Đang tải... (xem toàn văn)
Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản
Mã ngành: 62 62 03 01
HỒNG MỘNG HUYỀN
ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢC LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG BỆNH VI KHUẨN TRÊN
TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)
Cần Thơ, 2024
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Thị Tuyết Hoa
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở
Họp tại: Phòng họp 3, Nhà điều hành - Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc 8g giờ 00 ngày 30 tháng 12 năm 2022
Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Ngọc Phước Phản biện 2: PGS.TS Đặng Thị Hoàng Oanh
Xác nhận đã xem lại của chủ tịch Hội đồng
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 2018 Huyền, H.M., Huy, V.T., & Hoa, T.T.T (2018) Hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết thảo dược kháng vi
khuẩn gây bệnh ở tôm nuôi Tạp chí Khoa học Trường Đại
học Cần Thơ, 54(CĐ Thủy sản), 143-150
2 2020 Huyền, H.M., Toàn, N.V., Hiền, H.V., & Hoa, T.T.T., (2020) Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm vùng
Đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học
Cần Thơ, 56(CĐ Thủy sản), 137-148
3 2020 Huyền, H.M., Hải, T.N., Việt, L.Q., & Hoa, T.T.T., (2020) Ảnh hưởng của chất chiết thảo dược lên tăng trưởng, miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh của tôm
thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) với Vibrio
parahaemolyticus Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 56(5), 150-159
4 2020 Hoa, T.T.T., Hằng, B.T.B., Huyền, H.M., Duyên, T.T M., & Tuân, N T (2020) Hoạt tính kháng khuẩn của một
số chất chiết thảo dược kháng Vibrio parahaemolyticus và
Vibrio harveyi gây bệnh ở tôm biển Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 56(CĐ Thủy sản), 170-178
5 2021 Hoa, T.T.T., Huyền, H.M., Việt, L.Q., & Tuân, N.T
(2021) Sử dụng thức ăn bổ sung chất chiết lá lựu (Punica
granatum) phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ
chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tạp chí Khoa học Trường
Đại học Cần Thơ, 57(CĐ Thủy Sản), 160-168.
Trang 4PHẦN 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Việc thâm canh hóa nâng cao năng suất kết hợp với vấn đề thời tiết thay đổi thất thường, đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh ở hầu hết các
mô hình nuôi tôm Tại các trại sản xuất tôm giống, Vibrio harveyi là mầm
bệnh vi khuẩn thường gặp, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng, hậu ấu trùng tôm Ở ao nuôi xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), bệnh
do Vibrio parahaemolyticus chứa plasmid mang gen độc tố (PirA, PirB) (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a), bệnh gây
chết đến 100% đàn tôm, gen độc tố này có thể được truyền từ loài vi
khuẩn Vibrio này sang loài vi khuẩn Vibrio khác Đã có nhiều loài Vibrio được phát hiện mang gen độc tố như V harveyi, V campbellii, V
punensis và V owensii (Kondo et al., 2015; Xiao et al., 2017)
Hiện nay, người nuôi cũng đã sử dụng nhiều liệu pháp tự nhiên để phòng trị bệnh do vi khuẩn trên tôm, trong đó có thảo dược Nhiều loài thảo dược được xác định có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao giúp kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, ký sinh trùng, kích thích tăng trưởng, kích thích sự thành thục, chống stress, tăng cường miễn dịch
(Citarasu, 2010; Harikrishnan et al., 2011a; b; c; Ji et al., 2012; Reverter
et al., 2014; 2017; 2021) Bên cạnh đó, thảo dược với nhiều ưu điểm như
rẻ, dễ chuẩn bị, hiệu quả phòng bệnh cao do dễ hấp thu, ít tác dụng phụ trong quá trình điều trị bệnh và không ảnh hưởng đến môi trường cũng như không nguy hiểm đến đối tượng nuôi (Hai, 2015)
