Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜ I CẢM ƠN Trướ c hế t, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thà nh và sâu sắ c tớ i TS. Trầ n Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN ng dng – Việ n Công nghệ Sinh họ c đã tậ n tì nh hướ ng dẫ n và dì u dắ t tôi trong quá trì nh hoà n thà nh luậ n văn. Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010. Tôi xin chân thành cả m ơn lã nh đạ o Việ n Công nghệ sinh họ c và cá c thầ y cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, Trườ ng Đạ i họ c Sư phạ m Thá i Nguyên , Đạ i học Thái Nguyên đ ging dạy và tạo điểu kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bà y tỏ biế t ơn tớ i toà n thể cá c cá n bộ Phò ng Công nghệ ADN Ứ ng dng, Việ n Công nghệ sinh họ c , đặ c biệ t là PGS.TS. Nông Văn Hả i – Trưở ng phòng Công nghệ ADN ng dng , KS. Hà Hng Hnh đã giú p đỡ và chỉ bả o tôi rấ t tậ n tì nh trong suố t thờ i gian tôi thự c tậ p và thự c hiệ n luậ n văn vừ a qua. Tôi xin chân thành cm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đ cung cấp nguyên liệu bèo tấm cho luận văn. Cuố i cù ng, tôi xin dà nh cho gia đình và bạ n bè lò ng biế t ơn sâu sắ c vì sự quan tâm, độ ng viên và gó p ý cho tôi trong suố t quá trì nh họ c tậ p và hoàn thà nh khóa luận. Học viên Trầ n Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Trần Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHƢ̃ NG TƢ̀ VIẾ T TẮ T Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặ p bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide v/p vò ng/pht Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 8 1.2 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 9 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 và pJETSpUbipin6R 43 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hoa của Lemna gibba 5 1.2 Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự 5 1.3 Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza 6 1.4 Sơ đồ cấu trc gen điển hình 11 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật 14 2.1 1. Lemna aequinoctialis DB1; 2. Spirodela polyrrhiza DB2 21 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 33 3.2 Sơ đồ cấu trc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) và vị trí các mồi. 34 3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 36 3.4 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 38 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 39 3.6 Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter 40 3.7 Sơ đồ cấu trc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi. 44 3.8 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 với dự đoán các vùng chức năng promoter 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan Những từ viết tắt Danh mc các bng Danh mc các hình Mc lc Trang MỞ ĐẦ U 1 Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U 3 1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 3 1.1.1. Phân bố của bèo tấm 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm 3 1.1.3. Cây phân loại bèo tấm 5 1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm 5 1.1.5. Hệ gen của bèo tấm 7 1.1.6. Giá trị dinh dưỡng 8 1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học 9 1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 10 1.2.1. Cấu trc gen sinh vật 10 1.2.2. Cấu trc promoter 11 1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter 13 1.2.4. Phân loại promoter 13 1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 15 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 21 2.1. Nguyên liệu 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose 24 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24 2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 2.2.5. Xác định trình tự gen 30 2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 30 Chƣơng 3. KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N 31 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm 31 3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza 33 3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 33 3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 38 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 39 3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis 43 3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.2 44 3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 46 3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 48 KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng không mong muốn. Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được các hạn chế đó. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng. Công nghệ gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản xuất các loại thuốc cần thiết cho con người như vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin và các loại thuốc chữa bệnh khác [3]. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh những gen có giá trị mã hoá cho các tính trạng mong muốn, các promoter cần thiết cho sự biểu hiện của các gen cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật. Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trc của tất cả các gen, khởi đầu cho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen. Việc phân lập các promoter biểu hiện gen hữu hiệu trên cây trồng, đặc biệt là promoter đặc hiệu cho từng loại cây, biểu hiện trong các loại mô tế bào khác nhau ngày càng được quan tâm đến. Nhiều promoter từ các gen ở thực vật được phân lập trong số đó phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter của gen mã hóa sucrose synthase [4]. Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có [...]... aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2; 2 Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 bằng PCR; 3 Tách dòng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chúng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 với các nội dung chính sau đây: 1 Hoàn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela. .. manitol Các chất kích thích sinh trưởng, đường và hàm lượng của chúng được sử dụng khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong hệ thống tái sinh và ở mỗi loài bèo [40] 1.3.1.2 Các nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Kể từ khi có sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, đã có các nghiên cứu phân lập và xác định đặc tính của hệ gen bèo tấm Đã có nhiều những nghiên cứu phân lập và tách dòng gen trên... promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna minor đã phân lập, nghiên cứu và hoàn thiện ở Mỹ, đã được đánh giá có hiệu quả cao hơn và đăng ký thành patent [24] Ở Việt nam có 3 loài bèo tấm được phát hiện thấy là Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza và Wolffia globosa ở nhiều vùng khác nhau Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm Việt Nam phục vụ cho... mạnh để điều khiển quá trình biểu hiện Hiện nay đã có nhiều loại promoter được phân lập và sử dụng, trong đó promoter ubiquitin là một đối tượng được quan tâm nghiên cứu do nó có khả năng làm tăng mạnh mẽ quá trình biểu hiện gen từ mức độ phiên mã cho tới dịch mã [41] Bèo tấm là loài sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh và hơn hết là rất phổ biến ở Việt Nam, do đó việc phân lập promoter từ bèo tấm là... trên bèo tấm đã cho thấy khả năng thu cây chuyển gen bền vững từ phương pháp này [27], [57] Hướng nghiên cứu sử dụng bèo tấm để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn, thực vật, động vật và người ngày càng được xúc tiến mạnh Các hệ thống vector chuyển gen sử dụng các promoter được phân lập từ bèo tấm được đặc biệt chú ý đến Ngoài promoter SSU5B, NPR1, đoạn điều khiển của gen ubiquitin. .. phần và hàm lượng Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2… và các amino acid không thay thế trừ methionine Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao nhất Hầu hết các loài bèo tấm có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy [37] Trong thời gian gần đây, đã có các nghiên cứu sử dụng bèo tấm. .. đã được phân lập từ một số loài bèo tấm, bước đầu được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen và chứng minh là có hiệu quả cao [24] 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Tại Việt Nam, các nghiên cứu về bèo tấm còn hết sức hạn chế Các nghiên cứu ban đầu chủ yếu nhằm mục đích sử dụng cho chăn nuôi và mới chỉ dừng lại ở những khảo sát cơ bản nhất về các đặc tính sinh lý, sinh hóa của một số loài bèo đặc... hạt ngoài và vỏ hạt trong, nội nhũ và phôi Vỏ ngoài gồm 2 – 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối hạt [36] 1.1.5 Hệ gen của bèo tấm Các nghiên cứu đối với hệ gen bèo tấm được tiến hành từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước cho đến ngày nay Các kết quả cho thấy, bộ gen bèo tấm giống với bộ gen của thực vật nói chung, bao gồm gen nhân và gen ngoài nhân Bộ gen của... http://www.Lrc-tnu.edu.vn Các loài bèo tấm đã được sử dụng làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp với nhiều thuận lợi so với các hệ thống biểu hiện gen và nuôi cấy tế bào hiện tại Có tới 12 loại protein đã được biểu hiện thành công trên hệ thống Lemna System TM, gồm các đoạn peptide nhỏ, mảnh Fab (Fabs), các kháng thể đơn dòng (mAbs) và các enzyme đa tiểu phần lớn… Lemna SystemTM là hệ thống biểu hiện protein . THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH. TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền. xin đăng ký thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 với các nội dung chính