sáng t3 nhóm 7 seminar

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA KHOA HỌC SINH HỌCCHỦ ĐỀ: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR ĐỂ NHẬN DẠNG ĐẶC HIỆU CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN GIA CẦMMôn: Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh họcGVH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CHỦ ĐỀ: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR ĐỂ NHẬN DẠNG ĐẶC HIỆU CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN

GIA CẦM

Môn: Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh họcGVHD: TS Huỳnh Văn Biết

Thành viên nhóm 7:Tào Khả Nhi – 21126447

Trần Thị Hồng Phúc – 21126472

I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG PHÁP RT-PCR

I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG PHÁP RT-PCR

1 Virus cúm A/H5N1

Bệnh cúm gia cầm (H5N1) là bệnh do virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra

trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã Biến chủng virus cúm gây bệnh ở gia cầm được chia theo tính gây bệnh với mực độ độc lực khác nhau.

I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG PHÁP Real-time RT-PCR

2 Phương pháp Real-time RT-PCR

Kỹ thuật Real–time RT-PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng PCR Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra.

1 Lấy mẫu bệnh phẩm

1.1 Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên

Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột ) của gia cầm bị bệnh Trong trường hợp gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng hoặc lấy phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS, pH 7,2 đến 7,4, có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10.

II ỨNG DỤNG

1.2 Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể

Chỉ thực hiện đối với gia cầm chưa tiêm vắc xin cúm gia cầm: lấy máu của gia cầm nghi mắc cúm bằng cách sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xy lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xy lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 đến 30°C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm.

Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2°C đến 8°C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h.

II ỨNG DỤNG

2 Phát hiện kháng nguyên2.1 Xử lý mẫu

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)

Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8000 r/min trong 15s.

Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập vi rút trên tế bào, phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80 °C.

II ỨNG DỤNG

2.2.2 Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi

Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 r/min trong 15s.

Dùng pipet hút dịch trong ống chuyển sang 2 ống 1,5 mL Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập vi rút trên tế bào hoặc phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80°.

II ỨNG DỤNG

2.2 Phương pháp RT-PCR2.2.1 Chiết tách ARN

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm bằng kit thương mại RNA tổng số được tách bằng cách sử dụng tất cả biện pháp phòng ngừa an toàn cần thiết ARN thu được sau quá trình chiết tách được hòa tan trong 20 μL nước không có L nước không có RNase

II ỨNG DỤNG

2.2.2 Tiến hành phản ứng

Sử dụng 2 µl RNA được sử dụng trong 25 µL hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng Hệ thống sao chép ngược một bước (RT)-PCR với các loại mồi đặc hiệu H5N1 như sau:

Primer xuôi: 5'-ACTATGAAGAATTGAAACACCT-3' Primer ngược: 5'-GCAATGAAATTTCCATTACTCTC-3’

Chương trình PCR được cài đặt là: 60°C trong 1 phút, 42°C trong 10 phút, 50°C trong 30 phút và 94°C trong 15 phút Sau đó là 35 chu kỳ 94°C trong 30 giây, 50°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút và cuối cùng là 72°C trong 10 phút Kích thước của PCR này, sản phẩm có khối lượng 456bp và được phân giải trong agarose 1,2% gel Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp để xác nhận

II ỨNG DỤNG

2.2.3 Điện di sản phẩm RT-PCR:

Pha bột agarose với dung dịch 1xTAE , rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50°C đến 60°C), cho tiếp tidi bromua Sau đó đổ vào khay và cắm lược Để gel cứng lại trong khoảng 1 giờ, rồi rút lược ra Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di, đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di Pha loading dye với 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel Pha loading dye với mẫu (đối chứng âm và dương), đưa vào các giếng còn lại của miếng gel Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 phút đến 40 phút Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm để đọc

II ỨNG DỤNG

1 Thành lập bộ mồi PCR H5N1 mới:

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau: Phản ứng RT-PCR hiển thị vạch sản phẩm là phản ứng dương tính Phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính.

III KẾT QUẢ

2 Phát hiện cụ thể các mầm bệnh:

Hình 1 Phát hiện virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp RT-PCR

Ưu điểm

khả năng mang lại âm tính giả hơn so với các phương thức thử nghiệm khác.

Do đó hỗ trợ tốt cho bác sĩ trong việc tiên lượng tiến triển bệnh cũng như đánh giá hiệu quả điều trị.

III ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM RT-PCR

Nhược điểm

• Độ chính xác của kết quả RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào: Thời gian thu thập mẫu; loại mẫu; quá trình bảo quản, lưu trữ và xử lý mẫu.

• Kết quả âm tính giả có thể xảy ra nếu mẫu không được lấy đúng cách hoặc nếu một cá nhân được xét nghiệm quá sớm sau khi tiếp xúc với vi rút hoặc quá muộn khi nhiễm vi rút.

• Đòi hỏi cao về kỹ thuật của người lấy mẫu, kỹ thuật viên xét nghiệm và thiết bị, máy móc hiện đại.

III ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM RT-PCR