Trong thời gian gần đây, các công trình nghiên cứu sử dụng chất
chiết thảo dược giúp tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio và tăng cường đáp ứng miễn dịch tôm tăng lên đáng kể (Ghosh et al., 2021) Do đó, việc
sàng lọc các loài thảo dược sẵn có giúp tăng cường hệ miễn dịch tôm, tăng sức đề kháng mầm bệnh nhằm tìm ra giải pháp phòng bệnh an toàn sinh học sẽ mang lại hiệu quả thiết thực cho người nuôi tôm vùng ĐBSCL
Từ những cơ sở nêu trên, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của chiết xuất
thảo dược lên miễn dịch và khả năng kháng khuẩn trên tôm thẻ chân
trắng (Penaeus vannamei)” được thực hiện
Trang 51.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm biển ở một số hộ nuôi tôm thuộc các tỉnh thuộc vùng ĐBSCL Chọn lọc được một số loài thảo dược phổ biến ở ĐBSCL có hoạt tính kháng khuẩn
trong điều kiện in-vitro, cũng như khả năng tăng cường miễn dịch và giúp tôm thẻ chân trắng (P vannamei) kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong điều kiện in-vivo Xác định một số hợp chất tự nhiên
trong chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
1.3 Nội dung nghiên cứu của luận án
Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL
Sàng lọc một số loài thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn V
parahaemolyticus, V harveyi gây bệnh trên tôm
Xác định khả năng tăng cường miễn dịch tôm của một số chất chiết thảo dược
Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
1.4 Những đóng góp mới của luận án
Khảo sát cho thấy tỷ lệ hộ nuôi sử dụng thảo dược trong nuôi tôm là rất cao ở mô hình sử dụng là thâm canh và siêu thâm canh, đối tượng áp dụng cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng Xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó tỏi là loài được sử dụng phổ
biến nhất, tiếp theo là cây diệp hạ châu (Phyllanthus spp.), ổi (Psidium
guajava), mật gấu (Vernonia amygdalina), thù lù (Physalis angulata)
Xác định được 6 loài thảo dược thu thập ở vùng ĐBSCL có hoạt
tính kháng khuẩn cao đối với cả V parahaemolyticus và V harveyi bằng
phương pháp khếch tán đĩa thạch, bao gồm chất chiết bằng methanol của
bàng (Terminalia catappa), lựu (Punica granatum), diệp hạ châu thân đỏ (P urinaria L.), diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus amarus Schumach & Thonn), bần ổi (Sonneratia ovata), bần chua (S caseolaris) Tất cả 6
chất chiết này đều có tính kìm khuẩn Ngoài ra, các chất chiết này đều thể
Trang 6hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các chủng V parahaemolyticus và V harveyi phân lập từ ao nuôi tôm
Xác định được liều lượng và thời gian bổ sung chất chiết từ lá bàng và chất chiết xuất từ quả bần chua (1% và nhịp bổ sung 2 tuần) giúp tôm thẻ chân trắng tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và khả năng
kháng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Đồng thời
với liều lượng và thời gian bổ sung các chất chiết này không ảnh hưởng đến tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn của tôm thẻ chân trắng
Đây cũng là kết quả đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi thương phẩm
1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Kết quả đạt được của nghiên cứu cung cấp thông tin, số liệu về tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản Cụ thể, thông tin khảo sát giúp xác định rõ thực trạng và nhu cầu sử dụng thảo dược của người nuôi tôm; chọn lọc được một số loài thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch kháng vi khuẩn gây bệnh và không ảnh hưởng đến tăng trưởng của tôm nuôi; xác định loài thảo dược có khả năng ứng dụng vào quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm Từ đó, kết quả nghiên cứu đóng góp thông tin khoa học cho định hướng ứng dụng thảo dược vào quy trình nuôi tôm; nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi thủy sản; giúp cho các nhà khoa học và cơ quan quản lý thuốc kháng sinh có giải pháp ngăn chặn và kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh nhằm hướng đến việc sản xuất tôm an toàn và bền vững
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thời gian: Các thí nghiệm của luận án được thực hiện trong thời gian từ tháng 10/2017 đến tháng 8/2021
Địa điểm nghiên cứu: (i) Nội dung khảo sát tình hình sử dụng thảo
Trang 7tích hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược và thí nghiệm sử dụng thảo dược trên tôm thẻ chân trắng được thực hiện ở Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (iii) Thu thập nguồn vi khuẩn từ hộ nuôi tôm thuộc tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu và Tiền Giang, phục vụ cho thử nghiệm ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn cao
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Thảo dược được thu hái từ các tỉnh ở ĐBSCL, bao gồm 15 loài như diệp hạ châu thân đỏ, lựu, bàng, bần chua, bần ổi, ổi, diệp hạ châu thân xanh, cây tra, tía tô, hoa ngũ sắc, cỏ lào, tỏi, đu đủ, thù lù và màn ri
Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5), V harveyi
(T2016-04) dùng cho nội dung xác định hoạt tính kháng khuẩn và cho thí nghiệm cảm nhiễm, thuộc bộ sưu tập của bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy
sản, trường Đại học Cần Thơ Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus,
V harveyi được phân lập từ mẫu tôm, nước thu trực tiếp từ ao nuôi
Tôm thẻ chân trắng (1-2 g) dùng để thực hiện các thí nghiệm tôm
ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở thí nghiệm in-vivo Nguồn tôm
thẻ chân trắng được tiếp nhận từ trại nuôi tôm thuộc bộ môn Kỹ thuật nuôi Hải sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Các dụng cụ và thiết bị sử dụng trong luận án như dùng cho ly trích thảo dược, hoạt tính kháng khuẩn, phân lập định danh vi khuẩn; dùng cho phân tích miễn dịch; dùng cho bố trí nuôi dưỡng tôm và cảm nhiễm
2.1.4 Môi trường và hóa chất thí nghiệm
Một số hóa chất sử dụng cho các thí nghiệm của luận án như môi trường và hóa chất phục hồi, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn; hóa chất dùng để ly trích thảo dược và pha loãng thảo dược; hóa chất dùng trong phân tích các chỉ tiêu miễn dịch; hóa chất dùng trong phân tích PCR và Realtime-PCR
Trang 82.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp phỏng vấn hộ nuôi tôm
Phỏng vấn người nuôi tôm được thực hiện bằng cách sử dụng phiếu phỏng vấn, nội dung phiếu phỏng vấn được thiết kế dựa trên mục tiêu nghiên cứu là đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm Khảo sát được thực hiện vào năm 2018, với tổng số 90 hộ nuôi tôm thuộc 2 tỉnh Cà Mau và Sóc Trăng
2.2.2 Phương pháp ly trích thảo dược
Các loài thực vật sau khi thu, được rửa sạch, để ráo, sấy khô ở 60oC, sau đó được nghiền thành bột Sử dụng kỹ thuật ngâm dầm để chiết tách các hợp chất có trong thực vật, cụ thể bột thảo dược được ngâm với methanol, sau đó methanol được thu hồi bằng máy cô quây chân không ở 40oC, chất còn lại sau cô quây là cao thô (Phụng, 2007)
2.2.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Quá trình chuẩn bị đĩa tẩm thảo dược được thực hiện theo phương
pháp Najiah et al (2011) Vi khuẩn V parahaemolyticus và V harveyi
được trãi trên môi trường MHA+, sau đó đặt các đĩa giấy đã được tẩm chất chiết thảo dược lên và ủ ở 28oC trong 24 giờ Đo đường kính vòng kháng khuẩn để xác định khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược
(Oometta-aree et al., 2006)
