TAO DOØNG VAØ BIEÅU HIEÄN GEN MAÕ HOÙA KHAÙNG NGUYEÂN P42 TÖØMYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG ESCHERICHIA COLI (BL21)

Kỹ Thuật - Công Nghệ - Y khoa - Dược - Y dược - Sinh học HOÄI THUÙ Y VIEÄT NAM VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION Taäp XXVIII Soá 9 - 2021 JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT ISSN 1859 - 4751 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT THUÙ Y JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY TAÄP XXVIII. SOÁ 9 - 2021 VOL. XXVIII. No9 - 2021 HOÄI THUÙ Y VIEÄT NAM VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT THUÙ Y TAÏP CHÍ RA 8 KYØNAÊM CUÛA HOÄI THUÙ Y VIEÄT NAM Tổng biên tập: GS.TS. Ñaäu Ngoïc Haøo Phó TBT: PGS.TS. Traàn Ñình Töø, TS. Nguyeãn Vaên Caûm Thư ký tòa soạn: TS. Nguyeãn Vaên Caûm Hội đồng biên tập: Ñòa chæ giao dòch: TAÏP CHÍ KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT THUÙ Y 86 Tröôøng Chinh - Ñoáng Ña - Haø Noäi ÑT: 024 3629 0861 Fax: 024 3868 7731 Email: tckhktthuy gmail.com Website: www.hoithuyvietnam.org.vn Taøi khoaûn: 1300 201 220282 Ngaân haøng Noâng nghieäp vaø PTNT - Chi nhaùnh Thaêng Long ISSN 1859 4751 Giấy phép xuất bản số 301GP - BVHTT ngày 2372001 của Bộ Văn hóa và Thông tin In tại Công ty Cổ phần Khoa học và Công nghệ Hoàng Quốc Việt In xong và nộp lưu chiểu tháng 82021 PGS.TS. Đặng Xuân Bình, TS. Nguyễn Công Dân, TS. Nguyễn Tiến Dũng, TS. Trần Xuân Hạnh, PGS.TS. Phạm Khắc Hiếu, TS. Nguyễn Văn Hưng, PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, GS.TS. Nguyễn Thị Lan, TS. Võ Thị Hải Lê, TS. Nguyễn Văn Long, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam, PGS.TS. Lê Văn Năm, PGS. TS. Phạm Hồng Ngân, PGS.TS. Võ Văn Nha, TS. Phan Thị Hồng Phúc, PGS.TS. Lê Quang Thông, TS. Nguyễn Tùng, GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên, TS. Ngô Chung Thủy 3KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 MUÏC LUÏC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGUYỄN THANH THỦY, ĐINH THỊ BÍCH LÂN, LÊ VIẾT QUÂN, PHÙNG THĂNG LONG Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên P42 từ Mycoplasma hyopneumoniae trong Escherichia coli (BL21) Avs 29 NGUYỄN MINH THƯƠNG, NGUYỄN KHÁNH THUẬN, TRẦN QUỐC PHI, LÝ THỊ LIÊN KHAI Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm sinh học lên sự tăng trưởng và điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella typhimurium trên gà nòi lai Avs 20 LÊ HỒNG NGHỊ, NGUYỄN KHÁNH THUẬN, TRẦN THỊ LỆ TRIỆU, LÝ THỊ LIÊN KHAI, TRẦN NGỌC BÍCH Sự lưu hành và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O45, O121, O157 trên bò tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre Avs12 VÕ THÀNH THÌN, ĐẶNG VĂN TUẤN, LÊ ĐÌNH HẢI Một số đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi khuẩn Riemerella anatipestifer phân lập từ vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết ở Việt Nam Avs 28 NGUYỄN KHÁNH THUẬN, LÂM NGỌC ĐIỆP, TIÊU HỒNG PHÚC, LÝ THỊ LIÊN KHAI Sự lưu hành các chủng phổ biến và gen độc lực STX2, EAE của vi khuẩn Escherichia coli phân lập trên gà tại huện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long Avs ? NGUYỄN ĐỨC TÂN, NGUYỄN THỊ THẮM, LÊ LẬP Nghiên cứu sản xuất vacxin giải độc tố (CLOSTOXOI I.VAC) phòng bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra trên trâu, bò, dê, cừu Avs 156 CAQAEWFDWEGEHTH (chưa có tên tác giả) Sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ của bệnh viêm đường hô hấp mãn tính (CRD) trên gà nuôi tập trung tại Thừa Thiên Huế Asv 07 NGÔ THỊ NGỌC TRÂM, NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN, 1NGUYỄN QUANG HỢP, NGUYỄN MINH NAM, ĐỖ TIẾN DUY, Đặc điểm di truyền của virus dịch tả heo châu Phi từ các ổ dịch tại một số tỉnh phía Nam từ 2019 đến 2020 Avs 77 HUỲNH NGỌC TRANG, VÕ BÃO DUY, PHẠM HUỲNH KHIẾT TÂM, HỒ THỊ VIỆT THU Khảo sát miễn dịch sau tiêm phòng vacxin dại trên đàn chó ở huyện Phú Tân, tỉnh An Giang ĐẶNG THỊ MAI LAN, ĐỖ ĐỨC THÀNH, ĐOÀN THỊ THANH HƯƠNG Giải mã kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distember virus gây bệnh Care ở chó tại Hà Nội NGUYỄN VĂN PHƯƠNG, BÙI KHÁNH LINH, NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN, NGUYỄN THỊ HỒNG CHIÊN, NGUYỄN THỊ NHIÊN, DƯƠNG ĐỨC HIẾU, NGUYỄN HUYỀN THƯƠNG Tình hình mắc bệnh ghẻ tai do Otodectes cynotis gây ra ở mèo và thử nghiệm phác đồ điều trị TRAO ĐỔI KHKT - HOẠT ĐỘNG NGÀNH NGUYỄN XUÂN HÒA, NGUYỄN VĂN CHÀO, PHẠM HỒNG SƠN Hoạt động nghiên cứu khoa học Bộ môn Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Huế giai đoạn 2015-2020 5 13 21 29 39 48 56 67 76 81 90 97 4KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 CONTENTS SCIENTIFIC RESEARCH NGUYEN NGOC HAI, NGUYEN THI NGOC, NGUYEN THI KIM YEN, NGUYEN THI PHUONG BINH, TRAN HOANG ANH THU, NGUYEN TRUNG QUAN African swine fever virus on abortus and false negative result of realtime PCR LE THI XIEM, CAO VAN HUNG, LAI VAN DAM, NGO THI THU THAO, PHAM HONG TRANG, LAI THI LAN HUONG, BUI TRAN ANH DAO, TO LONG THANH Evaluation of inactivation efficacy using Binary Ethylenimine (BEI) for Foot-and-mouth disease commercial vaccine production CAN XUAN MINH, PHAM THI HUE, BUI NGOC ANH, PHAM THI NGA, NGUYEN THANH HOA, NGO THI MINH QUYEN, HOANG THI THUY, NGUYEN HOANG GIANG, HOANG VIET HUNG, DAO DUY TUNG, BUI NGHIA VUONG Phân tích phả hệ di truyền và đặc điểm bộ gene của các chủng virus cúm gia cầm H5N6 phân lập tại Việt Nam trong năm 2014-2015 VU THI THU TRA, PHAM HONG NGAN, LAI THI LAN HUONG, BUI THI HUONG, HOANG ANH HAO, PHAM THANH LAN, NGUYEN PHUONG THUY, NGUYEN THI TRAM Assessment of microbiological contaminationsin feeds at chicken farms in Dong Anh, Hanoi VO PHONG VU ANH TUAN Isolation and antimicrobial susceptibility of pasteurella multocida from infected or suspected chickens of pasteurellosis PHUNG THANG LONG, LE VIET QUAN, DONG HUU RIN, LE QUOC VIET, DANG THI HUONG, NGUYEN THI THU HIEN, DINH THI BICH LAN Cloning and expression of gene encoding p102 antigen of mycoplasma hyopneumoniae in E. coli bl21(de3) NGUYEN THI THANH HA, NGUYEN THI THAO, NGUYEN VAN THANH, NGUYEN THANH HAI A study to investigate the use of pharmaceutical products derived from extracts of Rhodomyrtus tomentosa and Lactuca indica L. in the prevention and treatment of chicken diarrhea PHAM MINH HANG, PHAM THI THU THUY, NGUYEN VIET KHONG Isolation and characterization of lactobacilli strains from kimchi for development of probiotics NGUYEN THI KIM LAN,, NGUYEN THI NGAN, PHAN THI HONG PHUC, PHAM DIEU THUY, DUONG THI HONG DUYEN, TRAN NHAT THANG, DO THI LAN PHUONG, NGUYEN HOANG ANH, NGUYEN THI NGOC HA Study on prevalence of swine cysticercosis in Bac Ninh province FOLLOWING - UP FORMATION ĐANG THI XUAN THIEP, VO THI TRA AN Caùc phöông phaùp ñaùnh giaù möùc ñoä maãn caûm SCIENTIFIC AND TECHNICAL EXCHANGE - PROFESSIONAL ACTIVITIES NGUYEN NGOC SON Gieát moå taäp trung, giaûi phaùp hieäu quaû ñaûm baûo an toaøn thöïc phaåm taïi haø noäi 5 12 19 26 37 46 55 60 68 78 82 91 97 100 5KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 TAÏO DOØNG VAØ BIEÅU HIEÄN GEN MAÕ HOÙA KHAÙNG NGUYEÂN P42 TÖØMYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG ESCHERICHIA COLI (BL21) Nguyễn Thanh Thủy1, Đinh Thị Bích Lân1, Lê Viết Quân2, Phùng Thăng Long1 Email: thuhuonghuaf.edu.vn TÓM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên P42 của Mycoplasma hyopneumoniae phân lập từ mẫu phổi của lợn thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Gene mã hóa cho kháng nguyên P42 được tạo dòng và biểu hiện bởi vector pET200D- TOPO trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3). Gene mã hóa kháng nguyên P42 đã được tạo dòng có chiều dài 1119 bp, mã hóa một chuỗi polypeptide dài 372 axit amin, và tương đồng 100 so với trình tự chuỗi polypeptide của Mycoplasma hyopneumoniae 7448 (từ vị trí amino acid thứ 229 đến 600) đã được công bố trên GenBank (mã số AAZ53444.1). Kết quả điện di trên SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có khối lượng phân tử khoảng 44 kDa. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có kết hợp đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh của lợn nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae. Từ khóa: Mycoplasma hyopneumoniae, P 42, tạo dòng, biểu hiện, kháng nguyên tái tổ hợp Cloning and expression of gene encoding p42 antigen from Mycoplasma hyopneumoniae in Escherichia coli (bl21) Nguyen Thanh Thuy, Dinh Thi Bich Lan, Le Viet Quan, Phung Thang Long SUMMARY In this study, we successfully cloned and expressed of gene encoding P42 antigen of Mycoplasma hyopneumoniae isolated from lung samples from pigs raised in Thua Thien Hue province, Vietnam. The gene encoding P42 antigen was cloned and expressed with vector pET200D-TOPO in Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The cloned fragment of gene encoding P42 antigen has a length of 1119 bp, encoding a polypeptide chain with 372 amino acid residues, and 100 similarity to the polypeptide chain of Mycoplasma hyopneumoniae 7448 in GenBank (accession number: AAZ53444.1). Results of SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular weight of 6xHis-P42 recombinant protein is about 44 kDa. Results of testing the specificity of the recombinant protein showed that the recombinant protein 6xHis-P42 had a specific linkage with antibodies in the serum of pigs infected with Mycoplasma hyopneumoniae. Keywords: Mycoplasma hyopneumoniae, P42, cloning, expression, recombinant protein 1. Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế 2. Học viên Thạc sĩ Đại học Okayama, Nhật Bản 6KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) là vi khuẩn gây bệnh suyễn (hay còn gọi là bệnh viêm phổi địa phương) trên lợn. Đây là một bệnh hô hấp mãn tính ảnh hưởng đến lợn trên toàn thế giới 3, 11. Đặc trưng của bệnh là tỉ lệ mắc bệnh rất cao, nhưng tỉ lệ chết thấp. Tuy nhiên, thiệt hại bệnh gây ra rất lớn là do: lợn bị bệnh thường còi cọc, chậm lớn, lớn không đồng đều, tiêu tốn thức ăn cao, thời gian vỗ béo kéo dài dẫn đến giảm năng suất thịt và lợi nhuận 1. Mặt khác, M. hyopneumoniae tấn công vào đường hô hấp trên của lợn, làm tổn thương hệ thống lông rung của đường hô hấp, thúc đẩy quá trình xâm nhập và tạo điều kiện cho sự kết hợp của M. hyopneumoniae với các loại vi khuẩn khác 2. Bệnh có thể chẩn đoán sơ bộ căn cứ vào một số triệu chứng và bệnh tích đặc trưng, tuy nhiên chẩn đoán trong phòng thí nghiệm để xác định M. hyopneumoniae mới thực sự có ý nghĩa trong giám sát dịch bệnh. Hiện nay, tiêm chủng được xem là chiến lược tiết kiệm chi phí nhất để kiểm soát và phòng ngừa căn bệnh này 7. Các loại vaccine bất hoạt hiện có làm giảm các tổn thương phổi và các dấu hiệu lâm sàng cho lợn con được tiêm chủng, cải thiện tăng trọng hàng ngày và hệ số chuyển hóa thức ăn, nhưng các vaccine này chỉ cung cấp được sự bảo hộ một phần và không ngăn chặn được sự xâm nhập của M. hyopneumoniae vào trong phổi; cũng như chi phí sản xuất vaccine này rất cao do quá trình nuôi cấy in vitro M. hyopneumoniae rất phức tạp 3, 10. Do đó, việc nghiên cứu các vaccine mới hiệu quả và an toàn đang được tích cực tiến hành, đặc biệt là vaccine tiểu đơn vị và vaccine DNA tái tổ hợp 9, 11. Trong một nghiên cứu trước đây, khi so sánh trình tự nucleotide cho thấy gen mã hóa P42 có thể là một phần của gen mã hóa P65. Phân tích sâu hơn đã chứng minh rằng P42 thực sự là một protein shock nhiệt biểu hiện với số lượng lớn, được phơi bày trên bề mặt mầm bệnh và liên quan đến cơ chế sinh bệnh của M. hyopneumoniae 5. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng P42 có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch cao, có thể ngăn chặn sự phát triển của M. hyopneumoniae và là ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vaccine tái tổ hợp 4, 5, 6, 11. Nghiên cứu của Galli và cộng sự (2012) đã kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch ở chuột đối với các kháng nguyên tái tổ hợp P37, P42, P46 và P95 từ M. hyopneumoniae. Kết quả ELISA cho thấy huyết thanh từ chuột được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp P42 có khả năng liên kết đặc hiệu với protein nguyên thể từ M. hyopneumoniae cao nhất. Ngoài ra, kháng nguyên tái tổ hợp P42 cũng kích thích sản sinh IgG2a và INF khi được tiêm vào cơ thể chuột. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất kháng nguyên P42 tái tổ hợp, nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu phát triển vaccine hoặc kháng thể dùng trong phòng và trị bệnh do M. hyopneumoniae gây ra ở lợn tại Việt Nam. II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm M. hyopneumoniae. - Vector pET200D-TOPO (Invitrogen), chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). - QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic), Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline), ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific). 2.2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42 từ các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm M. hyopneumoniae. - Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên P42 - Biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên P42 - Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 2.3. Phương pháp nghiên cứu 7KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42 Các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm M. hyopneumoniae được thu thập từ các đàn lợn nuôi trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. DNA tổng số được tách chiết và tinh sạch từ dịch nuôi tăng sinh vi khuẩn có trong mẫu phổi bằng Kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), và được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế trong nghiên cứu của Galli và cộng sự 6: - Mồi xuôi P42F: 5’-CACCATGGCGCTTA- CAAGACTTAA-3’ - Mồi ngược P42R: 5’-TGATTAATCCT- GCTTGATTTCAGCAT-3’ Thành phần phản ứng PCR gồm có 1 μL DNA tổng số (30 ng), 1 μL mồi xuôi P42F (10 pmolμL), 1 μL mồi ngược P42R (10 pmolμL), 5 μL đệm PCR 10X, 1 μL dNTP (10 pmolμL), 1 μL Enzyme VELOCITY DNA Polymerase (5 UμL), nước cất vô trùng vừa đủ 50 μL. PCR được thực hiện với chu trình luân nhiệt như sau: biến tính genome 95°C5 phút, tiếp đến là 30 chu kỳ: 95°C30 giây, 50°C30 giây và 72°C60 giây, cuối cùng là 72°C10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di agarose gel 1 với thuốc nhuộm ethidium bromide (0,5 μgl). Phương pháp tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên P42 Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng EZ- 10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic) được gắn vào vector pET200D- TOPO với thành phần phản ứng gắn bao gồm 2 μL sản phẩm PCR sau tinh sạch (20 ng), 1 μL vector pET200D-TOPO (20 ngμL), 1 μL dung dịch muối, nước cất vô trùng để đạt thể tích gắn là 6 μL. Trộn nhẹ và ủ ở 25°C trong 60 phút; sản phẩm phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp được chọn lọc bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu P42 và cặp mồi T7 (T7F: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3´ và T7R: 5´-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3´) được thiết kế sẵn trên vector pET200D-TOPO. Vector tái tổ hợp pET200P42 được tách bằng Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline) và gửi đi giải trình tự nucleotide tại Công ty 1st BASE (Malaysia). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng với trình tự đã được công bố trên GenBank. Phương pháp biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên P42 trong E. coli BL21 (DE3) Các tế bào E. coli BL21 (DE3) có chứa vector biểu hiện mang gene mã hóa kháng nguyên P42 được nuôi trong 50 mL môi trường YJ có bổ sung 100 μgmL kanamycin ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòngphút. Khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,8 thì bổ sung 40 μL chất cảm ứng IPTG 1M (Bio-Rad) để đạt nồng độ 0,8 mM và tiếp tục nuôi ở 30oC với tốc độ lắc 150 vòng phút trong 8 giờ. Sau đó, sinh khối được thu bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 6000 vòng phút trong 10 phút và tách chiết protein tổng số bằng cách tái huyền phù tế bào trong đệm TNE (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA), 1 Triton X-100, 0,001 mgmL lysozyme, ủ trong đá 60 phút có lắc, sau đó xử lý với sóng siêu âm trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòngphút trong 10 phút để thu lấy protein thể dịch. Tiếp tục hòa tan phần kết tủa với dung dịch urea 8 M, ủ ở 30ºC trong 1 giờ, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòngphút trong 10 phút để thu lấy protein trong thể vùi. Protein dung hợp 6xHis-P42 được tinh sạch từ protein tổng số bằng ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sự biểu hiện protein của đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 trong E. coli BL21 (DE3) được đánh giá bằng phương pháp điện di SDS- PAGE. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 8KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 được xác định bằng phản ứng ELISA gián tiếp giữa huyết thanh lợn với kháng nguyên phủ đĩa là kháng nguyên tái tổ hợp P42 (đã được tinh sạch theo phương pháp được nêu ở trên). Có tất cả sáu mẫu huyết thanh của hai nhóm lợn được thu thập: 3 mẫu huyết thanh của lợn không bị nhiễm M. hyopneumoniae; 3 mẫu huyết thanh của lợn bị nhiễm M. hyopneumoniae. Hai nhóm lợn này được xác định dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 16S rRNA của M. hyopneumoniae 8. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 của M. hyopneumoniae Sau khi tách DNA tổng số của các mẫu mô phổi, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42. Kết quả điện di sản phẩm (hình 1) cho thấy các băng DNA được khuếch đại có kích thước khoảng 1110 bp. Sản phẩm PCR cho một băng duy nhất, nồng độ cao, sáng và rõ nét. Hình 1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline), 1 và 2: Sản phẩm PCR gen mã hóa kháng nguyên P42 phân lập từ các mẫu DNA khác nhau 3.2. Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên P42 của M. hyopneumoniae Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose 1 và được gắn vào vector pET200D-TOPO. Tiến hành biến nạp sản phẩm gắn chứa plasmid pET200P42 vào tế bào E. coli BL21, chọn lọc trên môi trường LB agar có bổ sung ampicillin. Sự hiện diện của đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 trong tế bào E. coli BL21 được kiểm tra bằng phản ứng PCR trực tiếp với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 và cặp mồi T7 của vector pET200D-TOPO. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 2 cho thấy xuất hiện băng DNA tương tự với kích thước phân lập ban đầu (khoảng 1110 bp) đối với cặp mồi đặc hiệu và băng DNA có kích thước xấp xỉ khoảng 1300 bp đối với cặp mồi T7 (bao gồm kích thước của gen và một đoạn khoảng 200 bp nằm trên vector pET200D-TOPO do cặp primer T7 khuếch đại). Điều này chứng tỏ đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 đã được tạo dòng thành công vào vector pET200D- TOPO trong tế bào E. coli BL21. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của plasmid tái tổ hợp pET200P42 trong tế bào E. coli BL21 M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline). 1, 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi T7. 2, 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 Kết quả giải trình tự cho thấy đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 phân lập được có độ dài 1119 bp, có độ tương đồng cao (99) với trình tự gen mhp0067 của Mycoplasma hyopneumoniae 9KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 P42 1 ATGGCGCTTACAAGACTTAAAGAAGAGGCTGAAAAAACCAAAATTAATCTTTCAAATCAA 60 AE017244.1 88523 ATGGCGCTTACAAGACTTAAAGAAGAGGCTGAAAAAACCAAAATTAATCTTTCAAATCAA 88582 P42 61 AGTGTTTCTACAGTTTCTCTACCATTTTTAGGAATGGGCAAAAACGGGCCGATTAACGTT 120 AE017244.1 88583 AGTGTTTCTACAGTTTCTCTACCATTTTTAGGAATGGGCAAAAACGGGCCGATTAACGTT 88642 P42 121 GAACTTGAACTTAAAAGATCAGAATTTGAAAAAATGACTGCCCATTTAATCGATAGAACT 180 AE017244.1 88643 GAACTTGAACTTAAAAGATCAGAATTTGAAAAAATGACTGCCCATTTAATCGATAGAACT 88702 P42 181 CGCAAACCAATTGTTGATGCTCTAAAACAAGCAAAAATTGAGGCTTCAGATCTTGATGAA 240 AE017244.1 88703 CGCAAACCAATTGTTGATGCTCTAAAACAAGCAAAAATTGAGGCTTCAGATCTTGATGAA 88762 P42 241 GTTCTCCTTGTAGGTGGATCAACAAGAATGCCAGCTGTTCAGTCAATGATTGAGCATACT 300 AE017244.1 88763 GTTCTCCTTGTAGGTGGATCAACAAGAATGCCAGCTGTTCAGTCAATGATTGAGCATACT 88822 P42 301 TTAAATAAAAAGCCAAATCGTTCAATTAATCCTGATGAGGTAGTCGCAATTGGTGCTGCA 360 AE017244.1 88823 TTAAATAAAAAGCCAAATCGTTCAATTAATCCTGATGAAGTAGTCGCAATTGGTGCTGCA 88882 P42 361 ATTCAAGGGGGGGTTCTAGCTGGAGAGATCAGTGATGTTCTACTTTTAGATGTTACTCCT 420 AE017244.1 88883 ATTCAAGGGGGGGTTCTAGCTGGAGAGATCAGCGATGTTCTACTTTTAGATGTTACTCCT 88942 P42 421 TTAACTTTAGGAATTGAAACTTTAGGTGGAATTGCAACACCTTTGATTCCAAGAAATACA 480 AE017244.1 88943 TTAACTTTAGGAATTGAAACTTTAGGTGGAATTGCAACACCTTTGATTCCAAGAAATACA 89002 P42 481 ACAATTCCGGTAACAAAATCACAAATTTTCTCAACAGCTGAGGATAATCAAACCGAAGTA 540 AE017244.1 89003 ACAATTCCGGTAACAAAATCACAAATTTTCTCAACAGCTGAGGATAATCAAACCGAAGTA 89062 P42 541 ACAATTTCTGTTGTCCAAGGTGAACGTCAACTTGCAGCGGATAATAAAATGTTAGGTCGC 600 AE017244.1 89063 ACAATTTCTGTTGTCCAAGGTGAACGTCAACTTGCAGCGGATAATAAAATGTTAGGTCGC 89122 P42 601 TTTAATTTATCAGGAATTGAAGCTGCTCCACGAGGTCTTCCCCAGATTGAAGTTAGTTTT 660 AE017244.1 89123 TTTAATTTATCAGGAATTGAAGCTGCTCCACGAGGTCTTCCCCAGATTGAAGTTAGTTTT 89182 P42 661 TCAATTGATGTCAACGGGATTACAACGGTTTCAGCAAAAGATaaaaaaaCCGGCAAAGAA 720 AE017244.1 89183 TCAATTGATGTCAACGGGATTACAACGGTTTCAGCAAAAGATAAAAAAACCGGCAAAGAA 89242 P42 721 CAAACAATTACAATTAAAAATACTTCAACTTTATCAGAAGAAGAAATTAATAAGATGATT 780 AE017244.1 89243 CAAACAATTACAATTAAAAATACTTCAACTTTATCAGAAGAAGAAATTAATAAGATGATT 89302 P42 781 CAGGAAGCCGAAGAAAATCGTGAAGCTGATGCTCTTAAAAAAGACAAAATCGAGACAACA 840 AE017244.1 89303 CAGGAAGCCGAAGAAAATCGTGAAGCTGATGCTCTTAAAAAAGACAAAATCGAGACAACA 89362 P42 841 GTTCGTGCCGAAGGGCTTATTAATCAACTTGAGAAATCAATAACTGATCAAGGTGAAAAA 900 AE017244.1 89363 GTTCGTGCCGAAGGGCTTATTAATCAACTTGAGAAATCAATAACTGATCAAGGTGAAAAA 89422 P42 901 ATTGATCCAAAACAAAAAGAATTACTTGAAAAACAGATTCAAGAATTAAAAGATCTTCTA 960 AE017244.1 89423 ATTGATCCAAAACAAAAAGAATTACTTGAAAAACAAATTCAAGAATTAAAAGATCTTCTA 89482 P42 961 AAAGAAGAAAAAACTGACGAATTAAAATTAAAATTAGACCAAATTGAAGCAGCTGCCCAA 1020 AE017244.1 89483 AAAGAAGAAAAAACTGACGAATTAAAATTAAAATTAGACCAAATTGAAGCAGCTGCCCAA 89542 P42 1021 TCTTTTGCGCAGGCAACCGCGCAGCAAGCAAATACATCTGAATCTGATCCAAAAGCTGAT 1080 AE017244.1 89543 TCTTTTGCGCAGGCAACCGCGCAGCAAGCAAATACATCTGAATCTGATCCAAAAGCTGAT 89602 P42 1081 GATTCAAACACAATTGATGCTGAAATCAAGCAGGATTAA 1119 AE017244.1 89603 GATTCAAACACAATTGATGCTGAAATCAAGCAGGATTAA 89641 Hình 3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 với trình tự gen mhp0067 của M. hyopneumoniae 7448 (AE017244.1) P42 1 MALTRLKEEAEKTKINLSNQSVSTVSLPFLGMGKNGPINVELELKRSEFEKMTAHLIDRT 60 AAZ53444.1 229 MALTRLKEEAEKTKINLSNQSVSTVSLPFLGMGKNGPINVELELKRSEFEKMTAHLIDRT 288 P42 61 RKPIVDALKQAKIEASDLDEVLLVGGSTRMPAVQSMIEHTLNKKPNRSINPDEVVAIGAA 120 AAZ53444.1 289 RKPIVDALKQAKIEASDLDEVLLVGGSTRMPAVQSMIEHTLNKKPNRSINPDEVVAIGAA 348 P42 121 IQGGVLAGEISDVLLLDVTPLTLGIETLGGIATPLIPRNTTIPVTKSQIFSTAEDNQTEV 180 AAZ53444.1 349 IQGGVLAGEISDVLLLDVTPLTLGIETLGGIATPLIPRNTTIPVTKSQIFSTAEDNQTEV 408 P42 181 TISVVQGERQLAADNKMLGRFNLSGIEAAPRGLPQIEVSFSIDVNGITTVSAKDKKTGKE 240 AAZ53444.1 409 TISVVQGERQLAADNKMLGRFNLSGIEAAPRGLPQIEVSFSIDVNGITTVSAKDKKTGKE 468 P42 241 QTITIKNTSTLSEEEINKMIQEAEENREADALKKDKIETTVRAEGLINQLEKSITDQGEK 300 AAZ53444.1 469 QTITIKNTSTLSEEEINKMIQEAEENREADALKKDKIETTVRAEGLINQLEKSITDQGEK 528 P42 301 IDPKQKELLEKQIQELKDLLKEEKTDELKLKLDQIEAAAQSFAQATAQQANTSESDPKAD 360 AAZ53444.1 529 IDPKQKELLEKQIQELKDLLKEEKTDELKLKLDQIEAAAQSFAQATAQQANTSESDPKAD 588 P42 361 DSNTIDAEIKQD 372 AAZ53444.1 589 DSNTIDAEIKQD 600 Hình 4. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 với trình tự amino acid của M. hyopneumoniae 7448 (AAZ53444.1) 10KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 7448, mã số AE017244.1 (từ vị trí nucleotide thứ 88523 đến 89641), chỉ sai khác ở 3 vị trí (nucleotide thứ 339, 393 và 936) (hình 3). Tuy nhiên, sự sai khác của nucleotide thứ 339, 393 và 936 không làm ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein vì trình tự axit amin suy diễn của kháng nguyên P42 thu được có độ tương đồng 100 với protein tương ứng của Mycoplasma hyopneumoniae 7448, mã số AAZ53444.1 (từ vị trí amino acid thứ 229 đến 600) (hình 4). 3.3. Kết quả biểu hiện đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 Sự biểu hiện protein P42 tái tổ hợp ởE. coli BL21 (DE3) trong môi trường YJ được thể hiện trên gel polyacrylamide 15 có chứa SDS (Hình 5). Hình 5. Điện di SDS-PAGE đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp P42 trong E. coli BL21 (DE3) M: Marker 10-200 kDa (Bio basic). 1: Mẫu protein hòa tan thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200P42 không cảm ứng IPTG. 2: Mẫu protein thể vùi thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200P42 không cảm ứng IPTG. 3: Mẫu protein hòa tan thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200P42 được cảm ứng bằng IPTG. 4: Mẫu protein thể vùi thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200P42 được cảm ứng bằng IPTG Theo tính toán, protein P42 tái tổ hợp được biểu hiện sẽ có khối lượng khoảng 43,8 kDa, gồm protein P42 có khối lượng phân tử khoảng 40,6 kDa và đuôi dung hợp của vector pET200 D-TOPO có khối lượng phân tử khoảng 3,2 kDa. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy protein P42 tái tổ hợp không có mặt trong protein dịch thể, mà nằm trong protein thể vùi có khối lượng khoảng 45 kDa, phù hợp với kích thước đã được ước tính. Như vậy, protein P42 tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21 (DE3), và dung dịch urea 8M có hiệu quả trong hòa tan protein trong thể vùi. Sau khi tinh sạch protein thể vùi bằng ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific), thu được một băng protein duy nhất có khối lượng khoảng 45 kDa (Hình 6). Kết quả này hoàn toàn tương tự với kết quả trong nghiên cứu của Simionatto và cộng sự (2010) 12. Hình 6. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp 6xHis-P42 từ thể vùi M: Marker 10-200 kDa (Bio basic). 1: Dịch thu được sau khi cho dịch protein tái tổ hợp chảy qua gel. 2: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Binding Buffer. 3,4: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Wash Buffer. 5,6,7: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Elution Buffer. 11KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp P42 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp P42 bằng phương pháp ELISA gián tiếp được trình bày ở hình 7 và bảng 1. Bảng 1. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 Nhóm Mẫu huyết thanh Giá trị OD450 Trung bình Không bị nhiễm 1 0,172 0,185 2 0,198 3 0,184 Bị nhiễm 1 1,475 1,432 2 1,454 3 1,368 Đối chứng (không huyết thanh) 0,064 Hình 7. Kết quả ELISA kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 Kết quả ở bảng 1 cho thấy trung bình giá trị OD 450 ở các giếng được phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 của nhóm bị nhiễm M. hyopneumoniae là 1,432 ; ở các giếng được phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 của nhóm không bị nhiễm M. hyopneumoniae là 0,185 ; ở giếng đổi chứng là 0,064. Điều này này chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp P42 có liên kết với kháng thể có trong huyết thanh lợn đã nhiễm M. hyopneumoniae. IV. KẾT LUẬN Đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 của M. hyopneumoniae đã được tạo dòng và biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Đoạn gene này có kích thước 1119 bp và mã hóa tạo chuỗ i polypeptide dài 372 axit amin, có độ tương đồng 100 so với trình tự công bố trên GenBank (mã số AAZ53444.1). Thí nghiệm tinh sạch và điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có khối lượng phân tử khoảng 44 kDa. Protein 12KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 tái tổ hợp 6xHis-P42 có kết hợp đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh của lợn nhiễm M. hyopneumoniae. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Bá Hiên (2011). Giáo trình Bệnh truyền nhiễm thú y. Hà Nội: NXB Nông nghiệp, tr.252. 2. Phạm Sĩ Lăng và Trương Văn Dung (2002). Một số bệnh mới do vi khuẩn và Mycoplasma ở gia súc - gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị. Hà Nội: NXB Nông nghiệp. 3. Assao V.S., Scatamburlo T.M., Araujo E.N., Santos M.R., Pereira C.E.R., Guedes R.M.C., Bressan G.C., Fietto J.L.R., Chang Y.-F. Moreira M.A.S. (2019). Genetic variation of Mycoplasma hyopneumoniae from Brazilian field samples. BMC microbiology, 19(1), 234. 4. Chen Y.L., Wang S.N., Yang W.J., Chen Y.J., Lin H.H. Shiuan D. (2003). Expression and immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae heat shock protein antigen P42 by DNA vaccination. Infection and immunity, 71(3), 1155-1160. 5. Chou S.Y., Chung T.L., Chen R.J., Ro L.H., Tsui P.I. Shiuan D. (1997). Molecular cloning and analysis of a HSP (heat shock protein) Like 42 kDa antigen gene of Mycoplasma hyopneumoniae. IUBMB Life, 41(4), 821-831. 6. Galli V., Simionatto S., Marchioro S., Fisch A., Gomes C., Conceição F. Dellagostin O. (2012). Immunisation of mice with Mycoplasma hyopneumoniae antigens P37, P42, P46 and P95 delivered as recombinant subunit or DNA vaccines. Vaccine, 31(1), 135-140. 7. Maes D., Segales J., Meyns T., Sibila M., Pieters M. Haesebrouck F. (2008). Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs. Veterinary microbiology, 126(4), 297-309. 8. Mattsson J.G., Bergström K., Wallgren P. Johansson K.E. (1995). Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in nose swabs from pigs by in vitro amplification of the 16S rRNA gene. Journal of Clinical Microbiology, 33(4), 893-897. 9. Meens J., Selke M. Gerlach G.F. (2006). Identification and immunological characterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651. Veterinary microbiology, 116(1- 3), 85-95. 10. Sibila M., Pieters M., Molitor T., Maes D., Haesebrouck F. Segalés J. (2009). Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection. The Veterinary Journal, 181(3), 221-231. 11. Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Brum C.B., Klein C.S., Rebelatto R., Silva E.F., Borsuk S., Conceição F.R. Dellagostin O.A. (2012). Immunological characterization of Mycoplasma hyopneumoniae recombinant proteins. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 35(2), 209-216. 12. Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Hartwig D.D., Carlessi R.M., Munari F.M., Laurino J.P., Conceição F.R. Dellagostin O.A. (2010). Cloning and purification of recombinant proteins of Mycoplasma hyopneumoniae expressed in Escherichia coli. Protein expression and purification, 69(2), 132-136. Ngày nhận 1-6-2021 Ngày phản biện 15-6-2021 Ngày đăng 15-8-2021 13KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA MOÄT SOÁ CHEÁ PHAÅM SINH HOÏC LEÂN SÖÏ TAÊNG TRÖÔÛNG VAØ ÑIEÀU TRÒ BEÄNH DO VI KHUAÅN SALMONELLA TYPHIMURIUM TREÂN GAØ NOØI LAI Nguyễn Minh Thương, Nguyễn Khánh Thuận, Trần Quốc Phi, Lý Thị Liên Khai Email: ltlkhaictu.edu.vn Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng tăng trưởng và điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella Typhimurium trên gà Nòi lai bằng chế phẩm sinh học được thực hiện từ tháng 62020 đến 112020. Thí nghiệm tác động tăng trưởng được tiến hành trên 120 con gà (7 ngày tuổi) và được chia ngẫu nhiên 4 nghiệm thức (NT). Kết quả cho thấy, bổ sung 0,05 dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae (NT1), hỗn hợp 0,8 than hoạt tính với 0,2 giấm than (NT2) không ảnh hưởng đến tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và chỉ số FCR của gà nhưng làm giảm mật độ E. coli trong đường tiêu hoá. Thử nghiệm hiệu quả điều trị đối với bệnh do Salmonella Typhimurium gây ra được tiến hành trên tổng cộng 40 con gà (35 ngày tuổi) với hai lần lập lại. Tiến hành điều trị trong 7 ngày với tỷ lệ bổ sung các chế phẩm sinh học gấp đôi giai đoạn phòng bệnh ở các nghiệm thức. Kết quả ghi nhận tỷ lệ khỏi bệnh ở NT1, NT2 là 100; số ngày khỏi bệnh trung bình (SNKBTB) ngắn nhất là NT1 (3 ngày), NT2 (2,9 ngày). Kết quả cho thấy dịch chiết nấm men Sac- charomyces cerevisiae mang lại hiệu quả cao nhất trong điều trị bệnh do S. Typhimurium trên gà Nòi lai. Từ khóa: G à Nòi lai, giấm than, than hoạt tính, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella Typhimurium. Study on effects of some bioproducts on the growth and disease treatment caused by Salmonella typhimurium in the hybrid noi chickens Nguyen Minh Thuong, Nguyen Khanh Thuan, Tran Quoc Phi, Ly Thi Lien Khai SUMMARY The study on the growth effects and disease treatment caused by Salmonella Typhimurium in hybrid Noi chickens via using bioproducts were conducted from June 2020 to November 2020. The experiments of growth effects were conducted on 120 chickens (7 days old) and randomly divided into 4 treatments (NT). The results showed that adding 0.05 extract of Saccharomyces cerevisiae (NT1), a mixture of 0.8 of activated charcoal with 0.2 of charcoal vinegar (NT2) did not affect the weight gain and feed consumption, and FCR index of chickens; however, it could reduce the density of E. coli in the gastrointestinal tract. Treatment efficacy trials for Salmonella Typhimurium disease were carried out on a total of 40 chickens (35 days old) with two replicates. The treatment were observed for 7 days with the double dose of bioproducts used in the preventive experiments. The results indicated that the recover rate of NT1 and NT2 was 100; the average number of days of recovery (SNKBTB) was the least in NT1 (3 days), and NT2 (2.9 days). The results showed that the extract of Saccharomyces cerevisiae was the most effective in treating diseases caused by S. Typhimurium in hybrid Noi chickens. Keywords: Activated charcoal, charcoal vinegar, hybrid Noi chicken, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium. 14KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 I. GIỚI THIỆU Hiện nay, đàn gia cầm nước ta ngày càng gia tăng về số lượng từ 361,7 triệu con năm 2016 và đã tăng lên 481,0 triệu con vào năm 2019 (Tổng Cục Thống kê Việt Nam, 2020). Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các trang trại chăn nuôi gà công nghiệp thì tại các nông hộ việc chăn nuôi các giống gà địa phương như gà Nòi lai cũng rất phát triển. Giống gà Nòi lai có khả năng thích nghi cao với điều kiện tự nhiên bản địa và có giá trị kinh tế cao trong chăn nuôi tại các nông hộ. Tuy vậy, một trong những khó khăn lớn nhất đối với ngành chăn nuôi đó chính là sự gia tăng dịch bệnh; trong đó Salmonella được xem là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất trên đàn gia cầm. Trong các chủng Salmonella, Salmonella enterica serovar Typhimurium được ghi nhận là chủng gây bệnh xuất hiện phổ biến trên gà và con người ở khu vực Đông Nam Á (Antony và cs., 2009; Neto và cs., 2010). Mặt khác, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị đã làm gia tăng sự đa kháng thuốc ở vi khuẩn Salmonella (Ed-dra và cs., 2017), dẫn đến sự xuất hiện và lan truyền các chủng Salmonella đề kháng kháng sinh từ động vật sang người (Sallam và cs., 2014). Một trong những giải pháp hiện nay là chăn nuôi an toàn sinh học bằng việc bổ sung các chế phẩm sinh học trong khẩu phần để nâng cao sức đề kháng và phòng trị bệnh. Trong đó, dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae được đánh giá là có hiệu quả cao trong việc tăng sức đề kháng cho gà trong quá trình điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra (Haldar và cs., 2011; Shao và cs., 2013). Đồng thời, một số chế phẩm khác như than hoạt tính và giấm than cũng được ghi nhận có khả năng hấp thụ độc tố, bảo vệ đường tiêu hoá chống lại vi khuẩn Salmonella (Watarai và Tana, 2005). Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn còn hạn chế nghiên cứu về giá trị sử dụng của các chế phẩm phẩm sinh học này trong chăn nuôi gà Nòi lai. Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định khả năng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hiệu quả điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ra trên gà Nòi lai bằng chế phẩm sinh học. Từ đó, cung cấp những lợi ích trong việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi, ngăn ngừa sự đề kháng thuốc của vi khuẩn, góp phần bảo vệ sức khoẻ vật nuôi và con người. II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Xác định hiệu qủa của việc sử dụng các chế phẩm sinh học (dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae, than hoạt tính, giấm than) lên sự phát triển ở gà Nòi lai. - Xác định hiệu quả điều trị bệnh do vi khuẩn S. Typhimurium gây ra trên gà Nòi lai bằng các chế phẩm sinh học (dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae, than hoạt tính, giấm than). 2.2 Vật liệu nghiên cứu - Giống gà: gà Nòi lai (1 ngày tuổi) được cung cấp từ Trung tâm giống Bến Tre. - Chế phẩm dùng trong thí nghiệm + Chế phẩm sinh học: Immuno-tonic N24 (thành phần chính là dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae) (AsenTech Pharma JSC, Việt Nam), than hoạt tính gáo dừa bột mịn, giấm than (Tấn Phát, TP Hồ Chí Minh). + Kháng sinh colistin (AsenTech Pharma JSC, Việt Nam). - Chuồng trại + Thí nghiệm tăng trưởng: chuồng nền có diện tích 2m²ô, được trang bị một máng ăn máng uống riêng biệt. + Thí nghiệm điều trị: chuồng lồng có diện tích 64 cm² (8x8) được chia ra làm 2 lô với mỗi lô là một ô chuồng (5 con gà), được trang bị một máng ăn và máng uống riêng biệt. - Thức ăn: thức ăn hỗn hợp Con cò S823 (Proconco, Việt Nam). - Vi khuẩn: Vi khuẩn Salmonella typhimurium được cung cấp từ phòng thí nghiệm Thú y chuyên ngành 2, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn được phân lập từ gà nhiễm Salmonellosis trong nghiên cứu trước đây tại Đồng bằng sông Cửu Long. 15KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của gà Nòi lai khi sử dụng chế phẩm sinh học Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên trên 120 con gà 7 ngày tuổi (sau khi úm 1 tuần) vào 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại khẩu phần được bổ sung: Đối chứng (ĐC): Khẩu phần ăn cơ sở (KPCS): chỉ sử dụng thức ăn hỗn hợp. Nghiệm thức 1 (NT1): KPCS + 0,05 chế phẩm Immuno-tonic N24. Nghiệm thức 2 (NT2): KPCS + 0,8 than hoạt tính + 0,2 Giấm than. Nghiệm thức 3 (NT3): KPCS + 0,01 kháng sinh colistin Mỗi nghiệm thức có 3 lần lập lại với mỗi lần lập lại là 1 đơn vị thí nghiệm (1 ô chuồng gồm 10 con gà với tỷ lệ trống mái như nhau). Thí nghiệm được theo dõi trong 4 tuần liên tục. Chỉ tiêu đánh giá khả năng tăng trưởng và phòng bệnh - Tăng trọng (TT) của gà được tính dựa vào khối lượng trung bình cuối thí nghiệm (KLTBcuối) trừ khối lượng trung bình đầu thí nghiệm (KLTBđầu) theo công thức: - Mức tiêu tốn thức ăn (lượng ăn vào) được đánh giá qua lượng thức ăn ăn vào hàng ngày của gà. Mỗi ngày ghi nhận lượng thức ăn cho ăn và lượng thức ăn dư để theo dõi chỉ tiêu tiêu tốn thức ăn (TTTĂ) được tính theo công thức: TTTĂ (gconngày)= Lượng TĂ cho ăn (g ngày)- Lượng TĂ thừa (gngày) Tổng số gà trong ô - Hệ số chuyển hoá thức ăn (FCR) hàng tuần được tính theo công thức: FCR= Tổng khối lượng thức ăn tiêu tốn tuần Tăng trọng tuyệt đối trong tuần - Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella và mật độ vi khuẩn E. coli trong đường tiêu hoá: tiến hành lấy mẫu phân ngẫu nhiên ở mỗi ô thí nghiệm (3 mẫulônghiệm thức). Mẫu phân được lấy trực tiếp từ trực tràng. + Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn E.coli được tiến hành dựa theo TCVN 5155-90. Cân chính xác 1g phân từ mẫu lấy được cho vào 9ml nước muối sinh lý, sau đó vortex và pha loãng đến nồng độ cần thiết từ 10-1 đến 10-9. Sau khi pha loãng, chọn 2 nồng độ thích hợp dự kiến có chứa từ 25-300 khuẩn lạc trong 0,1ml mẫu để chan lên môi trường MacConkey (MC, Merck, Đức). Dùng phương pháp chan đĩa làm khô dịch mẫu trên bề mặt môi trường, sau đó ủ ở 37oC. Sau 24 giờ ủ mẫu, khuẩn lạc E. coli được đếm và ghi nhận trên từng nồng độ kiểm tra. - Sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong phân gà được xác định theo TCVN 4829:2005. 2.3.2 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hiệu quả điều trị bệnh của chế phẩm sinh học đối với vi khuẩn Salmonella Typhimurium trên gà Nòi lai Bố trí thí nghiệm Thử nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên trên 40 con gà Nòi lai (35 ngày tuổi) được chia vào 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại khẩu phần với tỷ lệ bổ sung các chế phẩm gấp 2 lần giai đoạn nuôi phòng: Đối chứng (ĐC): Khẩu phần ăn cơ sở (KPCS). Nghiệm thức 1 (NT1): KPCS + 0,1 Sản phẩm Immuno-tonic N24 Nghiệm thức 2 (NT2): KPCS + 1,6 Than hoạt tính + 0,4 Giấm than Nghiệm thức 3 (NT3): KPCS + 0,02 Kháng sinh colistin. Mỗi thí nghiệm có 2 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 1 ô chuồng gồm 5 con gà với tỷ lệ trống mái như nhau. Tất cả gà thí nghiệm được kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong phân; những con gà không bị nhiễm Salmonella được chọn để tiến hành thí nghiệm. Sau 3 ngày nuôi với khẩu phần điều trị, tiến