thiết bị và ktcnsh

HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCCHẨN ĐOÁN BỆNH XOẮN LÁ VÀ VÀNG MÉP LÁ TRÊN CÂY DÂU TÂY IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT RT-PCRGVHD: TS.. Sau 30 ngày, tách các cụm mô sẹo và nuôi cấy trên môi trườ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH XOẮN LÁ VÀ VÀNG MÉP LÁ TRÊN CÂY DÂU TÂY IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

GVHD: TS Huỳnh Văn Biết

ThS Trương Quang Toản

Sinh viên thực hiện:

1 Đặt vấn đề

Hiện nay, việc trồng Dâu tây còn hạn chế do dịch bệnh lây lan, trong đó có một số bệnh do virus gây ra, đặc biệt là bệnh SCV và bệnh SMYEV.

3

Hình 1.1 Bệnh xoắn lá trên dâu tây

Hình 1.2 Bệnh vàng mép lá trên dâu tây

Virus gây bệnh SCV và SMYEV thuộc

2 Nội dung thực hiện

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu

Chọn Dâu tây in vitro thuộc 3 giống Mỹ Đá, Mỹ Hương và Pháp lấy lá

và cắt nhỏ với kích thước khoảng 7.7mm.

Nuôi cấy mô -> sẹo Sau 30 ngày, tách các cụm mô sẹo và nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi.

Dâu tây hình thành rễ hoàn chỉnh -> nguồn mẫu.

Tạo đối chứng âm cũng như ba bước trên nhưng thay thế bằng cây

dâu tây in vitro sạch bệnh virus.

6

3.2 Phương pháp

3.2.1 Môi trường nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng 23-27oC (C), với thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày cường độ ánh sáng 3000 lux

Loại môi trườngTên Môi trườngBổ sung

7

- Giai đoạn tạo nguồn mẫu: các chai thủy tinh có dung tích 250 ml

(chứa 30 ml môi trường/chai) ở giai đoạn tạo mô sẹo, cấy 3 mẫu

lá/chai; ở giai đoạn tạo chồi, cấy 3 cụm mô sẹo/chai và ở giai đoạn tạo rễ, cấy 1 chồi/chai.

3.2.2 Hệ thống nuôi cấy

- Giai đoạn nhân giống dâu tây sạch bệnh virus: các túi nylon làm

từ polyethylen đã được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút các túi được mở ra và rót môi trường nuôi cấy vào ( 100 ml môi

trường/túi thao tác trong tủ cấy vô trùng) , ở giai đoạn tạo mô sẹo, cấy 3 mẫu lá/túi; ở giai đoạn tạo chồi, cấy 3 cụm mô sẹo/túi và ở giai đoạn tạo rễ, cấy 3 cụm chồi/túi.

Chuyển dịch nổi sang tube mới

Thêm LiCl, ủ qua đêm để kết tủa

KỸ THUẬT RT-PCR

Bệnh SCV

- Cặp mồi phát hiện bệnh:

Mồi xuôi (SC1DFW): 5’- TTCAGGACCTATT TGATGACA - 3’ Mồi ngược (SC1DRV): 5’- CATTGGTGGCA GACCCATCA - 3’

- Quá trình RT-PCR:

Gồm 40 chu kỳ

Giai đoạn biến tính: 90oC trong 30 giây Giai đoạn bắt cặp: 58oC trong 30 giây Giai đoạn kéo dài: 68oC trong 2 phút Kết thúc ở: 68oC trong 5 phút

11

Bệnh SMEYV

- Cặp mồi phát hiện bệnh:

Mồi xuôi (SM1DFW): 5’- GTGTGCTCAATCC AGCCAG - 3’

Mồi ngược (SM1DRV): 5’- CATGGCACTCAT TGGAGCTGGG - 3’

- Quá trình RT-PCR:

Gồm 40 chu kỳ

Giai đoạn biến tính: 90oC trong 30 giây Giai đoạn bắt cặp: 50oC trong 30 giây Giai đoạn kéo dài: 68oC trong 2 phút Kết thúc ở: 68oC trong 5 phút

12

ĐIỆN DI

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose

Bước 2: Điện di trên gel agarose 2% ở hiệu điện thế 100 V trong 1 giờ.

Bước 3: Sau đó nhuộm trong dung dịch EtBr 2 mg/l trong 30 phút Hình ảnh điện di được chụp dưới tác động của tia UV để ghi nhận vạch của sản phẩm tương ứng với kích thước thiết kế sẵn ở trên thang chuẩn

13

4 Kết quả, thảo luận, kết luận và kiến nghị

4.1 Kết quả

Hình 4.1 Dâu tây in vitro bị nhiễm bệnh; a) Nhiễm bệnh SCV, b) Nhiễm bệnh SMYEV.(Nguồn: Dương Tấn Nhựt và ctv, Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán các bệnh virus

xoắn lá và vàng mép trên cây Dâu tây invitro, 2009.)

14

Hình 4.2 Các cây Dâu tây sạch bệnh virus tái sinh từ mô lá; A) Mô sẹo hình thành từ mô lá , B) Chồi tái sinh từ mô sẹo, C) Cây Dâu tây invitro, D) Cây Dâu tây trồng ngoài vườn ươm (Nguồn:

Dương Tấn Nhựt và ctv, Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán các bệnh virus xoắn lá và vàng

mép trên cây Dâu tây in vitro, 2009.)

15

Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu cây Dâu tây in vitro bị nhiễm và sạch bệnh SCV và bệnh SMYEV

Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu bị nhiễm SCV và bệnh SMYEV của từng giống cây Dâu tây

- Kết quả điện di: Mẫu xét nghiệm dương tính có band sáng, rõ ở 345

bp (đối với bệnh SCV) và 271 bp (đối với bệnh SMYEV).

16

4.2 Thảo luận

- Hai loại bệnh SCV và SMYEV trên 50 mẫu in vitro Dâu tây của các

giống: Mỹ Đá, Mỹ Hương và Pháp cho thấy cả ba giống đều vị nhiễm virus.

- Thông qua chẩn đoán bệnh SCV và SMYEV đã thu nhận một lượng

cây Dâu tây in vitro sạch virus của ba giống Mỹ Đá, Mỹ Hương và

4.3 Kết luận

- Với phương pháp RT-PCR, bước đầu đã chẩn đoán được trên các

mẫu Dâu tây in vitro mắc hai loại bệnh là SCV và SMYEV bằng các

cặp mồi tương ứng SC1DFW-SC1DRW và SM1DFW-SM1DRW cho các vạch của sản phẩm đặc trưng trên gel agarose Cả hai loại bệnh đều

xuất hiện trên 3 giống Dâu tây in vitro.

4.4 Kiến nghị

Trước khi nhân giống dâu hoặc bất cứ loại cây nào cần phải sử dụng phương pháp RT-PCR, điện di để phát hiện ra bệnh (nếu có) của cây giống nhằm đảm bảo nguồn giống sạch tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản xuất về sau làm hao phí tiền bạc, công sức và đưa đến tay người tiêu dùng những sản phẩm chất lượng nhất.

18

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Duy, Hà Thị Tuyết Phượng, Nguyễn Thị Thu Sương, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Bá Nam, Lê Quang Công, Bùi Mình Trí (2009) Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh

virus xoắn lá và vàng mép lá trên cây Dâu tây in vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học.

2 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Đông, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu,

Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

3 Nguyễn Thị Lan, Bùi Chí Cửu (2005) Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp và

ứng dụng Nhà xuất bản Nông nghiệp.

4 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tựnhiên; ISSN 1859–13885 Thư viện số tài lệu nội sinh

6 Tạp chí khoa học quốc tế AUG ISSN 0866-8086

7 Wang, S.Y and Galletta, G.J (1997) COMPOSITIONAL CHANGE

IN COLLETOTRICHUM (ANTHRACNOSE) INFECTED STRAWBERRY FRUIT Acta Hortic

439, 815-820 Doi: 10.17660/ActaHortic.1997.439.135

CẢM ƠN THẦY

VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE!

19