Đang tải... (xem toàn văn)
Kỹ Thuật - Công Nghệ - Công Nghệ Thông Tin, it, phầm mềm, website, web, mobile app, trí tuệ nhân tạo, blockchain, AI, machine learning - Tài Chính - Financial DƯƠNG VĂN CƯỜNG (Chủ biên) NGUYỄN HUY THUẦN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP Hà Nội – 2017 GIÁO TRÌNH NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN (Dành cho sinh viên đại học ngành Công nghệ Sinh học) iii2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền MỤCLỤC Mục lục ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������iii Lời nói đầu����������������������������������������������������������������������������������������������������������������v Chương 1 TÁCh ChIẾT AXIT nUCLEIC 1 1.1. Tách chiết axit nucleic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2. Xác định nồng độ axit nucleic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.3. Điện di trên gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.4. Lai phân tử . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Chương 2 CẮT VÀ nỐI DnA 19 2.1. Cắt DNA bằng enzyme giới hạn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2. Nối dna bằng ligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.3. Biến đổi đầu phân tử DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Chương 3 CÁC hỆ ThỐng VECTOR 39 3.1. Vector plasmid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.2. Vector dựa trên thực khuẩn thể lambda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.3. Vector dựa trên thực khuẩn thể m13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 3.4. Cosmid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 3.5. Vector biểu hiện. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 3.6. Vector dùng cho tế bào nhân chuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.7. Siêu vector: YAC và BAC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 iv MỤC LỤC trường đại học nông lâm thái nguyên Chương 4 KỸ ThUẬT PCR 67 4.1. Nguyên lý . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 4.2. Các điều kiện của phản ứng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.3. Các thành phần chính của phản ứng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.4. Các dạng PCR cải biên . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Chương 5 TÁCh DÒng gEnE 83 5.1. Thư viện hệ gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 5.2. Thư viện cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.3. Chọn lọc dòng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Chương 6 gIẢI TRÌnh TỰ, PhÂn TÍCh gEnE VÀ hỆ gEnE 107 6.1. Giải trình tự gene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 6.2. Giải trình tự hệ gene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 6.3. Xác định gene thành phần trong hệ gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6.4. Ứng dụng giải trình tự gene và hệ gene trong nghiên cứu Metagenomics . . . . . 122 Chương 7 PhÂn TÍCh BIẾn DỊ DI TRUYỀn 125 7.1. Phân loại biến dị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 7.2. Nghiên cứu biến dị. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Chương 8 BIỂU hIỆn PROTEIn TÁI TỔ hỢP 139 8.1. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 8.2. Biểu hiện gene ở vi khuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 8.3. Biểu hiện ở tế bào chủ nhân chuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 8.4. Gắn đuôi và chuỗi tín hiệu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 8.5. Gây đột biến in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Chương 9 PhÂn TÍCh BIỂU hIỆn gEnE 163 9.1. Phân tích phiên mã . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 9.2. So sánh transcriptome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 9.3. Nghiên cứu promoter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 9.4. Phân tích dịch mã . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 ThUẬT ngỮ ChUYÊn ngÀnh 189 Tài liệu tham khảo��������������������������������������������������������������������������������������������� 201 v2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền LỜINÓIĐẦU Cuốn sách “Nguyên lý Kỹ thuật di truyền” được biên soạn cho sinh viên hệ đại học ngành Công nghệ Sinh học. Theo khung chương trình đào tạo ngành Công nghệ Sinh học tại một số trường đại học, nhóm tác giả đặt cuốn sách này vào trục dọc gồm ba học phần có tính chất nối tiếp liên tục, bao gồm Di truyền học đại cương, Sinh học phân tử và Kỹ thuật di truyền. Với tư duy như vậy và trên cơ sở tham khảo một số cuốn sách Kỹ thuật di truyền trên thế giới, nhóm tác giả đưa nội dung giáo trình đi thẳng vào khối kiến thức mang tính chất nền tảng và tư duy của các nguyên lý thao tác với axit nucleic và công nghệ DNA tái tổ hợp. Giáo trình gồm 9 chương với các nội dung như sau: Chương 1: Tách chiết axit nucleic Chương 2: Cắt và nối DNA Chương 3: Các hệ thống vector Chương 4: Kỹ thuật PCR Chương 5: Tách dòng gene Chương 6: Giải trình tự, phân tích gene và hệ gene Chương 7: Phân tích biến dị di truyền Chương 8: Biểu hiện protein tái tổ hợp Chương 9: Phân tích biểu hiện gene TS. Dương Văn Cường chủ biên, biên soạn các chương 1–5, 7–9 và hiệu đính. TS. Nguyễn Huy Thuần tham gia biên soạn chương 6 và phần Thuật ngữ chuyên ngành. vi trường đại học nông lâm thái nguyên 2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền Giáo trình có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giáo viên phổ thông trung học giảng dạy môn Sinh học, sinh viên, học viên cao học các ngành liên quan đến Công nghệ Sinh học, bao gồm: Cử nhân Sinh học, Sư phạm Sinh h...