hành gây nhiễm tất cả gà 16KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 Bảng 1: Sự tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và hệ số chuyển hoá thức ăn (FCR) của gà trong thí nghiệm ảnh hưởng tăng trưởng Chỉ tiêu Tuần tuổi Nghiệm thức thí nghiệm P ĐC NT1 NT2 NT3 Tăng trọng 1 64,0 70,6 64,2 63,9 0,094 2 84,6 97,5 90,7 87,9 0,435 3 133,1 146,2 134,6 136,4 0,505 4 124,0 138,1 129,2 125,6 0,398 TB 101,4 113,1 104,7 103,5 0,305 Tiêu tốn TĂ 1 116,5 115,9 114,8 110,2 0,707 2 157,7 185,4 167,5 167,0 0,304 3 237,1 255,5 237,9 234,8 0,736 4 311,2 343,7 324,9 312,7 0,622 TB 205,6 225,1 211,3 206,2 0,492 FCR 1 2,1 1,6 1,9 1,8 0,188 2 1,9 1,9 1,9 1,9 0,987 3 1,8 1,8 1,7 1,7 0,924 4 2,5 2,5 1,7 2,5 0,998 TB 2,1 2,0 2,0 2,0 0,845 ĐC: đối chứng; NT1: bổ sung 0,05 sản phẩm Immuno-tonic N24; NT2: bổ sung 0,8 than hoạt tính và 0,2 giấm than; NT3: bổ sung 0,01 kháng sinh colistin; TB: trung bình. thí nghiệm với vi khuẩn Salmonella Typhimurium. Liều gây nhiễm S. Typhimurium: 10⁵ CFU ml, dựa trên khảo sát LD50 trước đây của chủng S. Typhimurium được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau khi gây nhiễm 24 giờ, phân của gà bị gây nhiễm sẽ được thu thập để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn S. Typhimurium. Điều trị được theo dõi trong 7 ngày liên tục . Đối với gà chết trong thời gian thí nghiệm sẽ được mổ khám theo TCVN 8420:2010 nhằm kiểm tra các biểu hiện bệnh tích trên tất cả các cơ quan nội tạng, tập trung vào những cơ quan đích gây bệnh bởi S. Typhimurium. Chỉ tiêu theo dõi trong thử nghiệm điều trị Tỷ lệ gà chết sau khi gây nhiễm Salmonella Typhimurium được tính theo công thức: Tỷ lệ chết = Số gà chết×100 Tổng số gà thí nghiệm Tỷ lệ khỏi bệnh = Số gà khỏi bệnh×100 Tổng số gà điều trị Số ngày khỏi bệnh trung bình = Tổng số ngày gà bệnh Tổng số gà bệnh 2.4 Phương pháp xử lý thống kê Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2013 và phân tích thống kê bằng phép thử Chi-square, Anova (General Liner Model), Anova (One-way) của phần mềm Minitab 16, ở mức ý nghĩa 95. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá khả năng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chế phẩm sinh học trên gà Nòi lai 3.1.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng Qua 4 tuần theo dõi, t ăng trọng của gà thí nghiệm được ghi nhận ở Bảng 1. 17KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ 9 - 2021 Vào tuần 1, tăng trọng trung bình của gà ở các nghiệm thức không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Sau 4 tuần thí nghiệm, mặc dù có sự gia tăng trọng lượng cao hơn trên nhóm gà sử dụng các chế phẩm sinh học; tuy nhiên, kết quả sự tăng trọng trung bình này không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (P>0,05). Kết quả này cho thấy việc bổ sung dịch chiết nấm men, hỗn hợp than hoạt tính với giấm than (AC+WV) vào khẩu phần tại các nồng độ thí nghiệm này không gây ảnh hưởng đến sự tăng trọng của gà thí nghiệm. Trong nghiên cứu của Chae và cs. (2006), cho thấy việc bổ sung 0,05 dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae trong khẩu phần của gà thịt không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng bình thường của gà. Yamauchi và cs. (2010) cũng cho thấy rằng việc bổ sung hỗn hợp AC+WV từ 0,5- 1,5 vào khẩu phần cũng không làm ảnh hưởng đến tăng trọng và sự phát triển bình thường của gà. Do đó, cần có các nghiên cứu tiếp theo để xác định hiệu quả tăng trọng khi sử dụng các chế phẩm sinh học này ở các nồng độ khác. Lượng tiêu tốn thức ăn trung bình của gà giữa các nghiệm thức (Bảng 1) cũng không có khác biệt về mặt thống kê. Điều này cho thấy việc bổ sung các chế phẩm sinh học, kháng sinh colistin vào khẩu phần tại các nồng độ thí nghiệm không ảnh hưởng đến mức ăn vào của gà. Có thể lý giải do các chế phẩm bổ sung vào khẩu phần không có chứa các thành phần kích thích mức tiêu thụ lượng thức ăn ăn vào của gà vì vậy mà những con gà ở NT1, NT2, NT3 có mức ăn giống với những con gà ở ĐC. Nghiên cứu của Thanissery và cs. (2010) cũng cho thấy việc bổ sung men sinh học từ tinh chất nấm men Saccharomyce cerevisiae không gây ảnh hưởng tới lượng tiêu tốn thức ăn trên gà. Ngoài ra, hệ số chuyển hóa thức ăn trung bình của gà ghi nhận sau 4 tuần ở các nghiệm thức không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (P>0,05) (Bảng 1). Do các chế phẩm sinh học khi bổ sung vào khẩu phần của gà không làm ảnh thưởng đến mức ăn vào và tăng trọng của gà, vì vậy mà hệ số chuyển hóa thức ăn cũng không bị ảnh hưởng. Các chỉ tiêu sinh trưởng được ghi nhận phù hợp với sự sinh trưởng bình thường của giống gà Nòi lai trong nghiên cứu của Hồ Tân Hiệp (2014). Điều này chứng tỏ việc bổ sung chế phẩm sinh học và kháng sinh colistin vào khẩu phần không làm xáo trộn sự phát triển bình thường của gà thí nghiệm. 3.1.2 Kết quả định lượng mật độ vi khuẩn E. coli và sự hiện diện của Salmonella trong đường tiêu hoá của gà Nòi lai Trong nghiên cứu này, không tìm thấy sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong phân gà ở đầu và cuối thí nghiệm ở tất cả các lô thí nghiệm. Bảng 2: Mật độ vi khuẩn E. coli trong phân trong nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh Tuần Mật độ vi khuẩn (logCFUg) P ĐC NT1 NT2 NT3 Đầu thí nghiệm 6,54 6,53 6,52 6,54 0,84 Cuối thí nghiệm 6,80a 6,56d 6,62c 6,71b 0,00 ĐC: đối chứng; NT1: bổ sung 0,05 sản phẩm Immuno-tonic N24; NT2: bổ sung 0,8 than hoạt tính và 0,2 giấm than; NT3: bổ sung 0,01 kháng sinh colistin Mật độ vi khuẩn E. coli trong mẫu phân gà ở đầu thí nghiệm không có sự khác biệt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 2), do tất cả gà trong thí nghiệm đều được lựa theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên từ những con gà có chế độ nuôi dưỡng như nhau. Cuối thí nghiệm, tổng số vi khuẩn giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt (P