Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
HỒ VIẾT HOÀNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
LIỆU PHÁP CAR-T TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO TIỀN LÂM SÀNG
Ngành: Ung thư Mã số: 9 72 01 08
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
HÀ NỘI - 2024
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Cấn Văn Mão
2 PGS.TS Nghiêm Thị Minh Châu
Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thanh Bình Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Phản biện 3: GS.TS Nguyễn Văn Ba
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
vào hồi: giờ ngày tháng năm 2024
Có thể tìm hiểu luận án tại: 1 Thư viện Quốc Gia 2 Thư viện Học viện Quân y
Trang 3ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp dòng lympho (Acute lymphoblastic leukemia: ALL) là bệnh lý tăng sinh ác tính các tế bào dòng lympho của cơ quan tạo máu Mặc dù, đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong điều trị và tỷ lệ sống sót càng ngày càng được cải thiện Tuy nhiên, có tỉ lệ 2-3% bệnh nhân (BN) kháng trị và 10-15% tái phát sau điều trị ban đầu, thời gian sống toàn bộ trung bình chỉ 6 tháng Sự ra đời liệu pháp CAR-T sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo CAR (Chimeric antigen receptors) nhắm đích trên tế bào ung thư là cuộc cách mạng trong điều trị lơ xê mi cấp, CAR-T được xem là “thuốc sinh học” vừa có cơ chế điều trị như liệu pháp nhắm đích, vừa diệt tế bào ung thư qua cơ chế miễn dịch Hơn nữa, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh và tồn tại lâu hơn trong cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát, kháng trị Tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu tạo và ứng dụng khối tế bào CAR-T điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho Bệnh viện đa khoa VINMEC bước đầu thử nghiệm lâm sàng pha I nhưng chế phẩm bằng công nghệ sẵn có từ nước ngoài Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu với 2 mục tiêu:
1 Đánh giá hiệu quả chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T, khả năng tăng sinh, hoạt hóa tiết cytokin (IL-2, TNF-α và IFN-γ) và ly giải tế bào ung thư lympho B-CD19 (+) của khối tế bào CAR-T
2 Đánh giá hiệu quả điều trị của khối tế bào CAR-T trên mô hình chuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+)
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Trên thế giới, liệu pháp CAR-T đã được cấp phép không những ở BN lơ xê mi cấp dòng lympho B mà còn mở rộng các mặt bệnh khác như đa u tủy xương, u lympho ác tính tế bào B kháng trị và hoặc tái phát Để tạo tế bào CAR-T bước chuyển nạp gen vào tế bào lympho T là bước quan trọng, sử dụng véc tơ vi rút là phương pháp đạt hiệu quả chuyển gen cao, tích hợp cấu trúc gen vào tế bào ổn
Trang 4định, tuy nhiên kỹ thuật phức tạp, giá thành đắt đỏ nên bệnh nhân khó tiếp cận Gần đây, các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của phương pháp chuyển nạp gen không sử dụng vertor vi rút mà bằng hệ thống “Sleeping Beauty” với kết quả đáp ứng lâm sàng tiềm năng, ít độc tính, chi phí thấp Với những điều kiện hiện cơ sở vật chất hiện có tại Học viện Quân y, chúng tôi đã tạo khối tế bào CAR-T bằng phương pháp chuyển nạp véc tơ vào tế bào T sử dụng hệ thống “Sleeping Beauty” Đánh giá khả năng tăng sinh, hoạt hóa tiết cytokin (IL-2, TNF-α và IFN-γ) và ly giải tế bào ung thư lympho B-CD19 (+) của khối tế bào CAR-T cũng như đánh giá hiệu quả trên mô hình chuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+)
CẤU TRÚC LUẬN ÁN
Luận án gồm 127 trang (không kể tài liệu tham khảo và phụ lục), 4 chương, 12 bảng, 25 biểu đồ, 17 hình, 1 sơ đồ; 177 tài liệu tham khảo, trong đó có: 05 tài liệu tiếng Việt và 172 tài liệu tiếng Anh Đặt vấn đề: 02 trang, tổng quan tài liệu: 33 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 25 trang, kết quả nghiên cứu: 30 trang, bàn luận: 23 trang, kết luận: 02 trang, kiến nghị: 01 trang
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Lơ xê mi cấp dòng lympho
1.1.5 Điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho
Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho với mục đích tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Hóa trị liệu là phương pháp điều trị kinh điển và phổ biến, nhưng hạn chế của các liệu pháp là hầu như không có khả năng chữa khỏi bệnh triệt căn mà chỉ hướng đến lui bệnh hoàn toàn Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp mang lại nhiều hiệu quả, áp dụng được cho cả những trường hợp bệnh tái phát hoặc tiến triển sau hóa chất nhưng việc tìm được mẫu tế bào gốc có mức độ hòa hợp HLA đạt yêu cầu là rất khó khăn, không phải lúc nào cũng thực hiện được Một hướng tiếp cận mới là liệu pháp sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo Nguyên tắc
Trang 5của liệu pháp CAR-T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bào T mang các thụ thể nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư từ đó kích hoạt khả năng ly giải tế bào ung thư của tế bào T Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay cả ở những trường hợp đã kháng với hóa trị, xạ trị Đặc biệt, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh và tồn tại lâu dài trong cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát
1.2 Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho
1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T
Năm 1989 Eshhar Z và công sự lần đầu tiên tạo ra cấu trúc mã hóa thụ thể khảm của tế bào T ở người Năm 1993, Eshhar Z và đồng tác giả đã tạo ra cấu trúc thụ thể dạng khảm trên tế bào T và kích thích chúng biểu hiện thành “scFvRζ T cells” (tế bào CAR-T thế hệ đầu tiên) Năm 1998, bằng cách gắn thêm một phân tử đồng kích thích (costimulatory signaling domain) của phân tử CD28 hoặc 4-1BB vào giữa vùng scFv và chuỗi CD3ζ tạo CAR-T thế hệ thứ 2 Năm 2003, Sadelain M và CS lần đầu tiên chỉ ra rằng tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 có khả năng diệt trừ tế bào B ác tính trên mô hình chuột SCID/Beige Vào năm 2009, quy trình công nghệ sản xuất tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 lần đầu tiên được công bố; thử nghiệm lâm sàng Pha I đã được tiến hành trên các bệnh nhân mắc bạch cầu lympho mãn tính (CLL) và bạch cầu lympho cấp tính (ALL) Đến năm 2017, FDA đã cho phép dùng liệu pháp tế bào CAR-T trong chữa trị B-ALL ở người lớn và trẻ em và gần đây đã mở rộng chỉ định ở bệnh nhân đa u tủy xương, u lympho ác tính tế bào B kháng trị và hoặc tái phát
1.2.2 Cấu trúc tế bào CAR-T
CAR là các cấu trúc thụ thể nhân tạo, bao gồm 3 đun: mô-đun ngoại bào, mô-mô-đun xuyên màng và mô-mô-đun nội bào
1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T
Hiện nay, tế bào CAR-T phát triển 4 thế hệ và khác nhau chủ
Trang 6yếu ở mô đun nội bào Thế hệ thứ nhất sử dụng CD3 zeta hoặc FcεRIγ làm mô-đun nội bào, tuy nhiên cấu này không sản xuất đủ IL-2 cần thiết để duy trì hoạt động diệt tế bào ung thư Thế hệ hai đã tích hợp thêm một phân tử đồng kích thích như CD28, CD134(OX-40) hoặc CD137(4-1BB) tăng tổng hợp IL-2 có vài trò tăng sinh và tồn tại tế bào CAR-T Thế hệ thứ ba trong cấu trúc có sử dụng đồng thời nhiều vùng đồng kích thích như OX-40-CD3ζ hoặc CD28-CD137-CD3ζ, với mục đích tăng cường hơn nữa khả năng sinh IL-2 và khả năng diệt tế bào ung thư Tế bào CAR-T thế hệ tư được tạo nên từ nền tảng thế hệ thứ 2, tích hợp trong cấu trúc gen mã hóa protein tăng sinh IL-12 hoặc IL-15 IL-12 giúp tế bào tăng sinh tổng hợp IFN-γ, hoạt hóa tế bào NK (Natural Killer cells), đại thực bào (macrophage) tham gia diệt tế bào ung thư IL-15 giúp rút ngắn thời gian tăng sinh tế bào CAR-T
1.3 Các kỹ thuật để tạo khối tế bào CAR-T
1.3.4 Quy trình tạo khối tế bào CAR-T
Quy trình chung tạo khối tế bào CART đã được chuẩn hóa tương đối, tuy nhiên có sự khác nhau ở các bước, bao gồm phân lập và làm giàu nguồn tế bào T ban đầu, kích hoạt hóa tế bào T, nuôi cấy tăng sinh tế bào T, chuyển cấu trúc di truyền vào tế bào T bằng véc tơ vi rút hoặc hệ thống véc tơ không vi rút, tiếp theo là nuôi cấy tăng sinh tế bào
CAR-T ex vivo
1.3.4.3 Chuyển gen tạo khối tế bào CAR-T
Chuyển gen là bước rất quan trọng trong sản xuất tế bào CAR-T, quyết định hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng như giá thành của sản phẩm Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen có thể được áp dụng vào tế bào T như tải nạp bằng véc tơ vi rút, transposons, mARN hoặc sử dụng hạt nano, liposome, kỹ thuật xung điện (electroporation) Tuy nhiên, có hai loại phương pháp chính đã được thử nghiệm lâm sàng là tải nạp bằng vi rút và transposon kết hợp với kỹ thuật xung điện So với các véc tơ vi rút truyền thống, transposon có ưu điểm cơ bản là giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần (do bản
Trang 7chất của các cấu trúc là các plasmid), an toàn hơn Transposon là các yếu tố di truyền kép, bao gồm một plasmid mang cấu trúc CAR và một plasmid mang gen mã hóa transposase Cơ chế của các phương pháp này là enzyme transposase sẽ nhận biết và bám vào các vùng ITR (inverted terminal repeats: trình tự lặp đầu cuối đảo ngược) tại hai đầu của cấu trúc cần chuyển, sau đó cắt và dán cấu trúc di truyền vào hệ gen tế bào chủ
CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Động vật
30 chuột thiếu hụt miễn dịch (NOD/SCID) gây mô hình bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho nhập khẩu từ Công ty Charles-River (Hoa Kỳ)
2.1.2 Chất liệu nghiên cứu
- Máu ngoại vi được hiến tặng bởi các tình nguyện viên khỏe mạnh và được thu trong các ống chuyên dụng
- Tế bào Daudi (ATCC CCL-213) dòng tế bào ung thư hạch lympho CD19 + Burkitt (ATCC, Hoa Kỳ)
- Tế bào K562 (ATCC CCL-243) - chronic myelogenous
leukemia (CML)
- Tế bào K562 nhân tạo sau khi chuyển nạp gen biểu hiện đồng thời CD19, CD64, CD86, và CD137; kí hiệu là 1D2 - sản phẩm của đề tài Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia Mã số KC 10.39/16-20
- Plasmid pmaxGFP (Lonza Biosciences)
- Plasmid pSB100X (pCMV(CAT)T7-SB100, #34879)
- Plasmid CD19RCD137/pSB,Minicircle CD19RCD137/pSB mã hóa phân tử CAR thế hệ thứ hai kháng CD19 là sản phẩm của đề tài Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia Mã số KC 10.39/16-20
-PlasmidCD19RCD137-iCasp9-IL15/pSB,minicircle
CD19RCD137-iCasp9-IL15/pSB mã hóa phân tử CAR thế hệ thứ hai kháng CD19 là sản phẩm của đề tài Nghiên cứu ứng dụng và phát
Trang 8triển công nghệ cấp quốc gia Mã số KC 10.39/16-20
- mARN SB100X (mã hóa sleeping beauty transpoase) được
phiên mã in vitro tại phòng thí nghiệm Kỹ thuật Gen, Trung tâm
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Là sản phẩm của đề tài Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia Mã số KC 10.39/16-20
- Hạt từ Dynabeads CD3/CD28 để kích hoạt tế bào lympho T - IL-2 tái tổ hợp
2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
2.1.3.1 Thiết bị sử dụng
Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ nuôi cấy tế bào: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, tủ âm - 200C, - 800C, bình chứa Nitơ lỏng, 4D Nucleofector core Unit (Lonza), máy đếm sống chết (Countess II FL), Flow cytometer BD FACSLyric (BD Bioscience)
2.1.3.3 Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao
Đĩa nuôi cấy tế bào các kích cỡ khác nhau, các đĩa nuôi cấy tế bào đa giếng; pipet các kích cỡ, ống falcon 15ml và 50 ml; ống eppendorf 1,5 ml và 2ml; các dụng cụ tiêu hao khác
2.1.3.2 Hoá chất
- Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (foetal Bovine Serum) và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin) được lọc qua màng lọc vô trùng
- Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI-1640 Medium (GIBCO), bổ sung 10% dung dịch huyết thanh bào thai bê (FBS)
- Dung dịch đệm PBS 1X, cồn 70 độ, Trypsin-EDTA 1X, dung dịch cố định tế bào, dung dịch dimethyl sulphooxide (DMSO)…
- Bộ kít ELISA định lượng IL-2, IFN-γ, TNF-α được cung cấp bởi Thermo Fisher Scientific
- Hoá chất nhuộm sử dụng đếm tế bào sống chết: Ficoll-Paque Premium, Trypan Blue 0,4% (Thermo Fisher), BSA (Hyclone)
- Kit chuyển nạp P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM
Trang 92.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ tế bào máu ngoại vi 2.2.3 Phương pháp kích hoạt tế bào T bằng hạt từ phủ kháng thể kháng CD3/CD28
2.2.4 Phương pháp tối ưu hóa chuyển nạp véc vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector
2.2.5 Chuyển nạp các cấu trúc Plasmid và minicircle Sleep beauty vào tế bào T bằng công nghệ Nucleofector
2.2.6 Phương pháp bất hoạt tế bào trình diện kháng nguyên K562 làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T
2.2.8 Phương pháp nuôi cấy, tăng sinh tế bào CAR-T
2.2.9 Phương pháp đánh giá khả năng tăng sinh và khả năng ly giải các dòng tế bào ung thư CD19+ của các tế bào CAR-T
2.2.10 Phương pháp định lượng IL-2, TNF- và IFN- bằng kỹ thuật ELISA
2.2.11 Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch
2.2.12 Phương pháp điều trị chuột mô hình mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19(+) bằng khối tế bào CAR-T
2.2.13 Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị trên chuột mô hình mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19(+) bằng khối tế bào CAR-T
2.3 Phân tích số liệu
Để phân tích và xử lý số liệu, chúng tôi đã dùng các thuật toán thống kê sử dụng phần mềm SPSS 20 và vẽ đồ thị bằng phần mềm GraphPad Prism 10.0.2 Sử dụng các thuật toán phù hợp
2.4 Đạo đức trong nghiên cứu
30 chuột NOD/SCID 6 đến 8 tuần tuổi mua từ Công ty Charles-River (Hoa Kỳ) Chuột được chăm sóc theo quy trình của Học viện Quân y Quá trình thực hiện các thí nghiệm tuân thủ nghiêm các khía cạnh đạo đức đối với động vật
Đối tượng tình nguyện tham gia hiến máu để phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi phục vụ nghiên cứu là người khỏe mạnh Tuân thủ các quy định về đạo đức nghiên cứu trên người do Bệnh viện Quân y 103 ban hành, số quyết định 180/CNChT-HĐĐĐ
Trang 10CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T tạo khối tế bào CAR-T
3.1.1 Tối ưu hóa thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi
3.1.2 Tối ưu hóa chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T
3.1.2.1 Kết quả kích hoạt tế bào T bằng hạt từ Dynabeads CD3/CD28 3.1.2.2 Tối ưu số lượng tế bào cho phản ứng chuyển nạp
Biểu đồ 3.2 Tối ưu hóa lượng PBMC cho một phản ứng chuyển nạp
Sử dụng 2x107 cho một phản ứng cho hiện suất biểu hiện cao hơn so với lượng cơ chất 5x106 và 107 (p <0,05), tỷ lệ biểu hiện đạt 22,18 %
3.1.2.3 Tối ưu hóa lượng plasmid cho phản ứng chuyển nạp
Biểu đồ 3.3 Tối ưu hóa lượng cơ chất CD19RCD137/pSB cho một
phản ứng chuyển nạp (n=3)
Chuyển nạp với lượng cơ chất 10 µg CD19RCD137/pSB cho hiệu suất chuyển nạp, tỷ lệ tế bào sống và số tế bào CAR-T thu được cao hơn có ý nghĩa so với sử dụng 5 µg (p<0,05)
Trang 113.1.3 Kết quả chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle sleep beauty vào tế bào T
3.1.3.1 Chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle Sleeping Beauty vào tế bào T
Biểu đồ 3.4 Hiệu suất chuyển nạp vào PBMC khi sử dụng các
plasmid và minicircle (n=3)
Chuyển nạp cấu trúc plasmid và minicircle tạo tế bào CAR-T thế hệ 2 cho hiệu suất chuyển nạp cao hơn so với thế hệ thứ 4 (25,88% so với 14,72%) Kết quả tương tự khi chuyển nạp cấu trúc tối giản minicircle so với plasmid (35,12% so với 23,48%) với p<0,05
3.1.3.2 Kết quả đánh giá hiệu quả quá trình chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle Sleeping beauty vào tế bào T
Trang 12Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ tế bào sống sau chuyển nạp với các plasmid và
minicircle tạo tế bào CAR-T (n=3)
Tỷ lệ tế bào sống sau chuyển nạp cấu trúc plasmid cũng như cấu trúc minicircle thế hệ 2 cao so với thế hệ 4 Tỷ lệ tế bào sống chuyển nạp cấu trúc minicircle cao hơn cấu trúc plasmid (p<0,005)
3.2 Đánh giá khả năng tăng sinh khối tế bào CAR-T
3.2.1 Bất hoạt tế bào K562 đồng biểu hiện các thụ thể CD19, CD64, CD86 và CD137 bằng tia X làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T
3.2.2 Tăng sinh khối tế bào CAR-T khi bổ sung IL-2
3.2.3 Tăng sinh khối CAR-T trong môi trường tế bào 1D2 bất hoạt bằng tia X
3.2.3.1 Đánh giá số lượng tế bào CAR-T theo thời gian
Kết quả (biểu đồ 3.9) cho thấy hai thế hệ tế bào CAR-T tăng sinh hiệu quả khi đồng nuôi cấy với aAPC 1D2 và IL-2 Khả năng tăng sinh của 2 thế hệ tế bào CAR-T là tương đương nhau trong 14 ngày đầu và bắt đầu có sự khác biệt từ ngày 21 (p>0,05)
Trang 13Biểu đồ 3.9 Số tế bào CAR-T trong quá trình tăng sinh (n=3)
3.2.3.2 Phân tích biểu hiện CAR trên bề mặt tế bào
Sau 21 ngày tăng sinh, kết quả (biểu đồ 3.10) cho thấy biểu hiện CAR thế hệ 4 cao hơn thế hệ 2, lần lượt 78,62% so với 66,23% (p<0,05)
Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ tế bào biểu hiện thụ thể CAR sau 21 ngày tăng
sinh (n=3)
3.2.4 Đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào CAR-T khi nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư lympho B CD19 (+)
Kết quả sau 4 ngày nuôi cấy tế bào CAR-T bổ sung môi trường các dòng tế bào Daudi (CD19+), 1D2 (CD19+), và K562 (CD19-) với tỷ lệ 1:1 Kết quả (Biểu đồ 3.13) cho thấy CAR-T thế hệ 2 và thế hệ 4 đều có khả năng tăng sinh khi đồng nuôi cấy với tế bào CD19+ và không tăng sinh với tế bào K562 (CD19-)