Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA NẤM Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH NẤM MANG Ở CÁ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
TIỂU LUẬN
TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA NẤM
Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH NẤM MANG Ở CÁ
TRONG VI KHUẨN Escherichia coli
Trang 23.2 Khuếch đại đoạn gen mã hóa 18S rRNA bằng PCR 8
3.3 Xử lý DNA mục tiêu và nối vào vector 8
3.4 Xử lý tế bào vi khuẩn Escherichia coli ( E coli ) và biến nạp 9
3.5 Tạo dòng và sàng lọc bằng hệ thống xanh – trắng 9
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 10
TÀI LIỆU THAM KHẢO 11
Trang 3DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid
EDTA: ethylene diamine tetra acetic SDS: sodium dodecyl sulphate
PCI: phenol – chloroform – isoamyl alcohol TE: Tris - EDTA
PCR: polymerase chain reaction rRNA: ribosomal ribonucleic acid
dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate
Taq: Thermus aquaticus
MCS: multi cloning site
IPTG: isopropyl – β – D - thiogalactoside
Trang 4Hình 2.3 Kỹ thuật tạo dòng gen 7
Hình 3.1 Vector pGEM-T Easy 9
Hình 4.1 Ảnh minh họa sàng lọc xanh – trắng 10
Trang 5CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm mang là bệnh nấm cục bộ cấp tính ở mang gây ra bởi loài nấm
Branchiomyces sanguinis ảnh hưởng đến nhiều loài cá nước ngọt Bệnh phổ biến nhất
ở những vùng có khí hậu ấm áp Bệnh được tìm thấy với tỉ lệ nhiễm bệnh là 92 % ở cá nuôi vào mùa hè Nhiệt độ cao hơn và nước có nhiều chất hữu cơ, cũng như mật độ nuôi quá nhiều là những yếu tố dễ dẫn đến sự lây nhiễm bệnh này Cá nhiễm bệnh bị suy nhược, hôn mê và suy hô hấp (do tổn thương mô mang), biểu hiện bằng cách bơi theo tư thế thẳng đứng để thở hổn hển, nổi lên, tập trung ở những nơi có nước chảy và cuối cùng chết khi há miệng Mang biểu hiện tùy theo giai đoạn và mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng Chủ yếu, xuất hiện tắc nghẽn trong giai đoạn đầu, sau đó bắt đầu thấy sự nhợt nhạt của mô mang do mất oxi Màu sắc của mang bắt đầu chuyển thành màu trắng do hoại tử và cuối cùng là màu trắng sáng trong các trường hợp nhiễm trùng nặng do mô mang bị hoại tử nghiêm trọng làm cho mang xuất hiện màu cẩm thạch
Hình 1.1 Cá bị nấm mang
Trong giai đoạn nền nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh hiện nay, mật độ cá nuôi trên các ao ngày càng tăng dẫn đến lượng chất hữu cơ trong nước tăng Đây là điều kiện
thuận lợi cho nấm Branchiomyces sanguinis phát triển và lây lan mạnh Tỷ lệ tử vong
có thể xảy ra trong vòng chưa đầy 48 giờ và có thể lên tới 50% đàn Hằng năm, bệnh
nấm mang do Branchiomyces sanguinis gây ra làm tổn thất kinh tế lớn cho người nuôi
Vì vậy, trong bài tiểu luận này nhóm muốn đề xuất kỹ thuật tạo dòng đoạn gen mã hóa
18S rRNA của nấm Branchiomyces sanguinis gây bệnh nấm mang ở cá trong vi khuẩn Escherichia coli Đây sẽ là cơ sở để phát triển thêm các nghiên cứu khác
Trang 6CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về nấm Branchiomyces sanguinis
Branchiomyces sanguinis là một loài nấm hại, gây bệnh nấm mang ở cá nước
ngọt Nấm có dạng sợi ít phân nhánh không có vách ngăn, sinh bào tử Đường kính sợi nấm 8 – 30 µm, đường kính bào tử tương đối lớn 5 – 9 µm Nấm sinh trưởng ở nhiệt độ trong khoảng 14 – 35 °C, phát triển mạnh khi nhiệt độ trên 20 °C, độ pH trong khoảng 5,5 – 6,5 (Plumb, 1997)
Hình 2.1 Nấm Branchiomyces sanguinis dưới kính hiển vi (A) Sợi nấm 40X; (B) Bào tử nấm
100X (Mohammed et al., 2019)
2.2 Tổng quan về 18S rRNA
18S rRNA là một thành phần của tiểu đơn vị nhỏ ribosome của sinh vật nhân chuẩn (40S) 18S rRNA là RNA cấu trúc của thành phần nhỏ của ribosome tế bào chất nhân chuẩn, và do đó là một trong những thành phần cơ bản của tất cả các tế bào nhân chuẩn 18S rRNA là chất tương đồng tế bào nhân chuẩn của RNA ribosome 16S ở sinh vật nhân sơ và lạp thể 18S rRNA cũng tương đồng với RNA ribosome 12S trong ty thể Các gen mã hóa cho 18S rRNA được gọi là gen 18S rRNA Dữ liệu trình tự từ các gen này được sử dụng rộng rãi trong phân tích phân tử để tái tạo lại lịch sử tiến hóa của sinh vật, đặc biệt là ở động vật có xương sống, vì tốc độ tiến hóa chậm của nó khiến nó phù hợp để tái tạo lại sự phân kỳ cổ xưa
Gen 18S rRNA tiểu đơn vị nhỏ là một trong những gen được sử dụng thường xuyên nhất trong nghiên cứu phát sinh gen và là dấu hiệu quan trọng cho phản ứng chuỗi polymerase mục tiêu ngẫu nhiên (PCR) trong sàng lọc đa dạng sinh học môi trường (Meyer et al., 2010) Nhìn chung, trình tự gen rRNA rất dễ tiếp cận do các vùng sườn
Trang 7được bảo tồn cao cho phép sử dụng các đoạn mồi phổ quát (Meyer et al., 2010) Sự sắp xếp lặp đi lặp lại của chúng trong bộ gen cung cấp lượng DNA mẫu quá mức cho PCR, ngay cả ở những sinh vật nhỏ nhất Gen 18S là một phần của lõi chức năng ribosome và chịu tác động của các lực chọn lọc tương tự ở mọi sinh vật sống Do đó, khi các nghiên cứu phát sinh chủng loại quy mô lớn đầu tiên dựa trên trình tự 18S được công bố (Field et al., 1988), gen này đã được tôn vinh là ứng cử viên hàng đầu cho việc tái tạo cây đa bào của sự sống (Meyer et al., 2010) Trình tự 18S sau đó đã cung cấp bằng chứng cho
sự phân chia của các nhánh Ecdysozoa và Lophotrochozoa (nhóm sinh vật đơn ngành
bao gồm một tổ tiên chung và tất cả các hậu duệ trực hệ của nó), do đó góp phần tạo ra một sự thay đổi mang tính cách mạng trong sự hiểu biết của chúng ta về các mối quan hệ giữa động vật đa bào (Meyer et al., 2010)
Hình 2.2 18S rRNA 2.3 Tổng quan về kỹ thuật tạo dòng gen
Khi nghiên cứu cấu trúc, chức năng của DNA hoặc protein, việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm hay gene mã hóa cho protein cần được thực hiện Đoạn DNA hay gene quan tâm này được nhân bản để thu được số lượng lớn các bản sao phục vụ thực hiện thí nghiệm
Do bộ gene của sinh vật lớn, phức tạp và chỉ có 1 – 2 bản sao của đoạn DNA quan tâm hiện diện trong tế bào nên không thể phân lập chúng bằng các phương pháp sinh hóa thông thường Vì vậy, các cấu trúc DNA tồn tại và tự sao chép độc lập trong
Trang 8tế bào vật chủ được sử dụng để mang, tăng sinh hoặc biểu hiện số bản sao của đoạn DNA quan tâm Các cấu trúc DNA có tính chất này được gọi là vector Việc gắn đoạn DNA quan tâm vào vector tạo nên vector tái tổ hợp Phân tử tái tổ hợp này được đưa vào trong một loại tế bào thích hợp để có thể tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gene của tế bào vật chủ (host cell) Các dòng tế bào vật chủ có kiểu gene và các đặc tính thuận lợi cho thao tác trên DNA gọi là chủng chủ (host strain) Các dòng tế bào này khi mang DNA tái tổ hợp được gọi là dòng tái tổ hợp (recombinant clone) và được lưu trữ hoặc sử dụng cho thao tác trên đoạn DNA mục tiêu (Cohen et al., 1973)
Hình 2.3 Kỹ thuật tạo dòng gen
Trang 9CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP
3.1 Ly trích DNA tổng số
Tại vùng mang cá bị nấm, ta lấy mẫu rồi tiến hành mang đi ly trích DNA tổng số Bằng cách đồng nhất mẫu trong hỗn hợp Tris – EDTA – NaCl - SDS, ly tâm, gây kết tủa các thành phần không cần thiết bằng PCI, kết tủa DNA bằng ethanol 99° và tinh sạch bằng ethanol 70° ta thu được DNA tổng số Sau đó hòa tan trong dung dịch TE
3.2 Khuếch đại đoạn gen mã hóa 18S rRNA bằng PCR
Sản phẩm DNA sau khi ly trích được sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn DNA mã hóa 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR Các primer được thiết kế có trình tự thích hợp tổng hợp trình tự mã hóa 18S rRNA Ta bổ sung lần lượt các thành phần vào ống Eppendorf bao gồm: primer xuôi, primer ngược, buffer, các dNTP, nước cất 2 lần,
enzyme Taq polymerase và DNA khuôn Sau khi thực hiện phản ứng PCR bằng máy
luân nhiệt trong 2 giờ, ta thu được dung dịch chứa các đoạn DNA mã hóa cho 18S rRNA Tiếp theo, ta tiến hành điện di trên gel agarose ở 100 V trong 30 phút Sau khi điện di kết thúc, miếng gel được làm tan chảy ở nhiệt độ thích hợp Dung dịch này tiếp tục được xử lý bằng hỗn hợp phenol/chloroform nhằm loại bỏ polysaccharide và các thành phần lẫn tạp trong gel DNA mục tiêu được thu nhận bằng cách kết tủa với ethanol tuyệt đối trong điều kiện lạnh
3.3 Xử lý DNA mục tiêu và nối vào vector
Nhóm đề xuất chọn vector pGEM-T Easy vì để tránh sự tái tổ hợp không đúng, dễ sàng lọc Vector pGEM-T Easy mang 3 trình tự quan trọng Đó là trình tự mã hóa gen
kháng ampicilline, trình tự khởi đầu sao chép f1 ori và trình tự gen lacZ mã hóa cho tiểu
phần α của β – galactosidase có MCS hở do thừa mỗi đầu 1 nucleotide loại T
Trang 10Hình 3.1 Vector pGEM-T Easy
Nhờ hoạt tính terminal transferase của emzyme Taq polymerase mà đầu 3’ ở mỗi
mạch của các sản phẩm DNA được gắn thêm 1 nucleotide loại A
Ta trộn hỗn hợp vector pGEM-T Easy và dung dịch chứa các đoạn DNA mục tiêu đã được xử lý lại với nhau đồng thời bổ sung emzyme ligase Sau đó, ta thu nhận hỗn hợp có chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa 18S rRNA và các thành phần không quan tâm
3.4 Xử lý tế bào vi khuẩn Escherichia coli ( E coli ) và biến nạp
Trong operon lac của vi khuẩn E coli, ta tiến hành gây đột biến bằng cách loại
bỏ một trình tự khoảng 33 nucleotide mã hóa cho tiểu phần α của β - galactosidase Sau đó, ta biến nạp hỗn hợp chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa 18S rRNA và các
thành phần khộng quan tâm vào các tế bào vi khuẩn E coli đã được xứ lý bằng phương
pháp sốc nhiệt
3.5 Tạo dòng và sàng lọc bằng hệ thống xanh – trắng
Các tế bào vi khuẩn E coli sau khi được biến nạp bằng sốc nhiệt sẽ được nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung IPTG, X-gal và ampicilline để tạo dòng và sàng lọc
Trang 11CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ
Sau 24 giờ nuôi cấy, kết quả sẽ gồm các khuẩn lạc có màu xanh và các khuẩn lạc có màu trắng trên cùng 1 đĩa petri Theo nguyên tắc, β – galactosidase sẽ thủy phân đường đôi tạo màu xanh, mà DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa 18S rRNA sẽ bị
mất trình tự gen lacZ mã hóa tiểu phần α dẫn đến bất hoạt β – galactosidase không thủy
phân được X-gal nên các tế bào chứa DNA tái tổ hợp này sẽ hình thành khuẩn lạc có màu trắng Do đó, ta sẽ chọn những khuẩn lạc có màu trắng Những khuẩn lạc này chính
là những khuẩn lạc phát triển từ tế bào vi khuẩn E coli chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn
gen mã hóa 18S rRNA
Hình 4.1 Ảnh minh họa sàng lọc xanh – trắng
Trang 12TÀI LIỆU THAM KHẢO
Cohen S.N., Chang A.C.Y., Boyer H.W., Helling R.B (1973) Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro Proceedings of the National Academy of Sciences 70:3240-3244 DOI: 10.1073/pnas.70.11.3240
Field K.G., Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Ghiselin M.T., Raff E.C., Pace N.R., Raff R.A (1988) Molecular Phylogeny of the Animal Kingdom Science 239:748-753 DOI: 10.1126/science.3277277
Meyer A., Todt C., Mikkelsen N.T., Lieb B (2010) Fast evolving 18S rRNA sequences from Solenogastres (Mollusca) resist standard PCR amplification and give new insights into mollusk substitution rate heterogeneity BMC Evolutionary Biology 10:70 DOI: 10.1186/1471-2148-10-70
Mohammed I., Abed A., Al - Nuaimi A (2019) A COMPARATIVE STUDY BETWEEN THE POLLUTION OF EUPHRATES RIVER WATER AND THE DRAINAGE WATER AND THEIR EFFECTS ON BRANCHIOMYCES SANGUINIS GROWTH Pollution Research 38:86-92
Plumb J.A (1997) Chapter 11 - Infectious Diseases of Striped Bass, in: R M Harrell (Ed.), Developments in Aquaculture and Fisheries Science, Elsevier pp 271-313