Đang tải... (xem toàn văn)
06/13-14, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic Polysacchari
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
NGUYỄN VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC
NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU
Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Một số kết quả trong luận
án này được tài trợ kinh phí từ Đề tài hợp tác quốc tế: “Polysaccharide sulfate từ tảo
nâu Việt Nam: Cấu trúc và hoạt tính sinh học”, Mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14,
thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha
Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic
Polysaccharide chiết tách từ tảo biển ở Nhật Bản và Việt Nam”, Mã số:
VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Nhật Bản và Đề tài: “Nghiên cứu
điều chế dẫn xuất polyguluronat sunphat hóa trọng lượng phân tử thấp từ nguồn rong mơ Việt Nam để ứng dụng trong dược phẩm”, Mã số: VAST06.05/12-13 mà tôi là một
trong những thành viên tham gia thực hiện và đã được Chủ nhiệm đề tài đồng ý cho phép sử dụng trong báo cáo Luận án Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào
Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019
NGUYỄN VĂN THÀNH
Trang 4
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án này,
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo khoa Sau Đại học sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho các thầy: PGS TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS TS Trần Thị Thanh Vân - Nguyên Trưởng phòng Hóa phân tích - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Bùi Minh Lý - người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền cảm hứng, định hướng nghiên cứu cho tôi trong giai đoạn đầu thực hiện Luận án này Vì lý do sức khỏe nên Thầy đã không thể tiếp tục hướng dẫn nghiên cứu
Xin chân thành cám ơn: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Chủ nhiệm đề tài quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14, VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15 và VAST06.05/12-13 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành Luận án có chất lượng
Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án này
Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng
Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Gia đình và bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu
Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019
NGUYỄN VĂN THÀNH
Trang 51.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 4
1.1.1 Giới thiệu chung về rong nâu 4
1.1.2 Một số thành phần hóa học của rong nâu 4
1.1.3 Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới 6
1.1.4 Rong nâu Việt Nam 7
1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE 9
1.2.1 Giới thiệu về alginate 9
1.2.2 Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate 10
1.2.3 Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu 13
1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 20
1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 20
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 25
1.4 ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 28 1.5 QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA ALGINATE 32
1.5.1 Lý thuyết của quá trình đông máu 32
1.5.2 Các nghiên cứu hoạt tính chống đông máu của alginate 35
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 39
2.1.1 Rong mơ nguyên liệu 39
2.1.2 Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc chất trên chuột 41
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.2.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 41
2.2.2 Các phương pháp phân tích fucoidan và sodium alginate 41
2.2.3 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 44
Trang 62.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: 44
2.2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật 44
2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống đông máu và độc tính của SGS 44
2.2.7 Phương pháp bố trí thực nghiệm 47
2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 58
2.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 59
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60
3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE 60
3.1.1 Đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở một số loài rong nâu 60
3.1.2 Xác định thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T ornata 66
3.2 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN NẤU CHIẾT SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU T ORNATA 70
3.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE 83
3.3.1 Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate 83
3.3.2 Đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T ornata 84
3.3.3 Sản xuất thử và đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate 87
3.3.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình của sodium alginate 89
3.3.5 Xác định các đặc tính cấu trúc của sodium alginate thu nhận từ rong T ornata 92 3.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 104
3.4.1 Xác định hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp 104
3.4.2 Xác định các đặc tính cấu trúc của các alginate khối lượng phân tử thấp 107
3.4.3 Khối lượng phân tử trung bình của alginate khối lượng phân tử thấp 112
3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE TÁCH CHIẾT TỪ RONG T.ORNATA VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS 115
3.5.1 Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate tách chiết từ rong nâu T ornata 115
3.5.2 Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T ornata và đánh giá các đặc tính của SGS 126
3.6 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS 131
Trang 73.6.1 Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro của SGS 131
3.6.2 Đánh giá độc tính của SGS trên chuột thí nghiệm 137
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 147
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 149
TÀI LIỆU THAM KHẢO 150
PHỤ LỤC
Trang 8DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
APTT : Activated partial thromboplastin time (Thời gian đông máu nội sinh)
cP : Centipoise (đơn vị đo độ nhớt) DS : Degree of substitution (Độ thay thế)
FT-IR : Fourrier Transformation InfraRed spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại)
G : Guluronate (guluronic acid)
GPC : Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel) IR : InfraRed spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
M : Mannuronate (mannuronic acid)
NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng
S mcclurei : Sargassum mcclurei
SMG : Sodium mannuronate - sodium guluronate
S polycystum : Sargassum polycystum
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
T ornata : Turbinaria ornata
TT : Thrombin time (Thời gian đông máu chung) v : Volume (Thể tích)
w : Weight (Khối lượng)
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thiết kế nghiên cứu độc tính của SGS 46
Bảng 2.2 Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính của SGS 46
Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T ornata 67
Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm được chọn 70
Bảng 3.3 Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I 71
Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm lượng sodium alginate 75
Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo độ nhớt sodium alginate 80
Bảng 3.6 Hệ số của phương trình hàm đa mục tiêu 81
Bảng 3.7 Kết quả thí nghiệm tối ưu hàm đa mục tiêu 82
Bảng 3.8 Trạng thái chất lượng của sodium alginate 87
Bảng 3.9 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu lý hóa của sodium alginate 88
Bảng 3.10 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của sodium alginate 88
Bảng 3.11 Kết quả phổ IR của sodium alginate từ rong nâu T ornata 93
Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong T ornata 96
Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sodium alginate từ rong T ornata 98
Bảng 3.14 Tương tác proton từ phổ 1H-1H COSY của sodium alginate từ rong Turbinaria ornata 100
Bảng 3.15 Khối lượng trung bình của chuột nhóm I (đánh giá độc tính cấp) 138
Bảng 3.16 Khối lượng trung bình của chuột nhóm II (giai đoạn hồi phục) 139
Bảng 3.17 Tổng hợp kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm I 141
Bảng 3.18 Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm II 142
Bảng 3.19 Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu 143
Bảng 3.20 Kết quả quan sát xác định khối lượng tươi của gan, lách, thận của chuột thí nghiệm 144
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Liên kết (14) glycosidic giữa các uronic 11
Hình 1.2 Cấu trúc 2 gốc uronic trong phân tử alginate 11
Hình 1.3 Độ dài trung bình giữa các uronic trong các block của alginate 11
Hình 1.4 Sự sắp xếp các block polysaccharide trong phân tử alginate 12
Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình đông máu 33
Hình 1.6 Cơ chế tạo thành phức hợp prothrombinase theo con đường nội sinh và ngoại sinh 34
Hình 2.1 Hình ảnh về rong mơ Sargassum mcclurei Setchell 39
Hình 2.2 Hình ảnh về rong mơ Sargassum polycystum C Agardh 39
Hình 2.3 Hình ảnh về rong cùi bắp Turbinaria ornata (Turner) J Agardh 39
Hình 2.4 Vị trí thu mẫu rong mơ 39
Hình 2.5 Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu của luận án 47
Hình 2.6 Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu 49
Hình 2.7 Sơ đồ tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate 50
Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate 51
Hình 2.10 Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp 52
Hình 2.10 Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa 53
Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 54
Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 54
Hình 2.13 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 55
Hình 2.14 Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate 55
Hình 2.15 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 56
Trang 11Hình 2.16 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế
Hình 3.1 Sự biến đổi hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu 60
Hình 3.2 Sự biến đổi hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu 64
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng sodium alginate thu được sau kết tủa 83
Hình 3.4 Sơ đồ quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T ornata 85
Hình 3.5 Sắc ký đồ GPC của sodium alginate 90
Hình 3.6 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium alginate 90
Hình 3.7 Phổ hồng ngoại của sodium alginate từ rong nâu T ornata 92
Hình 3.8 Phổ ESI-MS của sodium alginate từ rong nâu T ornata 93
Hình 3.9 Phổ ESI-MS của disaccharide tại m/z 369 94
Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong nâu T ornata 95
Hình 3.11 Phổ 1H -NMR của sodium alginate thu được từ rong nâu T ornata 97
Hình 3.12 Phổ COSY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 100
Hình 3.13 Phổ HSQC của sodium alginate từ rong nâu T ornata 101
Hình 3.14 Phổ HMBC của sodium alginate từ rong nâu T ornata 102
Hình 3.15 Phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 103
Hình 3.16 Tương tác của các proton trên phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 104
Hình 3.17 Hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp 105
Hình 3.18 Phổ 13C-NMR của sodium guluronate 107
Hình 3.19 Phổ 1H-NMR của sodium guluronate 109
Hình 3.20 Phổ 13C-NMR của sodium polymannuronate 110
Trang 12Hình 3.21 Phổ 1H-NMR của sodium polymannuronate 111
Hình 3.22 Sắc ký đồ của GPC của sodium guluronate 112
Hình 3.23 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium guluronate 112
Hình 3.24 Sắc ký đồ của GPC của sodium mannuronate 114
Hình 3.25 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium mannuronate 114
Hình 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 116
Hình 3.27 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 118
Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 119
Hình 3.29 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 121
Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 122
Hình 3.31 Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ NaNO2/SG đến độ thay thế của SGS 123
Hình 3.32 Ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 125
Hình 3.33 Quy trình điều chế sodium guluronate sulfate 127
Hình 3.34 Phổ FT-IR của (a) sodium guluronate và (b) sodium guluronate sulfate 129
Hình 3.35 Sắc ký đồ GPC của SGS 130
Hình 3.36 Sự phân bố khối lượng phân tử của SGS 130
Hình 3.37 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến thời gian đông máu 132
Hình 3.38 Ảnh hưởng của nồng độ SGS có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa đến thời gian đông máu 134
Hình 3.39 Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống SGS 145
Trang 13TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm
thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu
Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105
Người hướng dẫn: 1 PGS TS Vũ Ngọc Bội
2 PGS TS Trần Thị Thanh Vân
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung:
Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất alginate và alginate khối lượng phân tử thấp từ rong mơ:
1) Luận án đã xác định được 3 loài rong mơ S mcclurei, S polycystum và T ornata có hàm lượng fucoidan cao nhất khi thu hoạch vào các tháng 4 và tháng 5 Ngoài ra, 2 loài rong nâu S mcclurei và T ornata có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 4 và loài S polycystum có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 5 Trong số 3 loài rong đã nghiên cứu thì T ornata là loài thích hợp dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất đồng thời cả fucoidan và alginate
2) Luận án đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp là 11 (điều chỉnh bằng Na2CO3), nhiệt độ nấu chiết thích hợp là 59oC và thời gian nấu chiết là 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết là 70% Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T ornata có độ tinh sạch cao, có tỷ lệ M/G là 1,06 và có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình là 1037, chỉ số đa phân tán là 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93% Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học và vi sinh vật theo quy định hiện hành của Bộ Y tế
3) Luận án đã điều chế được sodium alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân bằng acid Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu được bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% và sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08% Sodium guluronate và sodium mannuronate thu được đều có độ tinh sạch cao, có khối lượng