chẩn đoán nhanh virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật real time rt pcr trên vùng gene sh

Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được áp dụng bởi một số tác giả như Kazue Uchida và cộng sự 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

CHẨN ĐOÁN NHANH VIRUS MUMPS GÂY

BỆNH QUAI BỊ BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME

RT-PCR TRÊN VÙNG GENE SH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: ThS Nguyễn Thụy Dạ Thảo SVTH: Nguyễn Thảo Trang

MSSV: 1253010410 Khóa: 2012-2016

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Qua 4 năm học tập và rèn luyện tại trường đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, được sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô khoa công nghệ sinh học đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu về lý thuyết và thực tiễn trong suốt thời gian học ở trường Nhờ sự may mắn em đã được chọn và được thực tập tại Công ty cổ phần công nghệ Việt Á, đó cũng là cơ hội giúp em áp dụng những kiến thức đã học ở trường vào thực tế, đồng thời còn học hỏi được nhiều kinh nghiệm thực tế ở đây Cùng với sự nổ lực của bản thân và với sự giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác đã góp phần giúp em hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp này Từ những kết quả đạt được này, em xin chân thành cảm ơn:

- Giáo viên hướng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Thụy Dạ Thảo đã tận tình hướng dẫn và góp ý kiến quý báu giúp em hoàn thành tốt đề tài báo cáo khóa luận này

- Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ nhân viên của công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã tạo điều kiện cho em thực tập và làm việc trong thời gian vừa qua Đặc biệt là các anh chị phòng RD công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực tập, cung cấp thông tin tài liệu để em hoàn thành tốt đề tài này

- Các thầy cô khoa công nghệ sinh học trường đại học Mở TP HCM đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức vô giá trong suốt quá trình học tập tại trường

- Ba mẹ, người đã sinh ra và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con được học tập tốt Do kiến thức còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu sót trong cách hiểu, lỗi trình bày Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và ban lãnh đạo, các anh chị trong công ty để báo cáo tốt nghiệp này đạt được kết quả tốt hơn

MỤC LỤC

PHẦN I TỔNG QUAN 12

1.1 Sơ lược về bệnh quai bị 13

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 13

1.1.2 Dịch tễ học 13

1.1.3 Tình hình quai bị ở Việt Nam 13

1.1.4 Triệu chứng của quai bị 14

1.1.5 Biến chứng của quai bị 14

1.1.6 Phòng và điều trị 15

1.1.7 Phát hiện bệnh 15

1.1.8 Các công trình nghiên cứu trước 16

1.2 Sơ lược về virus Mumps gây bệnh quai bị 17

1.2.1 Mumps virus (MuV) 17

1.3 Gene SH-gene mục tiêu 20

1.4 Tổng quan về Real-time RT-PCR 21

1.4.1 RT PCR 21

1.4.2 Real-time PCR 23

1.4.4 Đường chuẩn của Real-time PCR 28

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.3.4 Phương pháp tách chiết RNA 35

2.3.8 Phương pháp kiểm tra khả năng hoạt động của bộ mồi 37

2.3.9 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu của mồi 38

2.3.10 Phương pháp kiểm tra khả năng hoạt động của mẫu dò 38

2.3.11 Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của quy trình 38

2.3.12 Phương pháp xác định độ nhạy của quy trình 38

2.3.13 Khảo sát độ đặc hiệu của bộ mồi và mẫu dò 38

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico 41

3.1.1 Thu thập dữ liệu 41

3.1.2 Kết quả khảo sát in silico 42

3.2 Kết quả khảo sát bộ mồi mẫu dò trên thực nghiệm 53

3.2.1 Kết quả khảo sát sự hoạt động của bộ mồi 53

3.2.3 Kết quả khảo sát sự hoạt động của mẫu dò 55

3.2.4 Kết quả giải trình tự 56

3.2.5 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mẫu dò 58

3.2.6 Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 59

3.2.7 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò 59

3.3 Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm lâm sàn 62

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Cặp mồi, mẫu dò được công bố của Boddicker J và cộng sự (2007) 31

Bảng 2.2: Trình tự của cặp mồi và mẫu dò mới đã được chỉnh sửa và thiết kế mới 32Bảng 3.1: Thống kê các gene mục tiêu thu tập được trên ngân hàng dữ liệu gene 41

Bảng 3.2: Các trình tự gene SH thu nhận trên ngân hàng gene 41

Bảng 3.3: Một số cặp mồi, mẫu dò thu nhận được 42

Bảng 3.4: Các thông số vật lý của cặp mồi, mẫu dò được công bố của Boddicker J và cộng sự (2007) 44

Bảng 3.5: Trình tự của cặp mồi và mẫu dò mới đã được chỉnh sửa và thiết kế mới: 46

Bảng 3.6: Các thông số vật lý của cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 48

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi 55

Bảng 3.8: Trình tự sản phẩm Realtime-PCR 57

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát nhiệt độ của mẫu dò 58

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 59

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi và mẫu dò của từng loại virus 61

Bảng 3.12: Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 63

Hình 3.5: Kết quả bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R1 49

Hình 3.6: Kết quả bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò P1 49

Hình 3.7: Kết quả BLAST mồi xuôi F1 50

Hình 3.8: Kết quả BLAST mồi ngược R1 51

Hình 3.9: Kết quả BLAST mẫu dò P1 52

Hình 3.10: Kết quả annhyb của cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 53

Hình 3.11: Kết quả điện di khảo sát hoạt động của mồi 54

Hình 3.12: Kết quả diện di khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi 55

Hình 3.13: Thí nghiệm Realtime PCR kiểm tra hoạt động của mẫu dò 56

Hình 3.14: Kết quả giải trình tự sản phẩm Realtime-PCR 56

Hình 3.16 : Kết quả BLAST sản phẩm giải trình tự 57

Hình 3.17: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 55o C được đánh dấu màu FAM 58

Hình 3.18: Đồ thị khảo sát độ nhạy của quy trình 59

Hình 3.20: Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò của virus mumps được đánh dấu màu FAM 60

Hình 3.20: Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò của từng loại virus được đánh dấu màu FAM 61

Hình 3.21: Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm 62

Hình 4.1: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 56o C được đánh dấu màu FAM (Ct=23.89) 73

Hình 4.2: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 57o C được đánh dấu màu FAM (Ct=24.55) 73Hình 4.3: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 58o C được đánh dấu màu FAM (Ct=25.57) 74Hình 4.4: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 59o C được đánh dấu màu FAM (Ct=25.77) 74Hình 4.5: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 60o C được đánh dấu màu FAM (Ct=26.66) 75

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

H.pylori Helicobacter pylori

NCBI The National Center for Biotechnology Information

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo (WHO) Bệnh quai bị là một bệnh lây nhiễm do virus xảy ra ở người, ảnh hưởng chủ yếu đến các tuyến nước bọt Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em từ 5-9 tuổi, cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn và gây nên các biến chứng nguy hiểm

Mặc dù tỷ lệ tử vong do bệnh rất thấp (1,6 đến 3,8 trên 10000 trường hợp nhiễm bệnh) [28] nhưng quai bị có thể dẫn đến những biến chứng nguy hiểm như: viêm não - màng não, viêm tinh hoàn, viêm buồng trứng ở em gái dậy thì, và một số di chứng thần kinh vĩnh viễn [43], [44]

Hiện nay, chưa có một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh quai bị [26], [31] chỉ có thể phòng bệnh bằng vắc xin hoặc phòng bệnh quai bị thụ động với globulin miễn dịch, dùng cho người tiếp xúc với virus quai bị mà chưa được tiêm vắc xin trước đó Có thể chuẩn đoán bệnh bằng cách thực hiện một số xét nghiệm như: Phân lập virus từ máu dịch họng, dịch tiết từ ống Stenon, nước tiểu hay dịch não tủy Các phản ứng huyết thanh học: Test ELISA, miễn dịch huỳnh quang, trung hoà bổ thể Tuy nhiên, các xét nghiệm này cần thời gian, khó thực hiện Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được áp dụng bởi một số tác giả như Kazue Uchida và cộng sự

(2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly

from clinical samples by real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22], tác giả Jennifer D Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in

Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2]

Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay các thông tin nghiên cứu về vấn đề này còn hạn

chế Do đó, để hỗ trợ việc xác định nhanh và chính xác virus mumps gây bệnh quai

bị bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tôi tiến hành thực hiện chuyên đề khóa luận tốt

nghiệp “Chẩn đoán nhanh virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật

Real-time RT-PCR trên vùng gene SH”

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về bệnh quai bị

Theo (WHO) bệnh quai bị là một bệnh lây nhiễm do virus xảy ra ở người, ảnh hưởng chủ yếu đến các tuyến nước bọt Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em từ 5-9 tuổi, virus quai bị cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn, trong đó có các biến chứng nguy hiểm như viêm não, viêm màng não, viêm tinh hoàn và một số di chứng thần kinh vĩnh viễn [43], [44].

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh [44]

Quai bị do virus mumps, là virus có vật chất di truyền là RNA thuộc Rubulavirus họ paramyxoviridae gây nên Cho đến nay chỉ mới ghi nhận được virus này gây

nhiễm trên người, mà con đường lây lan qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp qua đường hô hấp và có trong không khí do hắt hơi từ đường hô hấp trên của bệnh nhân

1.1.2 Dịch tễ học [44]

Virus sẽ xuất hiện trong tuyến nước bọt sau 5 ngày tính từ khi bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng Sau một tuần, số lượng virus giảm đáng kể Trong nước tiểu, virus có thể tồn tại vài tuần

Bệnh quai bị xảy ra quanh năm, nhưng tỷ lệ mắc bệnh cao hơn vào cuối mùa đông và đầu mùa xuân

Theo thống kê của (WHO) tỷ lệ mắc bệnh quai bị hàng năm ở hầu hết các nơi trên thế giới trong khoảng 100-1000/100000 dân, với những đợt dịch lớn xảy ra mỗi 2-5 năm một lần

1.1.3 Tình hình quai bị ở Việt Nam [28]

Bệnh quai bị phân bố rộng trên toàn cầu Tuy nhiên, tỷ lệ mắc cao hơn ở những vùng dân cư đông đúc, đời sống thấp kém, vùng khí hậu ôn đới, tập trung cao hơn ở các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên Việc tiêm vắc xin dự phòng chưa phổ cập rộng rãi nên tỷ lệ mắc hàng năm gần như không giảm đi trong vòng 10 năm gần đây Bệnh quai bị lưu hành rộng rãi ở 100% tỉnh thành toàn quốc Tỷ lệ mắc bệnh quai bị trung bình trong 5 năm là 28,37/105 dân, có xu hướng tăng dần lên từ 28,98 (năm 2006) tới 39,34 (năm 2010), trong đó khu vực Tây Nguyên có tỷ lệ mắc cao nhất

(51,20) và miền Nam thấp nhất (12,39) Tỷ lệ tử vong do quai bị trung bình trong 5 năm là 0,0058 Bệnh quai bị xuất hiện quanh năm, có số mắc cao nhất trong khoảng tháng 4 tới tháng 6 Dựa trên đường phân bố ca mắc trung bình 5 năm, đã xác định đường “ngưỡng dịch” quai bị của 63 tỉnh cả nước với giá trị ngưỡng cao nhất là 301,9/105 dân/năm (tỉnh Lào Cai) và thấp nhất là 1,26/105 dân/năm (tỉnh Hậu Giang) [46]

1.1.4 Triệu chứng của quai bị

Người bị quai bị sẽ có thời gian ủ bệnh trong vòng 2 - 3 tuần, thông thường vào khoảng 17 - 18 ngày Trong thời gian này, người bệnh không có biểu hiện gì rõ rệt (30 tới 40% trường hợp nhiễm quai bị không có triệu chứng lâm sàng và đó là nguồn lây khó tránh nhất [44]) Sau đó, người bệnh có biểu hiện sốt 38oC, đau cổ họng, người mệt mỏi, chán ăn, có thể đau tuyến nước bọt dưới hàm hoặc dưới lưỡi, đau khi há miệng hoặc khi nuốt, tuyến mang tai sưng to kèm đau nhức ở một bên, lan dần sang tuyến mang tai bên kia và sưng to đến khoảng 1 tuần thì từ từ nhỏ lại [26], [44], [45]

1.1.5 Biến chứng của quai bị

Bệnh quai bị ở người lớn tuy ít gặp, nhưng thường nặng và có nhiều biến chứng hơn ở trẻ em và các trẻ em trong lứa tuổi đang dậy thì Có thể gặp các biến chứng sau: Viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn: Biến chứng này có tỷ lệ 20-35% ở người sau tuổi dậy thì mắc phải, khoảng 50% số trường hợp tinh hoàn teo dần và có thể dẫn đến tình trạng giảm số lượng tinh trùng và vô sinh [26], [29]

Nhồi máu phổi: Là biến chứng có thể xảy ra sau viêm tinh hoàn do quai bị vì hậu quả của khối huyết từ tĩnh mạch tuyến tiền liệt [26]

Viêm buồng trứng: Có tỷ lệ mắc phải là 7% ở nữ, sau tuổi dậy thì, ít khi dẫn đến vô sinh

Viêm tụy: Có tỷ lệ mắc phải là 3% - 7% [26], là một biểu hiện nặng của quai bị Bệnh nhân bị đau bụng nhiều, buồn nôn, có khi tụt huyết áp

Các tổn thương thần kinh: Viêm não có tỷ lệ mắc phải là 0,5% Tổn thương thần kinh sọ não dẫn đến điếc, giảm thị lực, viêm tủy sống cắt ngang, viêm đa rễ thần kinh [26]

Bệnh quai bị ở phụ nữ có thai: Những phụ nữ bị quai bị trong 3 tháng đầu của thai kỳ có thể gây sẩy thai với tỷ lệ 25% hoặc sinh con dị dạng [26] Trong 3 tháng cuối của thai kỳ có thể sinh non hoặc thai chết lưu

Một số biến chứng khác: Viêm cơ tim, viêm tuyến giáp, viêm tuyến lệ, viêm thần kinh thị giác (gây giảm thị lực tạm thời), viêm thanh khí phế quản, viêm phổi, rối loạn chức năng gan, xuất huyết do giảm tiểu cầu [26]

1.1.6 Phòng và điều trị

Hiện nay, chưa có một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh quai bị [26], [31] chỉ có thể phòng bệnh bằng vắc xin Vắc xin phòng bệnh quai bị thường kết hợp với phòng sởi và rubella (Trimovax, MMR) [31]

Vắc xin phòng bệnh quai bị có tác dụng kích thích cho trẻ em sản sinh kháng thể kháng quai bị, kháng thể đạt mức độ cao nhất sau khi tiêm chủng 6 – 7 tuần

Ngoài ra còn phòng bệnh quai bị thụ động với globulin miễn dịch, dùng cho người tiếp xúc với virus quai bị mà chưa được tiêm vắc xin trước đó [44]

Miễn dịch huỳnh quang: Phát hiện nhanh kháng nguyên virus trong tế bào họng - thanh quản

Trung hoà bổ thể: Đáp ứng kháng thể đối với kháng nguyên S, V dùng để chẩn đoán quai bị cấp, mới Kháng thể đối với kháng nguyên S xuất hiện sớm nhất, cao nhất 1 tuần, biến mất sau 6- 12 tuần [43]

Nuôi cấy virus trực tiếp từ dịch não tủy (CSF): Dịch não tủy lấy ở giai đoạn sớm 7 ngày) hoặc muộn (14 - 21 ngày) để làm xét nghiệm tìm kháng thể IgM hoặc biến động hiệu giá kháng thể IgG)[17]

Tuy nhiên, các phương pháp này tiêu tốn nhiều thời gian, đắt tiền và không thể phát hiện virus ở nồng độ thấp [44] Vì vậy cùng với sự phát triển của khoa học thì

phương pháp phát hiện nhanh là cần thiết để giúp chuẩn đoán sớm tiêu biểu như kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được một số tác giả trên thế giới áp dụng như Kazue Uchida và cộng sự (2005)

trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly from

clinical samples by Real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22], tác giả Jennifer D Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2] nên

trong bài nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp Real-time RT-PCR để phát hiện

nhanh virus mumps gây bệnh quai bị ở Việt Nam

1.1.8 Các công trình nghiên cứu trước

Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR đã được áp dụng bởi một số tác giả như:

Tác giả Kazue Uchida và cộng sự (2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive

detection of mumps virus RNA directly from clinical samples by Real-time PCR”

được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22].Trong bài nghiên cứu này tác giả sử dụng gene F là gene mục tiêu, 73 mẫu lâm sàn bao gồm cả mẫu dịch phết

vòm họng và dịch não tủy được thực hiện phản ứng Real-time PCR và đã phát hiện

được RNA virus mumps khoảng 70% ở cả hai mẫu dịch phết họng và mẫu dịch não

tủy

Tác giả Jennifer D Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-Time Reverse

Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2] Trong bài

nghiên cứu này tác giả sử dụng gene SH là gene mục tiêu Mục tiêu nghiên cứu của bài báo là xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Real-time PCR để phát

hiện virus mumps Các tác giả khẳng định rằng có thể phát hiện virus mumps trong phạm vi 10 bản sao có giá trị Ct khoảng 36, với hiệu quả khảo nghiệm đạt hơn 90%, độ đặc hiệu đạt 100% và phương pháp Real-time PCR sử dụng gene SH làm gene mục tiêu sẽ đặc hiệu hơn so với gene F

1.2 Sơ lược về virus Mumps gây bệnh quai bị

1.2.1 Mumps virus (MuV)

Virus mumps gây bệnh quai bị thuộc chi Rubulavirus, họ Paramyxoviridae, phân họ

paramyxovirinae, bộ Mononegavirales, ssRNA negative-strand viruses, ssRNA viruses, Viruses [37].

Hình 1.1: Phân họ paramyxovirinae [8]

1.2.1.1 Cấu tạo chung

Đa hình thái có vỏ ngoài với các gai, đường kính 150 nm

Gồm có 7 protein chính : Nucleocapsid (N), Phospho (P), Membrane (M), Fusion (F), Small Hydrophobic (SH), Hemagglutinin-Neurominidase (HN) và Large (L )

protein [17].

Nucleocapsid xoắn gồm 2 RNA mạch đơn (-) và 3 protein liên quan là N, L và P Protein L, P : tham gia vào hoạt tính của RNA-polymerase phụ thuộc vào RNA Protein N : là Proteincapside bao quanh genome

Protein F, HN : là 2 glycoprotein bề mặt, là các gai nằm trên mặt vỏ ngoài Protein HN giúp virus bám vào thụ thể bề mặt tế bào chủ Protein F giúp vỏ ngoài virus dung hợp với màng sinh chất của tế bào, đưa nucleocapsid vào bên trong tế bào, làm tan hồng cầu

Protein M : được phân bố dọc theo màng sinh chất của tế bào để tiến hành lắp ráp virion [48]

1.2.1.2 Bộ gene virus mumps

Bộ gene có dạng thẳng chiều dài 16-20 Kb, khối lượng phân tử 5-7x106 dalton

Bộ gene của virus là RNA sợi đơn có chứa bảy gene mã hóa các protein:

Nucleocapsid (N), Phospho (P), Membrane (M), Fusion (F), Small Hydrophobic (SH), Hemagglutinin-Neurominidase (HN) và Large (L ) protein [17].

Hình 1.2 :Bộ gene virus mumps [4]

Gene có chiều dài lớn nhất là gene L (6786 nucleotides), HN (1749nts), NP (1650nts), F (1617nts) V/P (1174nts), M (1128nts), SH (316nts) [4]

Hình 1.3: Virus mumps [4]

(A) Hình ảnh virus mumps được chụp bằng kính hiển vi (B) Bộ gene virus mumps

Lớp vỏ ngoài là pleomorphic có kích thước khoảng 100–600 nm

1.2.1.3 Sự nhân lên của virus [47]

- Hấp thụ và xâm nhập

Virus gắn gai HN vào thụ thể bề mặt (sialic acid) của tế bào chủ ở pH trung tính

Protein F được protease của tế bào chủ cắt và cho phép dung hợp với màng tế bào để đưa nucleocapsid vào tế bào chất

Protein M gắn vào protein N, ức chế tổng hợp mRNA, được thực hiện trước khi phiên mã sớm

- Tổng hợp protein

Tiến hành tổng hợp protein từ mRNA trong tế bào chất

Protein F và HN cài vào màng mạng lưới nội chất, hình thành bọng rồi chuyển đến gắn vào màng tế bào

Protein M liên kết với protein gai trong màng tế bào chất

Protein NP phong bế vị trí khỏi đầu và ICS cho phép bắt đầu phiên mã sợi RNA - Sao chép genome

Từ sợi RNA (-) làm khuôn để tổng hợp genome RNA RNA mới sinh lại làm khuôn để tổng hợp mRNA

RNA liên kết với các protein NP, P và L để tạo cấu trúc lõi - Lắp ráp và giải phóng

Protein NP gắn vào vị trí đặc hiệu bao quanh RNA tạo nucleocapsid nảy chồi ra ngoài

Các protein (HN) cắt acid sialic nằm trên bề mặt tế bào cho phép virus thoát khỏi tế bào

1.3 Gene SH-gene mục tiêu

Gene SH mã hóa cho protein màng type 1 gồm 57 acid amin được cho là để ngăn

chặn quá trình chết theo chu trình trong tế bào bị nhiễm bệnh [17], là khu vực biến động nhất của bộ gene virus [21] Do sự đa dạng giữa các chủng khác nhau, gene

SH đã được sử dụng như một dấu hiệu để phân loại các chủng virus quai bị [21]

Cho đến nay, có 12 kiểu gene (geneotype) A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, N (geneotype: là các kiểu khác biệt cấu trúc gene của các sinh vật cùng loài dựa vào sự khác biệt các đặc trưng trên bộ gene của vi sinh vật đó [36]) đã được đề xuất dựa

trên sự đa dạng trong gene SH [9], [10], [25]

Hình 1.4: Sự phân chia kiểu gene (geneotype) của virus mumps theo khu vực

[42]

Dựa vào hình 1.4 thì phần lớn virus mumps ở Việt Nam chủ yếu thuộc kiểu gene G

Theo những nghiên cứu trước tôi đã thu thập được đại diện là Rebecca H và cộng sự

(2007) trong bài báo:“Detection of RNA of Mumps Virus during an Outbreak in a

Population with a High Level of Measles, Mumps, and Rubella Vaccine Coverage”

được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [19], Watson-Creed và cộng sự

(2006) trong bài báo: “Two successive outbreaks of mumps in Nova Scotia among

vaccinated adolescents and young adults” được đăng trên tạp chí CMAJ [24], Jin và

cộng sự (2004) trong bài báo: “Genetic diversity of mumps virus in oral fluid

specimens: application to mumps epidemiological study” được đăng trên tạp chí J Infect Dis[11], Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-time reverse transcription-PCR assay for detection of mumps virus RNA in clinical specimens”

được đăng trên tạp chí J Clin Microbiol [2]…đều sử dụng gene SH làm gene mục tiêu để phát hiện virus mumps vì gene SH có sự đa dạng giữa các kiểu gene khác nhau, là gene đặc trưng của bộ gene virus mumps và là khu vực biến động nhất của bộ gene virus, do đó trong đề tài này tôi sử dụng gene SH genotype G (chủ yếu xuất

hiện ở châu Á, Việt Nam [42]) làm gene mục tiêu để thực hiện

1.4 Tổng quan về Real-time RT-PCR

1.4.1 RT PCR [40] 1.4.1.1 Nguyên lý

Là phương pháp PCR chuyển đổi RNA thành cDNA.Trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (Reverse transcription) thành cDNA rồi sau đó sẽ dùng phương pháp PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này

Enzyme được sử dụng trong giai đoạn phiên mã ngược là Reverse transcriptase

được tách chiết từ Moloney murine leukermia virus (M-MLV), hay từ A vian

myeloblastosis virus (AMV) Enzyme Reverse transcriptase là một loại DNA

polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm mạch khuôn để tổng hợp nên DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA)

Để enzyme Reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ RNA mạch đơn, cần phải có mồi bắt trên mạch khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme Reverse transcriptase khi trượt trên mạch khuôn có thể kéo dài được mạch cDNA

1.4.1.2 Mồi

Mồi đặc hiệu: Mồi được sử dụng trong giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho

trình tự RNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA

Mồi ngẫu nhiên: Một loại mồi chỉ có 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên để phiên

mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành cDNA

Mồi oligo(dT)15: Ngoài mồi đặc hiệu và mồi ngẫu nhiên, có thể dùng mồi

oligo(dT)15 (còn được gọi là mồi poly T) vì mRNA luôn có đuôi là poly(A)+ Mồi oligo(dT)15 thường được dùng để làm thư viện cDNA của biểu hiện gene hay dùng để phát hiện vi khuẩn sống trong bệnh phẩm

Hình 1.5: Mồi trong RT-PCR [43]

1.4.1.3 Nhiệt độ phản ứng

Trong giai đoạn phiên mã ngược mẫu được giữ 42o trong 10-15 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA và enzyme reverse transcriptase tổng hợp được cDNA Nếu dùng mồi đặc hiệu thì thời gian ủ 42 o có thể kéo dài 60 phút Sau khi hoàn tất tổng hợp cDNA ở 42 o enzyme reverse transcriptase phải bị huỷ đi bằng cách đưa nhiệt

độ lên 85 o trong vòng 5 phút Sản phẩm cDNA này có thể được đưa vào khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu

1.4.1.4 Các biến thể của RT-PCR

Two-step RT-PCR: Là phương pháp RT-PCR mà người thí nghiệm thực hiện giai

đoạn RT để tổng hợp cDNA trong một ống nghiệm, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để thực hiện giai đoạn PCR

khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm

One-step RT-PCR: Người thí nghiệm thực hiện cả hai giai đoạn RT và giai đoạn

PCR trong cùng một ống phản ứng Để thực hiện được One-step RT-PCR trong ống phản ứng phải có đủ các thành phần hoá chất và thuốc thử để chạy RT và PCR,

nghĩa là phải có cả enzyme reverse transcriptase và taq polymerase Ngoài ra cũng có một loại DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus

thermophilus, được đặt tên là TthPol enzyme này có hai khả năng: có thể thực hiện

phiên mã ngược khi có sự hiện diện của Mn2+ và nhân bản DNA khi có sự hiện diện của Mg2+ do đó có thể sử dụng enzyme này để thực hiện One-step RT-PCR

Trong phương pháp One-step RT-PCR toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT

1.4.2 Real-time PCR [1][41]

1.4.2.1 Nguyên tắc của phản ứng Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản

Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’

polymerase (tổng hợp DNA từ đầu 5’-3’) của Taq DNA polymerase do Holland và

cộng sự công bố năm 1991 Trong phản ứng Real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX )

Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch)

Các tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, … được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau.

1.4.2.2 Các loại mẫu dò:

Mẫu dò lai (hybridization probe): Gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên

mạch khuôn Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng PCR Mẫu dò phía đầu có mang nhóm huỳnh quang ở đầu 3’ còn mẫu dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang ở đầu 5’ Khi hai mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA, nhóm huỳnh quang “cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành trong quá trình Real-time PCR

Hình 1.6: Mẫu dò lai [41]

Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): Với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan

probe (còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease) Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye) Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’

exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó

không còn chịu tác động của nhóm “dập” Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu

huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi nhận

Hình 1.7: Mẫu dò thủy giải [41]

Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe): Điển hình như “Molecular beacon”: bao

gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược Các nhóm “phát” (reporter) và “dập”(quencher) được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò, do đó sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung dịch Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được

phát ra và ghi nhận

Hình 1.8: Mẫu dò kẹp tóc [41]

Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt Real-time PCR thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (Standard Curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ

Định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật Real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi điều trị

1.4.3.4 Các vấn đề cơ bản của Real-time PCR

Đường nền (baseline): Được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh

quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Theo mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được

thay đổi

Ngưỡng (threshold): Là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngưỡng được xem là tín hiệu đặc hiệu, và sẽ được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng Ngưỡng được thiết lập theo từng thí nghiệm và nó thường cắt tất cả các đường tín hiệu đặc hiệu trong

pha nhân bản cấp số mũ (exponential phase)

Chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó

tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng Nói khác đi, đó là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Đây là nguyên lý cơ bản của Real-time PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết quả Số trình tự mục

tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị Ct càng thấp

Hình1.9 : Các vấn đề cơ bản của Real-time PCR [41]

1.4.4 Đường chuẩn của Real-time PCR

Một đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình tự DNA đã biết và các giá trị Ct tương ứng Để định lượng trình tự mục tiêu ban đầu có trong mẫu, người ta đo giá trị Ct của mẫu, giá trị này lắp vào đường chuẩn sẽ cho được nồng độ trình tự mục tiêu có trong mẫu ban đầu

Hình 1.10: Đường chuẩn [41]

Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn Trên đường chuẩn này, trục tung Y là Ct, trục hoành X là số lượng DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn Do các mẫu chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10 nên số lượng bản DNA đích trong các mẫu chuẩn được biểu thị bằng log10 của số lượng này Do vậy, trị số 2, 4, 6, và 8 trên trục X tương ứng với các số lượng bản đích 102, 104, 106, 108bản sao trong ống phản ứng

Kỹ thuật Real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi

điều trị Real-time PCR được dùng trong phát hiện virus mumps, HCV, genotypeHCV, phát hiện H.pylori, chẩn đoán sớm HIV ở trẻ em, xác định type của virus sốt xuất huyết Dengue

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được bắt đầu nghiên cứu từ tháng 10/2015 đến tháng 5/2016 tại công ty Cổ phần Công Nghệ Việt Á

2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẫu

Mẫu chứng dương được công ty Việt Á cung cấp Mẫu lâm sàng cho qui trình thực nghiệm là mẫu dịch phết vòm họng có được từ bệnh viện Nhi Thanh Hóa được nhận thông qua công ty Việt Á

2.2.2 Mồi và mẫu dò

Dựa vào các thông tin đã thu thập được thông qua quá trình tìm kiếm tài liệu và nghiên cứu trong thời gian qua thì cặp mồi và mẫu dò được lựa chọn sau các phân tích (trên máy tính) một cách chi tiết là cặp mồi và mẫu dò được thu nhận từ công bố của Boddicker J và cộng sự (2007) [2] và đã được chỉnh sửa cho phù hợp với mục tiêu nghiên cứu của bài nghiên cứu này

Bảng 2.1: Cặp mồi, mẫu dò được công bố của Boddicker J và cộng sự (2007)

Tên mồi Trình tự mồi

Chiều dài

Gene mục tiêu

Tài liệu tham khảo SH61F 5’GTG ACC CTG CCG TTG CA 3’ 17

SH gene

[2] SH147R 5’GTT ATG ATC AGA GAG AGA

AGA ATT AGC AAT AG 3’ 32

SH79P2 5’FAM-TAT GCC GGC GAT CCA

ACC TCC CTT ATA-BHQ 3’ 27

Bảng 2.2: Trình tự của cặp mồi và mẫu dò mới đã được chỉnh sửa và thiết kế mới

Tên mồi/mẫu dò Trình tự

F1 (mồi xuôi) 5’ TGACCCTGCCGTTGCACTAT 3’ R1 (mồi ngược) 5’ CAT GTC GCA CCG CAG TCT TAT 3’ P1 (mẫu dò) 5’ CCGGCGATCCAACCCCCATTATACCTC 3’

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ:

2.2.3.1 Thiết bị dùng để khảo sát in silico

Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico các trình tự gene mục tiêu và các mẫu dò

bằng các phần mềm tin sinh học: PUBMED (NCBI), annhyb, seaview, chương trình BLAST (NCBI), Oligo Analyzer (IDT), Bioedit…

Một số công cụ tin sinh học được sử dụng trong quá trình phân tích, khảo sát các cặp mồi, mẫu dò:

- IDT analyzer: Giúp xác định các thông số của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo homo-dimer, hetero-dimer,…

- Annhyb: Kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm

- BLAST: Với các thông số mặc định sẵn trên NCBI nhằm xác định độ đặc hiệu và tính phổ quát của cặp mồi

- Bioedit: Hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp giống cột các trình tự, phát hiện vùng biến động giữa các loài và dùng làm mẫu dò đặc hiệu cho loài

- Seaview: Hỗ trợ sắp giống cột các trình tự tương đồng

2.2.3.2 Thiết bị và dụng cụ chạy thực nghiệm:

- Máy tính - Máy Vortex - Máy ly tâm

- Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng - Tủ PCR

- Bồn ủ nhiệt

- Máy Real-time PCR

- Các dụng cụ khác như: micropipettes (10µl, 200µl, 1000µl), đầu tip, eppendorf các loại

- Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang …

2.2.4 Hóa chất 2.2.4.1 Tách chiết RNA

Dung dịch 1(Trizol): Phenol 38%; guanidium thyocianate 0,8M; glycerol 5%; sodium acetate 0,1M; pH 4.0

Master mix (dNTPs, enzyme phiên mã ngược M-Mul V Reverse transcriptase, MgCl2, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (50mM KCl, Tris pH 8,0 10mM)) Nước cất đã hai lần xử lý DEPC

2.2.4.3 Phản ứng PCR

DNA bản mẫu

Primer xuôi, primer ngược

Master mix (dNTPs, Taq DNA polymerase, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR

50mM KCl, 10mM Tris pH8, MgCl2 1,5mM) Nước cất 2 lần vô trùng

2.2.4.4 Phản ứng Realtime PCR

DNA bản mẫu

Primer xuôi, primer ngược và probe

Master mix (dNTPs, Taq DNA polymerase, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR

50mM KCl, 10mM Tris pH8, MgCl2 1,5mM) Nước cất 2 lần vô trùng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khai thác dữ liệu

Thu thập thông tin, khai thác dữ liệu từ các bài báo khoa học về bệnh quai bị, kỹ thuật Real-time RT-PCR để phát hiện nhanh virus gây bệnh quai bị thông qua các cơ sở dữ liệu PUBMED (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) với các từ khóa:

Mump virus, Real-time RT-PCR, SH gene… 2.3.2 Khảo sát in silico

2.3.2.1 Thu thập trình tự gene mục tiêu

Thu nhận các trình tự gene mục tiêu gene SH của virus mumps từ ngân hàng gene

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để tìm hiểu và lựa chọn vùng thích hợp để thiết kế mồi và các mẫu dò sử dụng cho kỹ thuật Real-time RT-PCR

2.3.2.2 Thu thập trình tự các cặp mồi, mẫu dò

Thu thập tất cả các cặp mồi, mẫu dò từ các bài báo nghiên cứu khoa học về kỹ thuật Real-time RT-PCR để phát hiện nhanh vius gây bệnh quai bị

2.3.2.3 Khảo sát đánh giá và thiết kế mới các cặp mồi mẫu dò

Mồi và mẫu dò là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gene

Basic Local Alignmemt Search Tool (BLAST) trên NCBI được dùng để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi và mẫu dò Bên cạnh đó dựa vào các công cụ phân tích trên trang web IDT, mồi và mẫu dò đã được tiến hành đánh giá các thông số quan trọng như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer-dimer của hệ thống mồi với một số tiêu chí sau:

Các chỉ tiêu của mồi và mẫu dò [1]:

- Chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thông thường dao động 18bp-25bp Tuy nhiên trong các trường hợp cụ thể chiều dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn chiều dài chuẩn, giới hạn trong khoảng 15bp-30bp - Thiết kế các mồi với hàm lượng GC khoảng 50-60% Các vùng với hàm lượng

GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong tiến trình PCR, dẫn đến phản ứng kém hiệu quả

- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là một thông số rất quan trọng Dựa trên đó người ta có thể quyết định nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR Theo nhiều nghiên cứu, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và ngược không nên quá 50C Nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50-65 0C

- Mồi được thiết kế có nhiệt độ lai trong khoảng 55-60 0C để tránh sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu

- Cấu trúc thứ cấp: Cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop-tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide), homo dimer (hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp) và hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau)

Phân tích khảo sát các đặc tính, thông số vật lý, và tính đặc hiệu của các cặp mồi, mẫu dò thu thập được từ các bài báo nghiên cứu khoa học, từ đó hướng tới việc thiết kế mới các cặp mồi, mẫu dò

Nguyên tắc tách chiết RNA gồm 3 bước chính:

- Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hóa học hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng RNA ra môi trường

- Bước 2: Kết hợp chloroform và phenol loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid, polysaccharide và lượng phenol) Sau đó đem ly tâm, mẫu xử lí với Trizol sẽ phân tách thành 2 lớp: lớp dưới là phenol, lớp

trên là nước chứa RNA, phần protein biến tính nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ RNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ được thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung chất trợ tủa

- Bước 3: Tủa RNA Thường dùng ethanol nồng độ cao (2-2,5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa) trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol 0,8-1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa RNA sau khi tủa và rửa lại 1 lần nữa với ethenol 70% và được bảo quản trong nước cất 2 lần đã xử lý với DEPC

Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng (tránh loại bỏ luôn phần cặn) Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200µl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn ( tránh loại bỏ luôn phần cặn) Để khô ở 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch 5

Nếu chưa đặt phản ứng PCR ngay thì phải bảo quản ở -20oC

2.3.5 Phương pháp PCR 2.3.5.1 Nguyên tắc

DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn ban đầu với mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch mới

2.3.5.2 Phương pháp tiến hành

Cho 2,5µl dung dịch cDNA từ phản ứng RT trên vào ống eppendorf 0,2ml có chứa các thành phần sau:

12,5µl Master mix 0,5µl mồi

Thêm nước cất 2 lần cho đủ 25µl

Đậy nắp eppendorf thật kỹ và đặt vào máy luân nhiệt Lập chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC - 5 phút; 40 chu kì: 95oC - 15 giây, 55oC - 45 giây, 72oC - 20 giây

2.3.6 Phương pháp RT 2.3.6.1 Nguyên tắc

Là phương pháp PCR chuyển đổi RNA thành cDNA Trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (Reverse transcription) thành cDNA rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này

2.3.6.2 Phương pháp tiến hành

Cho 10µl hỗn hợp RT (Primer, dNTPs, Enzyme Reverse transcriptase, MgCl2, nước cất vô trùng) vào một ống eppendorf 0,2ml Cho 15µl chứng dương, chứng âm hoặc dịch RNA tách chiết vào ống eppendorf trên Đậy nắp eppendorf thật kĩ và cho vào máy luân nhiệt Lập trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 25oC trong vòng 5 phút, 42oC trong vòng 30 phút 85oC trong vòng 5 phút, giữ ở 4oC

0,5µl mẫu dò (10pmol)

Thêm nước cất 2 lần cho đủ 25µl

Đậy nắp eppendorf thật kỹ và đặt vào máy luân nhiệt Lập chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC - 5 phút; 40 chu kì: 95oC - 15 giây, 55oC - 45 giây, 72oC - 20 giây Tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận ở giai đoạn 55oC mỗi chu kì

2.3.8 Phương pháp kiểm tra khả năng hoạt động của bộ mồi

Để kiểm tra hoạt động của bộ mồi phát hiện virus mumps, tiến hành đặt phản ứng PCR với mẫu chứng dương virus mumps và mẫu chứng âm là (nước cất) được chạy

ở nhiệt độ lai 55oC Nếu chứng dương cho kết quả dương tính, chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ bộ mồi hoạt động tốt