Trang 1DƯƠNG VĂN CƯỜNG (Chủ biên) NGUYỄN HUY THUẦN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP Hà Nội – 2017
GIÁO TRÌNH
NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN
(Dành cho sinh viên đại học ngành Công nghệ Sinh học)
Trang 3©2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền
Mục lục ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������iii Lời nói đầu ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������v
1.1 Tách chiết axit nucleic 11.2 Xác định nồng độ axit nucleic 61.3 Điện di trên gel 71.4 Lai phân tử 13
2.1 Cắt DNA bằng enzyme giới hạn 192.2 Nối dna bằng ligase 262.3 Biến đổi đầu phân tử DNA 33
3.1 Vector plasmid 393.2 Vector dựa trên thực khuẩn thể lambda 473.3 Vector dựa trên thực khuẩn thể m13 553.4 Cosmid 563.5 Vector biểu hiện 583.6 Vector dùng cho tế bào nhân chuẩn 603.7 Siêu vector: YAC và BAC 65
Trang 4trường đại học nông lâm thái nguyên
5.1 Thư viện hệ gene 835.2 Thư viện cDNA 895.3 Chọn lọc dòng 97Chương 6 gIẢI TRÌnh TỰ, PhÂn TÍCh gEnE VÀ hỆ gEnE 1076.1 Giải trình tự gene 1076.2 Giải trình tự hệ gene 1146.3 Xác định gene thành phần trong hệ gene 1206.4 Ứng dụng giải trình tự gene và hệ gene trong nghiên cứu Metagenomics 122
7.1 Phân loại biến dị 1257.2 Nghiên cứu biến dị 127
8.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện gene 1408.2 Biểu hiện gene ở vi khuẩn 1448.3 Biểu hiện ở tế bào chủ nhân chuẩn 1528.4 Gắn đuôi và chuỗi tín hiệu 1568.5 Gây đột biến in vitro 158
Trang 5©2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền
Cuốn sách “Nguyên lý Kỹ thuật di truyền” được biên soạn cho sinh viên hệ đại học ngành Công nghệ Sinh học Theo khung chương trình đào tạo ngành Công nghệ Sinh học tại một số trường đại học, nhóm tác giả đặt cuốn sách này vào trục dọc
gồm ba học phần có tính chất nối tiếp liên tục, bao gồm Di truyền học đại cương, Sinh
học phân tử và Kỹ thuật di truyền Với tư duy như vậy và trên cơ sở tham khảo một số
cuốn sách Kỹ thuật di truyền trên thế giới, nhóm tác giả đưa nội dung giáo trình đi thẳng vào khối kiến thức mang tính chất nền tảng và tư duy của các nguyên lý thao tác với axit nucleic và công nghệ DNA tái tổ hợp.
Giáo trình gồm 9 chương với các nội dung như sau: • Chương 1: Tách chiết axit nucleic
• Chương 2: Cắt và nối DNA • Chương 3: Các hệ thống vector • Chương 4: Kỹ thuật PCR • Chương 5: Tách dòng gene
• Chương 6: Giải trình tự, phân tích gene và hệ gene • Chương 7: Phân tích biến dị di truyền
• Chương 8: Biểu hiện protein tái tổ hợp • Chương 9: Phân tích biểu hiện gene
TS Dương Văn Cường chủ biên, biên soạn các chương 1–5, 7–9 và hiệu đính TS Nguyễn Huy Thuần tham gia biên soạn chương 6 và phần Thuật ngữ chuyên ngành.