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)
Các đĩa giấy đã tẩm chất chiết thảo dược với các nồng độ 1X, 2X, 4X, 8X, 16X, 32X, 64X, Sau đó, tiến hành cho vào ống nghiệm có sẵn vi khuẩn khảo sát trong môi trường NB+ và ủ ở 28oC trong 24 giờ MIC của chất chiết thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chất chiết
trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát triển (Oometta-aree et al.,
2006)
Trang 9Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC)
Thể tích 100 μL dung dịch từ các ống nghiệm được xác định ức chế vi khuẩn khảo sát (trong dãy ống nghiệm của thí nghiệm MIC) trãi đều trên đĩa TCBS MBC của chất chiết thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chất chiết trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát
triển (Oometta-aree et al., 2006)
Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh
Phân lập và định danh V parahaemolyticus (4 chủng), V harveyi
(5 chủng) trên tôm nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Tiền Giang Sau đó tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại chất chiết có hoạt tính cao (diệp hạ châu thân đỏ, lựu, bàng, bần ổi, bần chua, diệp hạ châu thân xanh, ổi, tỏi) đối với những chủng mới phân lập từ ao tôm bệnh
2.2.4 Thí nghiệm xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng trưởng của chất chiết thảo dược ở tôm thẻ chân trắng
2.2.4.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng
Chuẩn bị thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược: Năm loại chất
chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, bần ổi và bần chua được trộn vào thức ăn viên (42% độ đạm, Grobest, Đài Loan) với nồng độ 1%; 2%
Bố trí thí nghiệm: Tôm thẻ chân trắng (1-2 g) được nuôi trong bể
composite 500 L với mật độ 70 con/bể, thể tích nước nuôi là 400 lít với độ mặn 15%0 có bố trí sục khí Những con tôm này được ăn thức ăn có có bổ sung thảo dược liên tục trong 4 tuần, 4 lần/ngày với 3-5% trọng lượng cơ thể Quản lý yếu tố môi trường nước phù hợp với sự phát triển
của tôm
Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm: Xác định tốc độ tăng trưởng
và tỷ lệ sống sau khi kết thúc thí nghiệm (4 tuần): Tăng trưởng WG(g) = Wf-Wi
Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối DWG (g/ngày)= (Wf-Wi) /T;
Trang 10Tốc độ tăng trưởng đặc biệt SGR (%/ngày)= {(lnWf-lnWi) / T} x 100;
Hệ số chuyển đổi thức ăn FCR = [Lượng thức ăn cho ăn/(Wf -Wi)] Trong đó: Wf là khối lượng cuối cùng, Wi là khối lượng ban đầu và T là tổng thời gian thí nghiệm;
Tỷ lệ sống (%) = (số lượng tôm thời điểm kết thúc thí nghiệm / số lượng tôm thời điểm bố trí thí nghiệm) x 100
2.2.4.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng
Chọn ngẫu nhiên 3 con/bể ở thí nghiệm mục 2.4.1 để xác định chỉ tiêu huyết học (THC, DHC), chỉ tiêu miễn dịch (PO, SOD, gen miễn dịch) ở thời điểm 2 tuần, 4 tuần sau khi cho ăn thức ăn bổ sung thảo dược
Phương pháp xác định tổng tế bào máu (total hemocyte count -
THC): THC được xác định theo phương pháp của Le Moullac et al
(1997) Mật độ tế bào máu được xác định bằng buồng đếm Neubauer
(Đức), được quan sát dưới kính hiển vi (40X) Tổng tế bào máu được xác định bằng công thức: THC (tế bào /mm3) = C x 10 x 5 x 10 Trong đó C là tổng số tế bào máu trên 5 vùng đếm
Phương pháp định loại bạch cầu (differential hemocyte count - DHC): Chỉ số DHC được xác định dựa theo phương pháp của Cornick và
Stewart (1978) Bạch cầu được nhuộm với Giemsa trong 30 phút và quan
sát từng loại bạch cầu dưới kính hiển vi Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào Mật độ từng loại (tế bào/mm3) = (Số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/ 200
Hoạt tính của Phenoloxidase (PO): Hoạt tính PO được xác định
dựa trên phương pháp của Herández-Lospez et al (1996) Sử dụng
Trypsin và L-DOPA trong dung dịch đệm Cacodylate Buffer để xác định hoạt tính PO Đọc kết quả ở bước sóng λ= 490 nm
Hoạt tính superoxide dismutase (SOD): Hoạt tính SOD được đo
bằng khả năng ức chế các gốc superoxide sử dụng bộ RanSOD (Randox, Crumlin, UK), đo mẫu ở bước sóng λ= 505 nm
Trang 11Biểu hiện gen miễn dịch: Sự biểu hiện của ba gen mục tiêu
(crustin, lysozyme và penaeidin-3a) và gen tham chiếu (β-actin) được định lượng bằng phương pháp realtime-PCR Sử dụng công thức Ct (2
-Ct) để phân tích mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu theo Livak & Schmittgen (2001)
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược
đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng
Chọn ngẫu nhiên 15 con/bể ở thí nghiệm mục 2.4.1 để bố trí thí nghiệm Cụ thể, bố trí với 12 nghiệm thức: 1 nghiệm thức đối chứng
âm/ĐC (-), tôm không cảm nhiễm với V parahaemolyticus và 11 nghiệm thức có cảm nhiễm với V parahaemolyticus, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tôm thí nghiệm được gây nhiễm với V parahaemolyticus bằng phương pháp ngâm (Tran et al., 2013) Tôm được theo dõi ghi nhận dấu
hiệu bệnh lý và tỉ lệ chết trong vòng 14 ngày Tỷ lệ chết tích lũy của từng nghiệm thức được xác định với công thức: Tỷ lệ chết tích luỹ (%) = (số lượng tôm chết/ số lượng tôm lúc bố trí thí nghiệm) x 100 Tôm có dấu hiệu lờ đờ được phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS và định danh
V parahaemolyticus với qui trình nested-PCR (Dangtip et al., 2015)
2.2.5 Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
2.2.5.1 Thí nghiệm bổ sung chất chiết thảo dược cho tôm thẻ chân trắng
Hai loại chất chiết bàng và bần chua bổ sung vào thức ăn viên (42% độ đạm, Grobest, Đài Loan) với nồng độ 1% Cụ thể, thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức: 1 nghiệm thức đối chứng (ĐC) (nghiệm thức này tôm ăn thức ăn không bổ sung thảo dược) và 4 nghiệm thức bổ sung thảo dược, với mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Những con tôm này ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược với nhịp bố sung sau mỗi 2 tuần và mỗi 4 tuần Thí nghiệm được thực hiện trong 8 tuần, cho ăn 4 lần/ngày với
3-5% trọng lượng cơ thể Quản lý yếu tố môi trường nước phù hợp với sự phát triển của tôm
Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm: Xác định tốc độ tăng trưởng
Trang 12và tỉ lệ sống sau khi kết thúc thí nghiệm (8 tuần): Tăng trưởng WG(g) = Wf-Wi
Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối DWG (g/ngày)= (Wf-Wi) /T; Tốc độ tăng trưởng đặc biệt SGR (%/ngày)= {(lnWf-lnWi) / T} x 100;
Hệ số chuyển đổi thức ăn FCR = [Lượng thức ăn cho ăn/(Wf -Wi)] Trong đó: Wf là khối lượng cuối cùng, Wi là khối lượng ban đầu và T là tổng thời gian thí nghiệm;
Tỷ lệ sống (%) = (số lượng tôm thời điểm kết thúc thí nghiệm / số lượng tôm thời điểm bố trí thí nghiệm) x 100
2.2.5.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng
Nguồn tôm thẻ chân trắng: Chọn ngẫu nhiên 3 con/bể ở thí
nghiệm mục 2.5.1 để xác định chỉ tiêu huyết học (THC, DHC), chỉ tiêu miễn dịch (PO, SOD, biểu hiện gen miễn dịch) ở thời điểm 4 tuần, 8 tuần sau khi cho ăn thức ăn bổ sung thảo dược
Các phương pháp phân tích: chỉ tiêu huyết học (THC, DHC), chỉ
tiêu miễn dịch (PO, SOD, biểu hiện gen miễn dịch) được thực hiện tương tự như mô tả mục 2.4.2
2.2.5.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng
Chọn ngẫu nhiên 10 con/bể ở thí nghiệm mục 2.5.1 Tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 4 tuần, 8 tuần được chuyển lên khu vực dành riêng cho hệ thống cảm nhiễm Cụ thể, thí nghiệm được bố trí với 6 nghiệm thức: 1 nghiệm thức đối chứng âm
(ĐC(-)), tôm không cảm nhiễm với V parahaemolyticus và 5 nghiệm thức có cảm nhiễm với V parahaemolyticus, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tôm thí nghiệm được gây nhiễm với V parahaemolyticus bằng phương pháp ngâm (Tran et al., 2013) Theo dõi dấu hiệu bệnh lý, ghi nhận tôm chết,
định danh vi khuẩn cảm nhiễm được thực hiện tương tự như mô tả mục 2.4.3
Trang 132.2.6 Định tính một số thành phần hợp chất hóa học trong chất chiết bàng và bần chua
Các nhóm hợp chất hóa học (alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tannins và sesquiterpene lactones) trong chất chiết bàng và bần chua được định tính bằng các phương pháp định tính các nhóm hợp chất tự nhiên (Phụng, 2007)
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được nhập bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 Sử dụng phần mềm SPSS 20.0 cho: (i) Thực hiện các phép thống kê trung bình và thống kê tần số đối với những biến định tính nhằm mô tả tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược của các hộ nuôi; (ii) Chọn phương pháp phân tích phương sai 1 nhân tố (One-Way ANOVA) sử dụng kiểm định Duncan với độ tin cậy 95% để so sánh sự khác biệt giữa các trung bình của các nghiệm thức; (iii) Sử dụng kiểm định t (Independent-Samples t test) với độ tin cậy 95% để so sánh sự khác biệt giữa trung bình của hai nhịp thu mẫu trên cùng nghiệm thức
PHẦN 3: KẾT QUẢ
3.1 Tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số địa phương thuộc vùng ĐBSCL (Cà Mau, Sóc Trăng)
3.1.1 Đặc điểm hộ nuôi và kỹ thuật nuôi
Qua khảo sát ghi nhận hộ nuôi tôm với mô hình siêu thâm canh chiếm 59,1% và thâm canh chiếm 47% trong tổng 90 hộ khảo sát Mô hình siêu thâm canh có 100% số hộ (n=22) nuôi tôm thẻ chân trắng Mô hình nuôi thâm canh có tỉ lệ hộ nuôi tôm thẻ chân trắng (72,7%) chiếm nhiều hơn hộ nuôi tôm sú (27,3%)
3.1.2 Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm
Nghiên cứu ghi nhận mô hình thâm canh có số hộ nuôi sử dụng thảo dược nhiều chiếm 60,6%, số hộ ngưng sử dụng thảo dược chiếm 18,2% và số hộ không sử dụng thảo dược 21,2% Mô hình nuôi tôm siêu thâm canh cũng ghi nhận số người sử dụng thảo dược chiếm 40,9%, số hộ ngưng sử dụng thảo dược chiếm 50% và số hộ không sử dụng thảo dược 9,1% (Bảng 3.1)
Trang 14Bảng 3.1: Thông tin về tình hình sử dụng thảo dược trong các hộ nuôi tôm ở Cà Mau và Sóc Trăng
Kết quả ghi nhận tổng số có 18 loài cây thảo dược được sử dụng trong quá trình nuôi tôm, bao gồm tỏi (n=53 hộ sử dụng), diệp hạ châu (n= 33 hộ sử dụng), ổi (n= 9 hộ sử dụng), mật gấu (n=6 hộ sử dụng), thù lù (n= 6 hộ sử dụng), tiếp theo là cỏ mực, cau, màn ri, cà gai leo, dừa nước, khổ qua đất, cam thảo đất, trầu, nghệ, mơ chuối, dây vác, trà xanh Tỉ lệ số hộ nuôi mô hình thâm canh sử dụng thảo dược nhiều hơn số hộ nuôi mô hình siêu thâm canh (Hình 3.1)
Hình 3.1: Thành phần loài cây thảo dược sử dụng trong nuôi tôm
3.1.3 Tiềm năng và nhu cầu sử dụng thảo dược trong nuôi tôm
Theo số liệu khảo sát có 45 loài thảo dược người nuôi tôm biết đến có thể sử dụng trong nuôi tôm Loài thực vật được biết đến nhiều nhất là diệp hạ châu thuộc bộ sơ ri (n= 44, chiếm 48,9%), mật gấu thuộc bộ cúc (n= 26, chiếm 28,9%), ổi thuộc bộ đào kim nương (n= 18, chiếm 20%), thù lù thuộc bộ cà (n= 14, chiếm 15,6%), ô rô thuộc bộ húng (n= 14, chiếm 15,6%), cỏ mực thuộc bộ cúc (n= 10, chiếm 11%), màn ri thuộc bộ sơ ri (n= 5, chiếm 5,6%) Đặc biệt, diệp hạ châu, ổi, thù lù, mật gấu đã được nhóm hộ “đang sử dụng thảo dược” đánh giá có hiệu quả trong nuôi
Đang sử dụng thảo dược (n=49) 40,9 (n=9) 60,6 (n=40) 0 Ngưng sử dụng thảo dược (n=23) 50,0 (n=11) 18,2 (n=12) 0 Không sử dụng thảo dược (n=18) 9,1 (n=2) 21,2 (n=14) 100 (n=2)