lẫn là do sự đa dạng trong hình thái và đặc điểm phân bố rộng khắp trên toàn thế giới của chúng Rất nhiều loài mới khi đưa vào nuôi trồng và thương mại hóa đã được

gọi bằng những tên không chính xác như loài P pulmonarius ở Ấn Độ thường bị nhầm là P sajor – caju và loài P ostreatus thường bị gọi nhầm là P florida ở châu Âu (David

và cộng sự, 2011)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 4 1.2 Phân bố của nấm bào ngư

Nấm Bào ngư rất phong phú và đa dạng, bao gồm khoảng 40 loài, cho đến nay

các nghiên cứu đều thống nhất chúng thuộc chi Pleurotus (Fr.) Kummer Ở Việt Nam cho đến nay đã ghi nhận khoảng 15 loại nấm Bào ngư: P abalonus, P cornucopiae, P

cytidiosus, P djamor, P eryngii, P floridanus, P globulifer, P limpidus, P ostreatus, P pulmonarius, P sajor-caju, P salmoneostramineus, P spicilifer, P versiformis, P blaoensis, tuy nhiên số loài lưu mẫu thực sự rất ít, không quá 9 loài Phần lớn các cơ sở

khác chỉ có 2- 3 loài mà thôi Không thấy ghi nhận loài nào có độc, hầu hết các loài

Pleurotus đều dược Singer ghi nhận là có thể ăn được; thực tế quá nửa số loài trên đã

được nuôi trồng phổ biến ở nước ta Trong đó đáng lưu ý có P abalonus được nuôi

trồng xuất khẩu, được thị trường khu vực và thế giới coi trọng (Lê Xuân Thám, 2010)

Có nhiều nghiên cứu về số lượng loài Pleurotus ở các quốc gia Theo Lê Xuân Thám có 4 loài gồm P cornucopiae var citrinopileatus, P cystidiosus P ostreatus

(=P pulmonarius) và P salmoneostramineus ở Nhật Bản Ở Mexico có 8 loài thương

mại phổ biến nhất, trong đó thì P ostreatus, P columbinus, P sajor-caju, P florida, P

pulmonarius, và P djamor là quan trọng nhất Hầu hết chúng đều có nguồn gốc từ Mỹ

và Châu Âu, ngoại trừ P djamor Nhiều công ty trồng các loài Pleurotus trong các trang

trại nhỏ, bắt đầu ở khu vực Xalapa trong những năm 1980 và dần lan rộng đến các thành

phố lớn của Mexico (Guzmán, 2000) Theo Lechner và các cộng sự (2004) đã miêu tả thì chi Pleurotus tại Argentina gồm có các loài Pleurotus albidus, Pleurotus cystidiosus,

Pleurotus djamor, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius và Pleurotus rickii

Bresadoa Còn tại Malaysia, số lượng loài của Pleurotus cũng khá đa dạng, được chia

thành nhiều nhóm dựa trên các đặc điểm khác nhau và hình thái, gồm nhóm A là các loài có hệ sợi dimitic với các tế bào dạng nhánh xương, mũ trơn hoặc có lông tơ hướng

về chân, không có bao gốc như các loài P cyatheicolus, P djamor, P lilaceilentus, P

luctuosus, P problematicus, còn nhóm B là các loài có hệ sợi monomitic như P eugrammus, P hyacinthus, P australis, P platypodus, P subviolaceus, P penangensis, P musae, P aureovillosus, , P chrysoeehizus, P decipiens, P olivascens, P japonicus

và một số loài không có mấu nối và cysistidia như P armeiacus, P alcasiae, P

spathulatus, P omnivagus, và một số nhóm khác (Corner, 1981)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 5 1.3 Các khóa phân loại thường sử dụng

1.3.1 Khóa phân loại nấm đến cấp chi bằng các đặc điểm đại thể

Theo Friesian, chi Pleurotus bao gồm các loại nấm có phần rìa phiến bằng phẳng,

thuộc nhóm pleurotoid, gồm các đặc điểm: mũ nấm có nhiều thịt, mềm dẻo, màu sắc bề mặt mũ đa dạng, cuống thường không có hoặc nếu có thường ngắn, mọc lệch hoặc biến dị, thường không có bao gốc Bào tầng dạng phiến không tách ra theo chiều dọc, không xoăn hoặc lượn sóng, phẩn rìa thường bắng phẳng, không có răng cưa, không có dạng sáp Bào tử có màu trắng đến màu hoa cà nhạt, thường mọc trên gỗ (Largent., 1977)

1.3.2 Khóa phân loại dựa trên sự kết hợp các đặc điểm hiển vi của các chi Friesian với khóa phân loại của Singer

Largent đã dựa trên những đặc điểm của các loài trong nhóm chi của Friesian và

khóa phân loại của Singer để miêu tả chi Pleurotus mang các đặc điểm gồm bề mặt mũ

thường có lông măng và chúng cũng không chứa dextrin, phần thịt mũ không có trạng thái hóa keo; phần mô của bào tầng nếu không mang hạt sẽ chuyển sang màu xanh lá cây ngã sang xanh dương khi tác dụng với KOH, các sợi nấm ở bào tầng đan xen không theo quy luật; bào tử hình trụ, không chứa tinh bột hay dextrin; không có các clamp (mấu nối); các cheilocystidia nếu có trên phần rìa mép của bào tầng thường nhỏ, mỏng manh, không dễ thấy; rìa bào tầng đều bằng phẳng (không có dạng răng cưa) khi trưởng thành; quả thể không phát sáng, mọc trên gỗ hoặc nền đất, không mọc trên các thực vật như rong rêu (Largent và Watling, 1977)

1.3.3 Khóa phân loại của Daniel E Stuntz

Trong khóa phân loại này, chi Pleurotus được miêu tả thuộc nhóm Pleurotoid với

các đặc điểm: quả thể mọc độc lập, không mọc trên các loại nấm khác, mũ nấm mềm mịn, có nhiều thịt Cuống nấm ngắn thường đính lệch một bên, bào tử có màu trắng tới màu vàng nhạt, hoặc màu kem đến màu hoa cà nhạt; các phiến có thể phân bố dày hoặc mỏng, cuộn vòng quanh, không thường xoăn hay uốn cong, lượn sóng, phần rìa phiến bằng phẳng, không có răng cưa

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 6

Về các đặc điểm hiển vi, Pleurotus có hệ sợi monomitic với vách mỏng hoặc dày,

dấu in bào tử đa dạng; cheilocystidia hình thành ở phần rìa phiến, còn pleurocystidia có thể có hoặc không nhưng không bao giờ có dạng metuloid (Largent và Watling, 1977)

1.3.4 Khóa phân loại mới nhất của Largent

Chi Pleurotus được xếp trong họ Tricholomataceae được phân biệt với các chi

khác qua các đặc điểm: basidia không có các cấu trúc hạt chứa sắt; bào tử có sắc tố xanh hoặc không; bào tử đảm (basidiospores) không có tinh bột hoặc dextrin; bào tử có màu trắng, kem hoặc vàng nhạt; cuống thường mọc lệch tâm hoặc không có, hình trụ hoặc gần hình trụ; bào tầng dạng phiến mỏng, rìa phiến trơn, bằng phẳng, bào tầng phát triển tốt; quả thể không mọc trên rêu, mũ nấm lớn và có nhiều màu sắc

Đặc điểm riêng của chi được miêu tả gồm quả thể hầu như có kích thước từ vừa đến lớn, đường kính trung bình của mũ khoảng từ 2- 5cm Bề mặt mũ thường trơn, không có lông, nếu có thường có lông măng, màu sắc mũ đa dạng như trắng, xám, nâu, vàng đất, xanh dương, hiếm khi có xanh lá Bào tầng thường có màu trắng hoặc kem nhạt, rìa phiến thường bằng phẳng và chạy dọc về phía cuống Bào tử thường gồm các màu trắng, kem hoặc xám tím Cuống thường ngắn, đính lệch tâm, hiếm khi không có cuống, một số loài có vòng bao chân Môi trường sống chủ yếu là gỗ, một số hiếm mọc trên nền đất và thường xuất hiện ở những nơi mà thực vật bị chôn vùi Bào tử có dạng hình trụ hoặc gần hình trụ, trơn, không chứa tinh bột; hệ sợi nấm phân bố không theo quy luật với vách có độ dày mỏng khác nhau (Largent và Baroi, 1988)

1.3.5 Khóa phân loại của Lê Bá Dũng về các loài thuộc chi Pleurotus phân bố ở

Tây Nguyên

Trong khóa này, chi Pleurotus được miêu tả gồm các đặc điểm như mũ nấm chất

thịt, ít khi chất bì dai hay chất màng, cuống nấm chất thịt lệch, ở bên hoặc không có, gắn liền với tổ chức của mũ nấm Phiến nấm lõm, mọc thẳng, mọc dài hoặc do phát triển từ giữa mà ra Bào tử không màu, ít khi có màu hồng nhạt hay tím nhạt, hình chữ nhật dài đến hình hạt đậu, không có thể hình cầu (Lê Bá Dũng, 2003)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 7

1.4 Phân loại một số loài thuộc chi Pleurotus dựa trên đặc điểm hình thái Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland

Đồng danh: Pleurotus cornucopiae var cornucopiae (Paulet) Rolland 1910,

Pleurotus cornucopiae subsp cornucopiae (Paulet) Rolland 1910, Pleurotus ostreatus var cornucopiae (Paulet) Pilát 1935, Pleurotus ostreatus f cornucopiae (Paulet) Quél

1886, Pleurotus sapidus Sacc 1887 (Roskov và cộng sự, 2016)

Mũ nấm rộng 40 – 150 (– 300) mm, lồi lên khi tai nấm còn non, sau đó tai nấm sẽ hạ xuống và lõm ở trung tâm, rìa mép tai nấm thẳng hoặc cong vào, tai nấm dày, có màu nâu xám nhạt đến màu vàng kem hơi nâu, bề mặt mũ trơn láng, tuy nhiên ở giữa tai nấm có một ít cụm lông tơ, đôi khi rìa mép tai nấm cũng có một ít lông tơ Các phiến nấm nằm sát khít nhau, chạy từ rìa mép mũ nấm đến gần chân cuống nấm, tạo thành những rãnh liên kết nhau như mạng lưới bao phủ gần hết cuống nấm Phiến khá mỏng, chiều rộng ≤ 10 mm, có màu xanh xám đến màu màu đất son; rìa mép phiến khá nguyên vẹn và cùng màu với phiến hoặc có màu hơi nâu hơn Cuống nấm có kích thước 30 – 110 x 10 – 20 mm, đính gần tâm hoặc đính lệch Các cuống liên kết với nhau thành chùm Cuống có hình trụ, đôi khi thon dần về phía chân cuống, thể chất rắn chắc, có màu kem hơi trắng hoặc màu kem isabella và chuyển dần thành nâu be khi gần đến chân cuống, đôi khi có màu hoa cà nhạt Cuống nấm được bao phủ bởi các rãnh tạo ra bởi các phiến chạy từ mũ xuống, giống như mạng lưới và có nhiều lông tơ ở phía cuối chân cuống nấm Thịt nấm màu trắng ở mũ và cuống, có màu nâu trong ở dưới bề mặt và gần phiến nấm Nấm có mùi tiểu hồi và ngọt Vị nấm chua hoặc nhạt như vị của bột Dấu ấn bào tử có màu hơi trắng đến màu hoa cà (Bas và cộng sự,1990) Bào tử có kích thước 7 – 10,5 x 3,5 – 5 µm; Q = 1,7– 2,4; Q trung bình = 1,9 – 2,0, hình thuôn đến hình trụ Đảm hình chùy, kích thước 30 – 45 x 5 – 7 µm, có 4 bào tử đảm Không có liệt bào, nhưng có những tế bào basidiole (những đảm không thể trưởng thành, không có khả năng sinh bào tử, chúng không có cấu trúc cuống bào tử đính trên đầu (Kirk và cộng sự, 2008) có hình am - pun, kích thước 20 – 35 x 5 – 7 µm Các sợi nấm ở thể nền bào tầng đan xen không theo quy luật; hệ sợi nấm có dạng mono- hoặc dimitic; sợi nấm nguyên thủy rộng (3 –) 5 – 13 µm, vách mỏng đến dày; thỉnh thoảng xuất hiện các sợi khung xương rộng 3 µm, vách dày Lớp cận bào tầng dày từ 20 – 30 µm Các sợi nấm của lớp

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 8

bì mũ nấm sắp xếp song song với thể nền, dày 50 – 120 µm, cấu tạo bởi các sợi nấm vách mỏng, rộng 3 – 7 µm Phần trên của cuống nấm bao phủ bởi những nhân tố có dạng bình cổ thót, 2 – 30 x 7 – 9 µm Thể nền mũ nấm dạng monomitic đến dimitic (Bas và cộng sự, 1990)

P cornucopiae có những đặc điểm rất đặc trưng như: phiến nấm kéo dài từ mũ

nấm xuống đến chân cuống nấm, tại cuống các phiến nấm tạo thành các gờ nối với nhau giống như mạng lưới; mũ nấm có màu xám nhạt, mùi giống với tiểu hồi, bào tử ngắn và rộng và thể nền đôi khi có dạng dimitic (Bas và cộng sự, 1990)

Hình 1.1 Pleurotus cornucopiae (Paulet) Roland (Bas và cộng sự, 1990; BioImages:

The Virtual Field- Guide (UK))

Pleurotus cystidiosus O.K Mill

Đồng danh: Pleurotus abalonus Y.H Han, K.M Chen & S Cheng 1974,

Pleurotus cystidiosus subsp abalonus (Y.H Han, K.M Chen & S Cheng) O Hilber ex

O Hilber 1997, Pleurotus cystidiosus subsp abalonus (Y.H Han, K.M Chen & S Cheng) O Hilber 1993, Pleurotus cystidiosus var cystidiosus O.K Mill 1969, Pleurotus

cystidiosus var formosensis Moncalvo 1995, Stilbum macrocarpum Ellis & Everh 1886, Pleurotus cystidiosus subsp cystidiosus O.K Mill 1969 (Roskov và cộng sự, 2016)

Tai nấm mọc theo kiểu đơn lẻ hoặc nhiều tai mọc xếp chồng nhau Mũ nấm kích thước 13 – 17 x 8,5 – 9,5 cm, có hình quạt, bề mặt màu nâu đến nâu xám với nhiều vảy nhỏ màu nâu đen hình thành khi bề mặt bị nứt, càng về phía rìa mép thì càng nhiều vảy; rìa mép tai nấm nguyên vẹn, cứng, uốn vào trong Cuống nấm màu nâu đến xám, hầu như đính lệch 1 bên; kích thước 3,6 – 5 x 2,2 – 3,5 cm; thon dần về phía chân cuống Thịt nấm chắc, màu trắng khi tươi, cứng và dai khi khô Phiến nấm màu trắng khi tươi và màu vàng khi khô, rộng 4 – 10 mm, mỏng dần về phía cuống; phiến chạy từ mũ nấm đến phần đầu cuống nấm (Lechner và cộng sự, 2004)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 9

Bào tử trong suốt, có dạng từ hình trụ - que, vách mỏng, bề mặt trơn láng, kích thước (11 –) 12 – 16 (– 18) x 4 – 6 µm, Q = 3,01 Đảm có từ 2 – 4 bào tử đính, kích thước 37 – 44 x 5,2 – 9 µm Lớp cận bào tầng hẹp, không dễ thấy, dày khoảng 5 µm Không có cheilocystidia (liệt bào ở đỉnh bào tầng) Pleurocystidia (liệt bào ở mặt bên của bào tầng) có dạng chùy, kích thước 50 x 7 – 7,8 µm Các sợi nấm của lớp bì của mũ nấm sắp xếp song song với thể nền, dày 80 - 100µm, các sợi nấm có mấu nối, màu nâu, phân nhánh nhỏ, đường kính 3 – 5 µm; một số sợi nấm trong số đó có vách dày, màu nâu và có hình dáng giống cystidia, đường kính 3,6 – 5,2 µm Hệ sợi ở mũ nấm có dạng monomitic, các sợi nấm có mấu nối, vách mỏng, trong suốt, đường kính 3,8 – 9,4 µm Hệ sợi ở cuống nấm cũng có dạng monomitic; với những tế bào tận cùng có dạng liệt bào, kích thước 3,9 – 4,7 x 3,6 – 6 µm, vách dày, đường kính từ 3 – 7,8 µm Thể nền của bào tầng cấu tạo bởi các sợi nấm nguyên thủy, vách mỏng, có mấu nối, có đường kính 5,2 – 10 µm và các sợi vách dày đường kính 3,6 – 4,2 µm (Lechner và cộng sự, 2004)

Bào tử vô tính: ban đầu khi nuôi cấy sợi nấm P cystidiosus trên môi trường thạch

thì sợi nấm có màu trắng, mịn và có những dạng sợi khí khổng, giống với các loài

Pleurotus khác Tuy nhiên, khi sợi nấm bắt đầu mọc nhanh hơn thì bắt đầu xuất hiện

ngày càng nhiều các bó cuống bào tử màu đen rất đặc trưng, phần đầu có dạng hình cầu mang chất lỏng màu đen chứa các bào tử vô tính, đường kính phần đầu 0,4 – 0,9 µm, phần chân dài 0,6 – 1,25 µm, rộng 0,1 – 0,2 µm Bó cuống bào tử này hình thành từ các sợi nấm có mấu nối vách mỏng, các tế bào của sợi nấm này thay đổi dần hình dạng khi tiến ra phía ngoài, đến tế bào ngoài cùng thì tế bào có dạng bào tử đính hình trụ, màu đen bóng, kích thước 5,2 – 6,2 x 14,5 – 17 mm (Lechner và cộng sự, 2004)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 10

Hình 1.2 Pleurotus cystidiosus O.K Mill ( Lechner và cộng sự, 2004;

Stamets P 2000)

(E) –Bó cuống bào tử; (F) – Hình thái sợi nấm Pleurotus cystidiosus khi nuôi cấy

Thước tỉ lệ 1 = 30 µm cho hình B và D, thước tỉ lệ 2 = 10 cm cho hình A

Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr

Đồng danh: Lentinus sajor- caju (Fr.) Singer 1951 (Index Fungorum)

Mũ nấm rộng 3 – 11 cm; dạng hình quạt hoặc dạng hình phễu; thể chất dai – mềm khi còn non, trở nên dai hơn khi trưởng thành; có màu màu trắng, trắng xám, màu nâu vàng xám đến nâu xám; bề mặt trơn láng hoặc có lông măng, đôi khi có những vảy nhỏ màu nâu, thường có đường rãnh đồng tâm mờ; rìa mép mũ nấm cong vào đến duỗi thẳng, thường gợn sóng và xé rách khi tai nấm già Thịt nấm màu trắng; mỏng, độ dày từ 4 – 8 mm, càng gần cuống thì càng dày hơn Các phiến chính kéo dài từ mũ nấm đến phần đầu cuống nấm; chiều rộng phiến 0,5 – 3 mm; có màu trắng đến màu vàng, chuyển thành màu nâu vàng nhạt khi tai nấm già; rìa mép phiến nguyên vẹn đến có răng cưa Cuống nấm có thể đính ở giữa hoặc đính lệch tâm hoặc đính ở bên mũ nấm, kích thước (dài x rộng) 0,2 – 2,5 x 0,6 – 1,2 cm; màu trắng hoặc cùng màu với mũ nấm Tai nấm có vòng cổ, khi còn non vòng cổ chắc và rất chuyên biệt, khi già vòng cổ chuyển thành dạng mấu nhú hoặc gần như biến mất, tai nấm màu trắng đến màu nâu vàng nhạt Hệ sợi nấm dạng dimitic; sợi nguyên thủy có chiều rộng 4 – 5 µm, trong suốt; sợi khung

xương liên kết có vách dày, rộng 3 – 7 µm, trong suốt và phân nhánh Pleurocystidia

không có hoặc hiếm khi xuất hiện, nếu có thì dạng hình chùy, kích thước 30 – 40 x 7 –

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 11

9 µm, trong suốt Cheilocystidia có dạng gần như hình chùy, kích thước 15 – 25 x 4 – 7 µm, trong suốt Đảm có dạng hình chùy, trong suốt, kích thước 15 – 20 x 4 – 4,5 µm; mỗi đảm đính 4 bào tử Bào tử có dạng hình trụ dài, hẹp, kích thước 6 – 8 x 1,8 – 2,2 µm; bề mặt láng, trong suốt; không có phản ứng tinh bột (không chuyển thành màu xanh đậm khi tiếp xúc với thuốc thử Melzer) Thể nền bào tầng đan xen không theo quy luật Bề mặt mũ nấm có các chùm sợi nấm nhô cao lên (Bi và cộng sự, 1993)

Hình 1.3 Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr (Pegler, 1983)

(A) – Tai nấm, độ phóng đại 1 lần, (B) – Bào tử, (C) – Đảm, (D) – Cheilocystidia, (E) – Chùm sợi bên (hyphal peg), (F) – Sợi nguyên thủy, độ phóng đại 500 lần, (G) – Sợi khung xương - liên kết (skeleto – ligative hyphae), độ phóng đại 500 lần Tất cả hình không có ghi chú đều có độ phóng đại 1000 lần

Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél

Đồng danh: Pleurotus araucariicola Singer 1954, Pleurotus ostreatus var

pulmonarius (Fr.) Iordanov, Vanev & Fakirova 1979, Pleurotus ostreatus f pulmonarius (Fr.) Pilát 1933, Pleurotus pulmonarius var juglandis (Fr.) Sacc 1887, Pleurotus pulmonarius var lapponicus E Ludw 2001, Pleurotus pulmonarius var pulmonarius (Fr.) Quél 1987 (Roskov và cộng sự, 2016)

Mũ nấm có hình quạt hoặc hơi tròn, khi non có dạng lồi, rìa mép uốn cong vào, sau đó chuyển thành dạng phẳng đến dạng phễu; độ dày tai nấm từ mỏng đến trung

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 12

bình; có màu xám nâu nhạt đến trắng hơi vàng; kích thước (dài x rộng) (15) 30 – 100 x (20 –) 50 – 100 mm; bề mặt trơn láng hoặc phủ ít lông tơ, hiếm khi có vảy, thường có lông tơ ở gần vị trí liên kết với cuống Phiến nấm dạng dày đặc, kéo dài từ rìa mũ nấm đến phần đỉnh cuống nấm; khá mỏng, rộng ≤ 5 mm; có màu trắng đến màu kem; rìa mép nguyên vẹn hoặc có một phần răng cưa, cả phiến cùng một màu hoặc rìa mép có màu hơi nâu hơn một chút Không có cuống nấm hoặc có cuống ngắn; kích thước 10 x 2 – 10 mm; đính gần giữa đến đính lệch 1 bên; thể chất rắn chắc; có màu hơi trắng; thường có lông tơ Thịt nấm màu trắng Mùi ngọt đặc trưng hoặc giống với tiểu hồi hoặc mùi nhẹ đến mùi nấm Vị đặc trưng của nấm đến hơi đắng Dấu ấn bào tử có màu hơi trắng đến màu kem, hơi vàng hoặc màu nâu vàng nhạt (Bas và cộng sự, 1990)

Bào tử có hình trụ đến hình que; kích thước 8 – 11 (– 12,5) x 3 – 4,5 µm, Q = 2,1 – 3,5, Q trung bình = 2,3 – 2,7 Đảm có kích thước 20 – 30 x 5 – 8 µm, đính 2 hoặc 4 bào tử Không có liệt bào, nhưng đôi khi xuất hiện những basidiole có hình am - pun có nhánh hoặc không có nhánh Thể nền của bào tầng dạng monomitic, đan xen không theo quy luật; chiều rộng sợi nấm 4 – 12 µm; vách sợi mỏng đến dày trung bình; lớp cận bào tầng dày ≤ 20 µm Các sợi nấm của lớp bì mũ nấm sắp xếp song song với thể nền; dày 40 – 50 µm; cấu tạo bởi các sợi nấm vách mỏng Thể nền mũ nấm dạng monomitic, các sợi nấm đan xen không theo quy luật; đường kính 5 – 15 µm và vách khá dày (Bas và cộng sự, 1990)

Hình 1.4 Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél (Bas và cộng sự, 1990)

(A) – Quả thể, (B) – Bào tử đảm

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 13

Pleurotus ostreatus (Jacq.) P Kum

Đồng danh: Agaricus fuligineus Pers 1801, Agaricus glandulosus Bull 1789,

Agaricus macropus (Bagl) Bagl 1886, Agaricus ochraceus Pers 1801, Agaricus ostreatus Jacq 1774, Agaricus reticulatus Schumach 1803, Agaricus revolutus J Kickx

f 1867, Agaricus salignus Pers 1801, Clitocybe ostreata (Jacq.) P Karst 1879,

Crepidopus ostreatus (Jacq.) Gray 1821, Dendrosarcus glanduosus (Bull.) Kuntze

1898, Dendrosarcus ostreatus (Jacq.) Kuntze 1898, Panus carpathuicus Fr Ex Kalchbr 1867, Pleurotus glandulosus (Bull.) Gillet 1878, Pleurotus revolutus (J Kickx f.) Gillet 1878, Pleurotus salignus (Pers.) P Kumm 1871, Pleurotus suberis Pat 1894 (Spicies

Fungorum)

Mũ nấm có hình quạt hoặc khá tròn ở cả 3 phía, khi non có dạng lồi, khi già chuyển thành dạng lượn sóng; kích thước 60 – 120 mm dài x 100 – 160 mm rộng; thịt nấm từ mỏng đến khá dày; rìa mép uốn cong vào lúc còn non; màu xám nâu sẫm hoặc vàng xám – nâu hoặc xám xanh, khi khô thì có màu xám nhạt; bề mặt hơi dính; ở tâm mũ nấm thường có một ít lông tơ, đôi khi có lằn gợn tỏa tròn hoặc vảy tỏa tròn hướng về phía rìa mép Phiến chính có chiều dài 35 – 50 mm; phiến phụ có chiều dài 7 –15 mm; sắp xếp dạng dày đặc, chạy từ từ mũ nấm xuống cuống nấm Phiến khá mỏng; rộng ≤ 8 mm; khi non có màu nâu đỏ nhạt (màu đất son) đến màu kem cao lanh, khi già có màu xám xanh Rìa phiến cùng màu với phiến Không có cuống hoặc nếu có thì cuống ngắn, hiếm khi cuống dài; kích thước cuống 100 x 40 mm, đính lệch tâm hay đính ở bên; thể chất rắn chắc; có màu trắng; bề mặt cuống có những khía dọc, thường xuyên bao phủ bởi lông măng Thịt nấm màu trắng, đôi khi phần thịt nấm bên dưới bề mặt mũ nấm và phần thịt gần phiến có màu nâu đỏ nhạt Mùi nấm nhẹ, vị se Dấu ấn bào tử màu trắng, xám xanh, xám tím nhạt hoặc màu vàng xám oliu nhạt (Bas và cộng sự, 1990)

Bào tử kích thước (7 –) 8 – 12,5 x (2 –) 3 – 4,5 (– 5,5) µm, Q = (2 –) 2,3 – 3,4 (4,2), Q trung bình = 2,5 – 2,7; hình trụ đến hình que Đảm kích thước 30 – 40 x 4 – 6 µm, hình chùy, có 2 hoặc 4 bào tử Không có liệt bào, nhưng có những basidiole có hình am - pun, kích thước 20 – 30 x 3 – 7 µm Thể nền bào tầng có dạng monomitic, đan xen không đều đặn, rộng 4 – 9 µm, vách mỏng đến dày trung bình, lớp cận bào tầng

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 14

dày đến 30 µm Lớp bì của mũ nấm cấu tạo bởi các sợi nấm đan xen song song với thể nền, dày 40 – 180 µm Thể nền mũ nấm dạng monomitic, các sợi nấm đan xen không theo quy luật, đường kính sợi 5 – 10 µm, vách khá dày (Bas và cộng sự, 1990)

Hình 1.5 Pleurotus ostreatus (Jacq.) P Kum (Bas và cộng sự, 1990)

(A)– Quả thể, (B) – Bào tử, (C) – Basidiole

Phân biệt Pleurotus pulmonarius và Pleurotus ostreatus

P pulmonarius thường xuyên bị gọi nhầm tên, vì hình thái của nó rất giống với

loài P ostreatus Những điểm khác biệt quan trọng nhất giữa 2 loài nấm này được nhận

thấy khi so sánh giữa các bộ sưu tập của Châu Âu và các bộ sưu tập của Nhật Bản Các đặc điểm này được Buchanan mô tả như sau (Buchanan, 1993):

• P pulmonarius có mũ nấm màu xám nhạt, kích thước nhỏ (mũ bên kích thước

< 10 – 13 cm), cuống nấm thường đính ở giữa hơn là đính ở bên, quả thể hình thành vào cuối mùa xuân đến đầu mùa thu, vị ngọt, mùi như tiểu hồi, trong môi trường ẩm mặt trên của mũ nấm láng, lớp bì bề mặt mũ nấm mỏng hơn (từ 40 – 50 µm) và có các sợi nấm vách dày

• P ostreatus có mũ nấm màu xám nâu đậm, kích thước lớn (mũ bên luôn có kích

thước từ 12 – 18 cm), cuống nấm đính ở bên hơn là đính ở giữa, quả thể hình thành vào mùa thu cho đến đầu xuân, mùi đặc trưng của nấm, trong môi trường ẩm mặt trên của mũ nấm hình thành lớp lông tơ, lớp da bề mặt mũ nấm dày hơn (dày từ 90 – 120 µm), không có những sợi nấm vách dày

Pleurotus pulmonarius và Pleurotus ostreatus còn được phân biệt bởi màu sắc

mũ và thời tiết chúng phát triển quả thể P pulmonarius có mũ màu trắng tới nâu sáng,

phát triển vào mùa đông còn P ostreatus có màu kem tới màu nâu tối và phát triển vào mùa xuân và hạ (Guzmán, 2000)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 15 1.5 Phương pháp định danh nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

1.5.1 Phương pháp PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm có tính dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Enzyme này xúc tác tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn khi có một đoạn mồi đã bắt sẵn trên khuôn Phương pháp này được được phát minh bởi nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis năm 1985 với mục đích thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự DNA ban đầu

Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm 3 bước:

 Bước 1: Biến tính DNA mạch đôi thành mạch đơn Bước 2: Bắt cặp giữa mồi và trình tự đích mạch đơn Bước 3: Kéo dài để tạo thành mạch mới từ mồi

Mỗi chu kỳ được lặp lại nhiều lần, tuy nhiên không nên vượt quá 40, để từ đó sản phẩm PCR tăng theo lũy thừa (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)

1.5.2 Phương pháp PCR sequencing

1.5.2.1 Phương pháp Sanger

Năm 1977, Frederick Sanger và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp giải trình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’-OH dùng để liên kết với nucleotide kế tiếp (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)

Quy trình của phương pháp Sanger gồm 2 bước như sau:

Bước 1: Thiết lập 4 phản ứng với 4 loại ddNTP Các phản ứng này có chung thành phần DNA bản mẫu mạch đơn, mồi, DNA Polymerase, [α-32P]ATP và chứa lần lượt các hỗn hợp nucleotide như sau:

 Phản ứng có ddT: dGTP,dCTP, dATP, ddTTP Phản ứng có ddA: dGTP, dCTP, dTTP, ddATP Phản ứng có ddG: dATP, ddGTP, dCTP, dTTP Phản ứng có ddC: dGTP, dATP, ddCTP, dTTP

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 16

Trong mỗi phản ứng, mạch đơn DNA được tổng hợp dựa trên DNA bản mẫu, khi một ddNTP được gắn vào đầu 3’ của mạch thì quá trình tổng hợp của một mạch sẽ bị ngừng lại Kết quả là nhiều DNA mạch đơn được tổng hợp với nhiều độ dài khác nhau khi phản ứng kết thúc, mỗi mạch đều kết thúc bằng cùng một loại ddNTP tương ứng từng phản ứng Các mạch đơn với độ dài khác nhau này sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide để từ đó xác định trình tự của đoạn DNA

Bước 2: Điện di trên gel polyacrylamide, chụp hình gel bằng phóng xạ tự chụp trên phim X-ray và đọc kết quả Lưu ý: trình tự đọc được trên gel là trình tự bổ sung với trình tự của mạch DNA bản mẫu

1.5.2.2 Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến

Máy giải trình tự tự động ngày nay hoạt động dựa trên những cải tiến của phương pháp Sanger Trong đó, phản ứng giải trình tự với bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang được thực hiện trong cùng một microtube và được nạp vào máy giải trình tự sau khi DNA mẫu đã được tinh sạch Máy giải trình tự sẽ tự động nạp đầy gel và nạp mẫu DNA vào một đầu của vi ống, các đoạn DNA sẽ được phân tách trong gel nhờ một hiệu điện thế lên vi ống và di chuyển về đầu còn lại của vi ống Ở cuối ống có một cửa sổ quang học cho phép đầu đọc bằng tia laser ghi nhận từng vạch DNA di chuyển qua với màu huỳnh quang tương ứng Tín hiệu này sẽ được máy tính chuyển thành sắc ký đồ (chromatograph) và trình tự tương ứng (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)

Quy trình giải trình tự DNA bằng máy tự động như sau:

 Bước 1: Chuẩn bị DNA bản mẫu

 Bước 2: Thiết lập phản ứng giải trình tự Bước 3: Tinh sạch DNA

 Bước 4: Nạp mẫu và giải trình tự

Các phương pháp định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có kiến thức chuyên môn, trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 17

1.6 Các nghiên cứu liên quan đến các loài thuộc chi Pleurotus ở Việt Nam

Các nghiên cứu về chi Pleurotus trong nước phần lớn là các nghiên cứu về kỹ

thuật nuôi trồng, một số ít các nghiên cứu là về phân loại và khảo sát giá trị dinh dưỡng, cũng như tác dụng dược học của một số loài trong chi nấm này Trong khi đó, các nghiên

cứu về lai tạo hay di truyền của chi Pleurotus thì hầu như không tìm thấy

Các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi trồng nấm Pleurotus thường tập trung vào

phương pháp sản xuất meo giống (khảo sát các loại cơ chất nhân giống, nhiệt độ ủ tơ), phương pháp nuôi trồng (khảo sát các loại cơ chất trồng, sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng, vitamin, kim loại lên sự phát triển hệ sợi nấm …) (Lê Bá Dũng, 1999; Lê Vĩnh Phúc và cộng sự, 2015; Ngụy Thị Mai Thảo và cộng sự, 2014)

Một số loài Pleurotus bản địa được phát hiện và định danh bởi các nhà phân loại học Việt Nam Ví dụ như nhóm tác giả Lê Xuân Thám phát hiện loài Pleurotus

cystidiosus var blaoensis ở Bảo Lộc, Lâm Đồng hay các loài Pleurotus sajor-caju, P florida, P pulmonarius ở Cát Tiên, Đồng Nai … (Lê Xuân Thám, 2010), tác giả Trịnh

Tam Kiệt thì mô tả các loài P ostreatus, P pulmonarius … (Trịnh Tam Kiệt, 2011)

SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 18 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

˗ Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phía Nam, Viện Nấm học và Công nghệ sinh học – Liên hiệp các Hội Khoa học kỹ thuật Việt Nam ˗ Thời gian thực hiện: 09/2018 – 05/2019

2.2 Sơ đồ thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

2.3 Đối tượng nghiên cứu

4 mẫu nấm Bào ngư xám thương mại thu thập từ các trại trồng ở Long An và Bến Tre Các mẫu nấm này được bán ở thị trường Thành phố Hồ Chí Minh

Thu thập các giống nấm Bào ngư xám

Xử lý, phân lập, sấy khô

Phân tích đặc điểm hình thái

So sánh với các mô tả định danh

Phân loại các giống nấm

Tách chiết DNA

Khuếch đại trình tự ITS

Giải trình tự ITS

BLAST trình tự với dữ liệu của NCBI

Xây dựng cây phát sinh loài