Trang 6trường đại học nông lâm thái nguyên
Giáo trình có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giáo viên phổ thông trung học giảng dạy môn Sinh học, sinh viên, học viên cao học các ngành liên quan đến Công nghệ Sinh học, bao gồm: Cử nhân Sinh học, Sư phạm Sinh học, Y dược, Nông nghiệp, Lâm nghiệp…
Lần đầu xuất bản giáo trình không tránh khỏi thiếu sót Nhóm tác giả chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những góp ý của độc giả để cuốn sách được hoàn thiện hơn trong các lần tái bản.
Ý kiến đóng góp xin gửi về địa chỉ thư điện tử duongvc@gmail.com.
CáCtáCgiả
Trang 7©2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền
Chương 1 TÁCHCHIẾTAXITNUCLEIC
Để bắt đầu một thí nghiệm kỹ thuật di truyền, việc đầu tiên là phải thu được vật liệu di truyền, DNA hoặc RNA, để làm nguyên liệu Các kỹ thuật hiện đại đã làm cho công việc này trở nên đơn giản hơn so với trước kia Trong chương này, trước hết chúng ta sẽ cùng xem xét các nguyên lý nền tảng của phương pháp tách chiết và tinh sạch axit nucleic Tiếp theo, ta sẽ tìm hiểu những phương án dùng để tách riêng từng loại DNA Sau khi tách chiết, cần phải đánh giá chất lượng của DNA thu được theo các tiêu chí
hàm lượng, độ tinh khiết và độ nguyên vẹn Các tiêu chí này được đánh giá bằng phương
pháp đo quang phổ kết hợp với điện di Phần cuối của chương mô tả hiện tượng căn bản của DNA gồm biến tính và hồi tính, đồng thời thảo luận nguyên lý của hiện tượng và ứng dụng trong phản ứng lai phân tử.
1.1 TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC
Bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm kỹ thuật di truyền là thu nhận axit nucleic (DNA hoặc RNA) từ tế bào Quá trình này bao gồm bốn bước cơ bản như sau:
• Phá vỡ tế bào.
• Loại bỏ các thành phần khác của tế bào • Thu nhận axit nucleic.
• Tinh sạch.
Ngoài việc làm thế nào để phân tách DNA và RNA ra khỏi nhau, nhà nghiên cứu còn phải phân biệt hai loại DNA phổ biến cần tách chiết sao cho loại này không lẫn vào loại
kia, đó là hệ gene và plasmid DNA hệ gene bao gồm toàn bộ DNA của tế bào bao gồm
Trang 8trường đại học nông lâm thái nguyên
DNA nhiễm sắc thể trong nhân, DNA của các bào quan như ti thể, lạp thể Đặc điểm của
DNA hệ gene là kích thước lớn Plasmid là các yếu tố di truyền ngoài nhân có ở vi khuẩn
Chúng là các phân tử DNA dạng vòng, mạch kép với kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với DNA hệ gene Chúng có khả năng tự sao chép độc lập mà không phụ thuộc vào sự sao chép DNA trong nhân Trong thực nghiệm, tách chiết plasmid là một công việc được tiến
hành hàng ngày ở các phòng thí nghiệm sinh học phân tử DNA phage là toàn bộ hệ gene
của phage xâm nhiễm vi khuẩn Trong các nghiên cứu về virus thì điều cần thiết là tách chiết được riêng rẽ hệ gene nhỏ bé của virus ra khỏi lượng DNA khổng lồ của vật chủ.
1.1.1 PHÁ VỠ TẾ BÀO VÀ MÔ
Mặc dù có nhiều phương pháp tách chiết axit nucleic nhưng chúng đều có chung những nguyên lý cơ bản Đầu tiên, người ta cần có vật liệu khởi đầu Chất lượng của vật liệu khởi đầu có ý nghĩa quyết định tới sự thành công hay thất bại của thí nghiệm Dạng vật liệu khởi đầu thường gặp nhất là dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn hay tế bào nhân chuẩn Sinh khối tế bào được thu nhận và tách riêng ra khỏi môi trường nuôi cấy bằng cách dễ dàng nhất là ly tâm Dạng vật liệu khởi đầu thứ hai là các mẫu mô phức tạp của sinh vật bậc cao Đối với dạng này thì trước hết mẫu cần được đồng nhất hóa Cho dù là loại vật liệu nào thì tốt nhất là chúng ta nên thu mẫu nhanh chóng, sạch và bảo quản ở nhiệt độ thấp cho tới khi cần sử dụng.
Tiếp theo, tế bào cần được phá vỡ để giải phóng các thành phần nội bào Các phương pháp phá vỡ tế bào có thể phân chia thành 2 nhóm là cơ học và hóa học Tùy thuộc từng loại tế bào mà phương pháp phù hợp sẽ được lựa chọn Đối với vi khuẩn, thành tế bào của chúng có thể bị làm yếu đi bằng lysozyme, acid ethylenediamine tetraacetic (EDTA) hoặc kết hợp cả hai Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và nước mắt có tác dụng phân hủy các hợp chất polymer cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn EDTA có tác dụng loại bỏ các ion Mg2+ là nhân tố thiết yếu trong việc duy trì tính ổn định tổng thể của vỏ tế bào vi khuẩn Một vai trò nữa của EDTA là ức chế hoạt động của DNase để bảo vệ DNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme này Trong một số điều kiện, xử lý tế bào vi khuẩn bằng lysozyme và EDTA là đủ để phá vỡ lớp vỏ của chúng, nhưng thông thường một loại chất tẩy rửa như sodium dodecyl sulphate (SDS) cũng được bổ sung Chất tẩy rửa có tác dụng hoà tan lớp lipid của màng.
Tế bào thực vật có thành (vách) cấu tạo từ cellulose nên có cấu trúc vững chắc hơn vi khuẩn do đó chúng cần xử lý bằng lực cơ học Quy trình phổ biến áp dụng trong trường hợp cần tách axit nucleic từ mô thực vật là nghiền trong nitrogen lỏng Tế bào động vật thì không có thành tế bào nên chỉ cần xử lý bằng một chất tẩy nhẹ.
Sau khi phá vỡ tế bào ta sẽ thu được một hỗn hợp các thành phần nội bào bao gồm DNA, RNA, protein, lipid và đường Cần lưu ý rằng việc phá vỡ tế bào một cách đột ngột thường làm cho DNA nhiễm sắc thể bị đứt gãy Riêng trường hợp của nhiễm sắc
Trang 9©2017 Nguyên lý kỹ thuật di truyền
1 Richard J Reece (2004) Analysis of Genes and Genomes John Wiley & Sons Ltd.
2 Primrose S.B and Twyman R.M (2006) Principles of Gene Manipulation and Genomics
Blackwell Publishing.
3 Christopher Howe (2007) Gene Cloning and Manipulation Cambridge University Press.4 Brown, T.A (2010) Gene cloning and DNA analysis: An introduction Wiley-Blackwell.5 Daniel L Hartl and Elizabeth W Jones (2011) Genetics: Analysis of Genes and Genomes
Jones & Bartlett Learning.
6 Jeremy W Dale, Malcolm von Schantz and Nick Plant (2012) From Genes to Genomes:
Concepts and Applications of DNA Technology Wiley-Blackwell.
7 Harvey Lodish và cộng sự (2016) Sinh học phân tử của tế bào Tập 2: Di truyền học và sinh
học phân tử Biên dịch: Nguyễn Xuân Hưng và cộng sự Nhà xuất bản Trẻ.
Trang 10GIÁO TRÌNH
NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN
NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 167/6 Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội
ĐT: (04) 38523887, (04) 38521940 - Fax: (04) 35760748 Website: http://www.nxbnongnghiep.com.vn
E-mail: nxbnn@yahoo.com.vn
CHI NHÁNH NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm - Q.I - Tp Hồ Chí Minh ĐT: (08) 38299521, 38297157 - Fax: (08) 39101036
In 115 bản, khổ 19 × 27cm tại Xưởng in Nhà xuất bản Nông nghiệp Địa chỉ: Số 6, ngõ 167 phố Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội
Xác nhận đăng ký xuất bản số 764-2017/CXBIPH/14-70/NN ngày 17/3/2017 TS LÊ QUANG KHÔI
Biên tập và sửa bản in: LÊ LÂN – NGUYỄN THỊ THU HÀ
Trình bày, bìa:
NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT