Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CAR-T trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng

Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng

HỌC VIỆN QUÂN Y

NCS HỒ VIẾT HOÀNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG

LIỆU PHÁP CAR-T TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNHLƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO TIỀN LÂM SÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

HỌC VIỆN QUÂN Y

NCS HỒ VIẾT HOÀNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG

LIỆU PHÁP CAR-T TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNHLƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO TIỀN LÂM SÀNG

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu cấp Nhà nước mã số: KC.10.39/16-20 có tên “Nghiên cứuứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bàolympho cấp” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là

một thành viên chính Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng một phần số liệu đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Hồ Viết Hoành

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc !

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện, Bộ môn Ung bướu, Bộ môn Sinh lý bệnh, Phòng Sau đại học, Phòng khảo thí, Học viện Quân y đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Quân y 103, Bộ môn - Trung tâm Ung bướu, Khoa Hóa trị đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Cấn Văn Mão, PGS.TS Nghiêm Thị Minh Châu, những người thầy đã tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến các thầy cô trong hội đồng chấm luận án đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án này Ý kiến của các thầy, cô là những bài học cho tôi trên con đường tiếp tục nghiên cứu học tập.

Xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ vô tư, tận tình của các anh chị đi trước, đồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới công ơn nuôi dạy của cha mẹ tôi, sự quan tâm giúp đỡ, động viên của vợ, con, anh, em và bạn bè thân thiết để tôi có được ngày hôm nay.

Hà nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả luận án

Hồ Viết Hoành

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Lơ xê mi cấp dòng lympho 3

1.1.1 Tình hình mắc lơ xê mi cấp dòng lympho trên thế giới 3

1.1.2 Sinh lý bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho 3

1.1.3 Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho 4

1.1.4 Phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho 4

1.1.5 Điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho 6

1.2.Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho 9

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T 9

1.2.2 Cấu trúc thụ thể nhân tạo CAR 10

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T 12

1.3.Các kỹ thuật để tạo khối tế bào CAR-T 15

1.3.1 Sản xuất plasmid bằng E coli 15

1.3.2 Tinh sạch plasmid ADN 15

1.3.3 Tạo tế bào CAR-T sử dụng hệ thống sleeping beauty transposon 16

1.3.4 Quy trình tạo khối tế bào CAR-T 17

1.4.Độc tính của liệu pháp CAR-T với cơ thể 28

1.4.1.Hội chứng giải phóng cytokine và hội chứng nhiễm độc thần kinh 28

1.5.Tình hình nghiên cứu CAR-T 31

1.5.1.Các nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng của khối tế bào CAR-T 31

1.5.2 Các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng khối tế bào CAR-T điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho 33

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1.Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.1 Động vật 36

2.1.2 Chất liệu nghiên cứu 36

2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 37

2.2.Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ tế bào máu ngoại vi 39

2.2.2 Đánh giá tỉ lệ tế bào chết và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế

2.2.5 Chuyển nạp các cấu trúc Plasmid và minicircle Sleep beauty vào tế bào T bằng công nghệ Nucleofector 46

2.2.6 Phương pháp bất hoạt tế bào trình diện kháng nguyên K562 làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 47

2.2.7 Phương pháp nuôi cấy tế bào Daudi 48

2.2.8 Phương pháp nuôi cấy, tăng sinh tế bào CAR-T 49

2.2.9 Phương pháp đánh giá khả năng tăng sinh và khả năng ly giải các dòng tế bào ung thư CD19+ của các tế bào CAR-T 49

2.2.10 Phương pháp định lượng IL-2, TNF-  và IFN-  bằng kỹ thuật ELISA 51

2.2.11 Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch 53

lympho B-CD19(+) bằng khối tế bào CAR-T 53

2.2.13.Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng khối tế bào CAR-T 54

2.3.Phân tích số liệu 59

2.4.Đạo đức trong nghiên cứu 59

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1.Chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T tạo khối tế bào CAR-T 61

3.1.1 Tối ưu hóa thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi 61

3.1.2 Tối ưu hóa chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T 63

3.1.3 Kết quả chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle sleep beauty vào tế bào T 67

3.2.Đánh giá khả năng sinh khối tế bào CAR-T 69

3.2.1 Bất hoạt tế bào K562 đồng biểu hiện các thụ thể CD19, CD64, CD86 và CD137 bằng tia X làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 69

3.2.2 Tăng sinh khối tế bào CAR-T khi bổ sung IL-2 71

3.2.3 Tăng sinh khối CAR-T trong môi trường tế bào 1D2 đã bất hoạt bằng tia X 71

3.2.4 Đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào CAR-T khi nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư lympho B CD19 (+) 74

3.3.Đánh giá khả năng hoạt hóa tiết IL-2, TNF-α và IFN-γ của các tế bào CAR-T 76

3.3.1 Khả năng hoạt hóa tiết IL-2 của khối tế bào CAR-T 76

3.3.2 Khả năng hoạt hóa tiết TNF-α của khối tế bào CAR-T 78

3.3.3 Khả năng hoạt hóa tiết IFN-γ của khối tế bào CAR-T 79

3.4.Đánh giá khả năng ly giải tế bào ung thư lympho B CD19(+) của tế bào CAR-T 80

3.5.Đánh giá hiệu quả điều trị của khối tế bào CAR-T trên mô hình chuột NOD/Sicd mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19(+) 83

3.5.1 Mức độ ảnh hưởng đến toàn trạng của chuột 83

3.5.2 Hoạt độ luciferase trong máu chuột ở các nhóm 88

lách của chuột 89

Chương 4 BÀN LUẬN 91

4.1.Chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T tạo khối tế bào CAR-T 91

4.1.1 Hiệu quả tối ưu hóa thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi 91

4.1.2 Hiệu quả tối ưu hóa chuyển nạp vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector 93

4.1.3 Chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle sleep beauty vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector 97

4.2.Khả năng sinh khối tế bào CAR-T 100

4.2.1 Bất hoạt dòng tế bào K562 nhân tạo đồng biểu hiện CD19, CD64, CD86 và CD137 bằng tia X làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 100

4.2.2 Tăng sinh khối tế bào CAR-T 102

4.3.Đánh giá khả năng hoạt hóa tiết IL-2, TNF-α và IFN-γ của khối tế bào CAR-T 103

4.4.Khả năng ly giải tế bào ung thư lympho B-CD19+ của tế bào CAR-T 105

4.5.Hiệu quả điều trị của tế bào CAR-T trên T trên mô hình chuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+) 107

4.5.1 Tình trạng toàn thân, trọng lượng chuột trước và trong quá trình điều trị 107

4.5.2 Thời gian sống, tỉ lệ sống, tỉ lệ sống tích lũy của chuột NOD/SCID sau thời gian điều trị bằng tế bào CAR-T 108

4.5.3.Đánh giá hiệu quả điều trị qua hoạt độ luciferase trong máu chuột 108

4.5.4.Khả năng hoạt hóa tế bào miễn dịch ở máu ngoại vi và lách của chuột 109

KIẾN NGHỊ

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ

116

TTPhần viết tắtPhần viết đầy đủ

1 ALL Acute Lymphocytic Leukemia (bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho)

2 Allo-HSCT Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài)

3 ARID5B AT-Rich Interaction Domain 5B (gen mã hoá protein chứa miền tương tác giàu AT5B)

5 APC Antigen Presenting Cell (tế bào trình diện kháng nguyên)

6 ATMP Advanced Therapy Medicinal Products (chế phẩm thuốc trị liệu tiên tiến)

8 CAR Chimeric Antigen Receptor (thụ cảm thể dạng khảm) 9 CAR-T Chimeric Antigen Receptor T cell (tế bào lympho T

mang thụ cảm thể nhân tạo)

10 CD Cluster of Differentiation (dấu ấn miễn dịch)

11 CDC Complement Dependent Cytotoxicity (độc tế bào phụ

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Caspase 9 (hệ thống chỉnh sửa gen)

14 CLL

dòng lympho)

15 CR Complete Response (đáp ứng hoàn toàn)

16 CRS Cytokine Release Syndrome (hội chứng giải phóng cytokin)

17 CTL Cytotoxic T lymphocyte (tế bào lypmho T gây độc) 18 ADN Axit Deoxyribonucleic

19 FAB French-American-British (hệ thống phân loại của

23 HLA Human Leukocyte Antigen system (hệ thống kháng nguyên bạch cầu ở người)

24 HSV-TK Herpes Simplex Vi rút Tyrosine Kinase (enzyme tyrosine kinase của vi rút gây bệnh Herpes)

Immune effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome (hội chứng nhiễm độc thần kinh liên quan

30 NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells (yếu tố nhân của tế bào T hoạt hóa)

32 NK Natural Killer (tế bào giết tự nhiên)

33 NOD Non-Obese Diabetic (tiểu đường không béo phì) 34 OE-PCR Overlap extension PCR (phản ứng khuyếch đại gen

mở rộng, chồng lấn)

35 PAS Periodic Acid Schiff (kỹ thuật nhuộm phát hiện chất nhầy bào tương trong tế bào)

36 PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell (tế bào đơn nhân máu ngoại vi)

37 PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuyếch đại gen)

38 SB Sleeping Beauty (hệ thống chuyển vị cấu trúc di truyền có tên là Sleeping beauty)

39 scFv Single-chain variable fragment (kháng thể đơn chuỗi)

40 SCID Severe Combined ImmunoDeficiency (suy giảm miễn dịch kết hợp mức độ nặng)

41 SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results (kết quả giám sát dữ liệu dịch tễ học của Hoa Kỳ)

42 SDI Socio-Demographic Index (chỉ số nhân khẩu học) 43 TNF Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoạt tử u)

44 WHO World Health Organization (tổ chức y tế thế giới)

BảngTên bảngTrang

1.1 Phân loại theo FAB 1986 5

1.2 Phân loại ALL theo WHO 2016 5

1.3 Phương pháp nuôi cấy CAR-T 26

3.1 Kết quả đếm tế bào và phân tích flow cytometry các mẫu PBMC

với tỉ lệ pha loãng máu với PBS1X khác nhau 62

3.2 Kết quả đếm tế bào sau 60h nuôi cấy 64

3.3 Nồng độ IL-2 trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư máu 76

3.4 Nồng độ TNF-α trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 78

3.5 Nồng độ IFN-γ trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 79

3.6 So sánh trọng lượng trung bình chuột trước điều trị (g) 84

3.7 Thời gian sống sót của các nhóm chuột điều trị 85

3.8 Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở các nhóm nghiên cứu 87

3.9 Kết quả hoạt độ luciferase trong máu chuột ở các nhóm 88

Biểu đồTên biểu đồTrang

3.1 Ảnh hưởng của quá trình rửa đến hiệu suất thu hồi tế bào lympho 61

3.2 Tối ưu hóa lượng PBMC cho một phản ứng chuyển nạp 64

3.3 Tối ưu hóa lượng cơ chất CD19RCD137/pSB cho một phản ứng

3.6 Chiếu xạ bất hoạt tế bào K562 69

3.7 Số lượng tế bào sống sau tia xạ ở các liều khác nhau 70

3.8 Số tế bào sống khi tăng sinh với IL-2 71

3.9 Số tế bào CAR-T trong quá trình tăng sinh 72

3.10 Tỉ lệ tế bào biểu hiện thụ thể CAR sau 21 ngày tăng sinh 73

3.11 Kết quả đại diện phân tích biểu hiện CAR bằng flow cytometry 73

3.12 Phân tích biểu hiện CAR trên bề mặt tế bào CAR-T thu nhận được

sau 28 ngày tăng sinh 73

3.13 Khả năng tăng sinh của tế bào CAR-T khi đồng nuôi cấy với tế bào

CD19+ 75

3.14 Khả năng tăng sinh của CAR-T khi không có sự hiện diện của tế

bào CD19+ 76

3.15 Nồng độ IL-2 trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư máu 77

3.16 Nồng độ TNF-α trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 78

3.17 Nồng độ IFN-γ trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư máu 80

3.18 Tỉ lệ tế bào K562 CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 81

3.19 Tỉ lệ tế bào Daudi CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 82

3.20 Tỉ lệ tế bào 1D2 CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 82

3.21 Minh họa khả năng ly giải tế bào CD19 (Daudi)+ của CAR-T 83

3.22 Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g) 84

3.23 Biểu đồ tích lũy sống sót theo thời gian của chuột giữa các nhóm

nghiên cứu 86

3.24 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở máu ngoại vi của chuột điều trị với CAR-T thế hệ 2 và nhóm chứng 89

3.25 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở lách của chuột điều trị

với CAR-T thế hệ 2 và nhóm chứng 90

HìnhTên hìnhTrang

1.1 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho T 11

1.2 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T 12

1.3 Các bước sản xuất tế bào CAR-T 17

1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty 24

1.5 Biểu hiện và sự tăng sinh của CAR-T 27

2.1 Kính hiển vi đảo ngược Nikon eclipse Ti2 và máy chuyển nạp

Amaxa™ 4D-Nucleofector 38

2.2 Phân tách tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi toàn phần 39

2.3 Hình ảnh đại diện phân tích PBMC bằng flow cytometry 40

2.4 Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACSuite™ đánh giá tỉ lệ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử 43

2.5 Bất hoạt tế bào trình diện kháng nguyên K562 đồng biểu hiện các

thụ thể CD19, CD64, CD86 và CD137 48

2.6 Buồng nuôi chuột NOD/SCID 53

2.7 Tiêm tế bào CAR-T vào phúc mạc 54

2.8 Theo dõi tình trạng sức khoẻ chuột 55

2.9 Máy đo hoạt độ luciferase TD-20/20 Luminometer hãng Turner

Designs Hoa Kỳ 55

2.10 Kỹ thuật lấy máu mắt chuột 57

3.1 Đĩa nuôi PBMC 60h sau kích hoạt 63

3.2 Hình ảnh đại diện quan sát chuột sau 7 ngày điều trị ở 3 nhóm 83

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi cấp dòng lympho (Acute lymphoblastic leukemia: ALL) là bệnh lý tăng sinh ác tính các tế bào dòng lympho của cơ quan tạo máu Bệnh thường gặp ở nhóm từ 2 - 5 tuổi Hầu hết các trường hợp bệnh lơ xê mi cấp không có nguồn gốc từ một di truyền báo trước mà từ thay đổi đột biến di truyền mắc phải (somatic) [1] Theo thống kê trên thế giới, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 1 đến 4 ca/100.000 dân tùy vào vùng địa lý [2] Tại Hoa Kỳ, ước tính trong năm 2021 có khoảng 5.690 trường hợp mới mắc và khoảng 1.580 trường hợp tử vong do ALL [3].

Điều trị bệnh ALL bao gồm 3 giai đoạn chính là: cảm ứng, củng cố và duy trì Hóa trị liệu là phương pháp điều trị kinh điển, phổ biến đối với bệnh này Mặc dù, đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong điều trị và tỷ lệ sống sót càng ngày càng được cải thiện Tuy nhiên, có 2-3% bệnh nhân kháng với các nhóm hóa chất trong giai đoạn cảm ứng và 10-15% tái phát sau điều trị ban đầu thành công và thời gian sống trung bình ở nhóm này chỉ đạt 6 tháng Các nghiên cứu cũng chỉ ra trong số 80 - 90% bệnh nhân (BN) đáp ứng ban đầu chỉ có tỷ lệ 30-40% đáp ứng thuyên giảm lâu dài [4], [5].

Thách thức đối với các nhà khoa học là tìm ra các phương pháp điều trị mới làm tăng tỷ lệ và duy trì thời gian đáp ứng cũng như kéo dài thời gian sống đối với mặt bệnh này, đặc biệt ở những BN kháng và hoặc tái phát sau điều trị Sự ra đời liệu pháp CAR-T sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo CAR (Chimeric antigen receptors) nhắm đích trên tế bào ung thư là cuộc cách mạng trong điều trị lơ xê mi cấp, CAR-T được xem là “thuốc sinh học” vừa có cơ chế điều trị như liệu pháp nhắm đích, vừa diệt tế bào ung thư qua cơ chế miễn dịch Hơn nữa, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh và tồn tại lâu hơn trong cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát, kháng trị Hiện nay, liệu pháp CAR-T không những được cấp phép điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B mà

còn mở rộng chỉ định đối với các bệnh lý khác như bệnh đa u tủy xương, u lympho ác tính tế bào B kháng trị và hoặc tái phát Tế bào CAR-T phát triển 4 thế hệ, thế hệ thứ nhất thời gian tồn tại ngắn nên ít được ứng dụng, thế hệ thứ 3 và thế hệ 4 ưu việt hơn nhưng đang trong giai đoạn thử nghiệm, các liệu pháp CAR-T sử dụng trên lâm sàng hiện nay là thế hệ thứ 2 [6] Chuyển nạp gen vào tế bào lympho T là bước quan trọng để tạo tế bào CAR-T, sử dụng véc tơ vi rút là phương pháp đạt hiệu quả chuyển gen cao, tích hợp cấu trúc gen vào tế bào ổn định, tuy nhiên kỹ thuật phức tạp, giá thành đắt đỏ nên bệnh nhân khó tiếp cận Gần đây, các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của phương pháp chuyển nạp gen không sử dụng véc tơ vi rút mà bằng hệ thống “Sleeping Beauty” với kết quả đáp ứng lâm sàng tiềm năng, ít độc tính, chi phí thấp [7] Tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu tạo và ứng dụng khối tế bào CAR-T Bệnh viện đa khoa VINMEC bước đầu thử nghiệm lâm sàng pha I đối với BN lơ xê mi cấp dòng lympho B và u lympho ác tính không Hodgkin tế bào B, tuy nhiên khối tế bào CAR-T được tạo ra từ hệ thống chuyển gen véc tơ vi rút tự động bằng công nghệ nước ngoài [8] Vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CAR-T

trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng” nhằm mục

1 Đánh giá hiệu quả chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T, khả năngtăng sinh, hoạt hóa tiết cytokin (IL-2, TNF-α và IFN-γ) và ly giải tế bào ung) và ly giải tế bào ungthư lympho B-CD19 (+) của khối tế bào CAR-T.

2 Đánh giá hiệu quả điều trị của khối tế bào CAR-T trên mô hìnhchuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+).

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Lơ xê mi cấp dòng lympho

1.1.1 Tình hình mắc lơ xê mi cấp dòng lympho trên thế giới

Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới, chiếm khoảng 75% tất cả các loại ung thư máu; tỷ lệ mắc ALL cao gấp 5 lần so với bạch cầu cấp dòng tủy [9] Trong đó có tới 85% ALL dòng tế bào B, 10 đến 15% dòng tế bào T và dưới 1% dòng tế bào giết tự nhiên NK (Natural killer).

Tại Hoa Kỳ ước tính trong năm 2021 có khoảng 5.690 trường hợp mới mắc và khoảng 1.580 trường hợp tử vong do ALL, với tỷ lệ mắc bệnh khoảng 3,4 ca/100.000 dân [3] Trên thế giới tỷ lệ mắc bệnh ALL khác nhau theo vùng địa lý, ngoài yếu tố dịch tễ thì một phần bị ảnh hưởng bởi tiêu chuẩn chẩn đoán áp dụng là khác nhau Tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh ALL cao hơn ở người Mỹ Latin và người Mỹ gốc da trắng so với người da đen và người gốc châu Á [10], [11] Tỷ lệ mắc mới của ALL gặp nhiều nhất ở lứa tuổi từ 2-5 tuổi, thấp nhất lứa tuổi 25-45 và trẻ trai mắc nhiều hơn so với trẻ gái [12].

1.1.2 Sinh lý bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho

Nguyên nhân bệnh lý của ALL liên quan đến sự gia tăng và biệt hóa bất thường của một tập hợp các dòng tế bào lympho Một số nghiên cứu trên trẻ em đã chỉ ra rằng bệnh nhân mắc các hội chứng di truyền như Down, thiếu máu Fanconi, hội chứng Bloom và hội chứng suy nhược Nijmegen có nguy cơ cao mắc bệnh ALL [13] Một số nguyên nhân khác gây bệnh ALL bao gồm tiếp xúc với bức xạ ion hóa, thuốc bảo vệ thực vật, một số dung môi hữu cơ hoặc nhiễm vi rút như vi rút Epstein-Barr Đột biến nhiễm sắc thể (NST) liên quan đến việc chuyển đoạn hoặc sắp xếp lại NST là nguyên nhân phổ biến dẫn đến bệnh ALL Hầu hết các đột biến gen được tìm thấy ở người lớn mắc bệnh ALL cũng tương tự như ALL ở trẻ em nhưng có khác nhau đáng kể

về sự phân bố và về sinh bệnh học Ở trẻ nhỏ, 85% có đột biến tái cấu trúc của gen MLL trong khi đột biến đa bội và chuyển đoạn NST chiếm tỷ lệ nhỏ Ngược lại, ở trẻ vị thành niên đột biến đa bội lại chiếm tỷ lệ khoảng 25% trong khi các đột biến trên gen MLL chỉ có 5% Bên cạnh đó, có đến 25% các

ca ở trẻ vị thành niên mang đột biến trên gen TEL-AML1 [14].

Bệnh ALL có thể gây ra nhiều dấu hiệu và triệu chứng khác nhau Song, hầu hết các biểu hiện lâm sàng của ALL là kết quả của sự thiếu hụt các tế bào máu bình thường, phản ánh sự tích luỹ của các tế bào lympho ác tính chưa được biệt hóa ở tủy, máu ngoại vi và các vị trí ngoài tủy, bao gồm: hội chứng thiếu máu, hội chứng nhiễm khuẩn, gan lách và hạch to Bệnh ALL cũng thường có một số triệu chứng không đặc hiệu như giảm cân, sốt, ra mồ hôi trộm [15].

1.1.3 Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho

Lơ xê mi cấp dòng lympho được chẩn đoán dựa trên kết quả xét nghiệm máu ngoại vi hoặc tủy xương Người được chẩn đoán là mắc bệnh ALL nếu kết quả xét nghiệm cho thấy các tế bào bạch cầu lympho non trong tủy xương chiếm tỷ lệ hơn 20% [16] Các đánh giá dựa trên hình thái học hoặc sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy, xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm tế bào đều có giá trị trong chẩn đoán và phân tầng nguy cơ của ALL [15].

1.1.4 Phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho

* Phân loại theo hệ thống FAB 1986 (The French-American-British).

Phân loại này dựa trên cơ sở hình thái tế bào ác tính như kích thước, đặc điểm nhân và nguyên sinh chất, được khẳng định thêm bằng đặc trưng hoá học tế bào của các tế bào ác tính dòng lympho.

Bảng 1.1 Phân loại theo FAB 1986

*Nguồn: theo Lilleyman J.S (1986) [17]

* Phân loại theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO).

Năm 2001, Tổ chức y tế thế giới đưa ra phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho trong khuôn khổ bảng phân loại bệnh lý ác tính dòng lympho (bao gồm lơ xê mi cấp dòng lympho, lơ xê mi mạn dòng lympho, u lympho ác tính) Bảng phân loại này được cập nhật và sửa đổi năm 2008 và năm 2016 phù hợp về lâm sàng, ứng dụng điều trị cũng như tiên lượng bệnh được tốt hơn Hệ thống phân loại này đã chỉ ra sự khác biệt về mặt di truyền, kiểu hình miễn dịch, đặc điểm phân tử và hình thái tế bào thông qua các xét nghiệm chẩn đoán tế bào và sinh học phân tử.

Bảng 1.2 Phân loại ALL theo WHO 2016Lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào B

- Không phân loại khác - Biến đổi di truyền tái diễn:

+ Với kiểu hình: t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR::ABL1

+ Với kiểu hình: t(v;11q23.3); KMT2A tái tổ hợp

+ Với kiểu hình: t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6::RUNX1

+ Thể đa bội

+ Thể giảm bội

+ Với kiểu hình: t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3::IGH+ Với kiểu hình: t(1;19)(q23;p13.3);TCF3::PBX1

+ Thể đề xuất bổ sung biểu hiện tương tự BCR::ABL (BCR::ABL like)+ Thể đề xuất bổ sung với iAMP21

Lơ xê mi cấp dòng lympho T

- Thể đề xuất bổ sung: dòng tế bào tiền thân T sớm (early T-cellprecursor)- Thể đề xuất bổ sung: dòng lympho giết tự nhiên NK (Natural killer)

*Nguồn: theo Daniel A.A (2016) [18]

Năm 2023, cập nhật đồng thuận phân loại quốc tế đối với ALL đã có những thay đổi Các phân nhóm trong phân loại WHO 2016 đã có những sửa đổi và có thêm những nhóm phân loại mới Phân loại cập nhật kết hợp giữa lâm sàng, tế bào học và tiến bộ sinh học phân tử Phân loại này đã bổ sung thêm 9 nhóm phân loại mới đối với dòng lympho B, trong đó có 7 nhóm phân loại có sự sắp xếp lại các gen khác biệt và 2 loại mới đặc trưng bởi một đột biến gen cụ thể Bốn thể đề xuất bổ sung cũng được thêm vào trong phân loại ALL dòng lympho B, mặc dù việc xác định chính xác các phân nhóm này đòi hỏi phải có nghiên cứu biểu hiện gen Phân loại T-ALL cũng được cập nhật

để kết hợp các sắp xếp lại kích hoạt gen BCL11B vào phân loại dòng tế bào

tiền thân T sớm Ngoài ra, tám phân nhóm thể đề xuất bổ sung mới được thêm vào phân loại T-ALL Cập nhật phân loại mới ALL sẽ cho phép cải thiện việc phân tầng nguy cơ và lập kế hoạch điều trị tối ưu cho bệnh nhân [19].

1.1.5 Điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho

Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho với mục đích tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điều trị chủ yếu hiện được sử dụng cho ALL là hóa trị liệu, thường chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, củng cố và duy trì Giai đoạn điều trị cảm ứng là nhằm đạt tới tình trạng thuyên giảm bệnh Các đợt điều trị tiếp theo có mục đích củng cố

tình trạng của người bệnh hướng tới tiêu diệt hoàn toàn các tế bào ung thư Cuối cùng là giai đoạn điều trị duy trì Trong giai đoạn này, bệnh nhân được điều trị ngoại trú với liều thuốc thấp, kéo dài nhằm ngăn chặn sự tái phát của bệnh Các loại thuốc được sử dụng phổ biến bao gồm: daunorubicin, L-asparaginase,6-mercaptopurine, methotrexate, cyclophosphamide, prednisone, dexamethasone Trường hợp một số bệnh nhân mắc ALL tái phát hoặc ở dạng bệnh dai dẳng, liệu pháp điều trị sẽ thường là sử dụng các loại thuốc mới với liều lượng cao như cytarabine, clofarabine, vincristine, và/hoặc nelarabine Hạn chế của các liệu pháp hóa trị liệu là hầu như không có khả năng chữa khỏi bệnh triệt căn mà chỉ hướng đến lui bệnh hoàn toàn để có thể được điều trị tiếp theo bằng liệu pháp tế bào gốc tạo máu đồng loài Tuy nhiên, tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn theo hướng điều trị này cũng không cao, chỉ đạt tối đa 20% ở người trưởng thành [15].

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu các hướng điều trị mới, điển hình là phương pháp cấy ghép tế bào gốc tạo máu và sử dụng liệu pháp miễn dịch Cấy ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xương là quá trình thay thế tế bào gốc bất thường bằng những tế bào gốc khỏe mạnh của người hiến tặng Người bệnh sau khi điều trị đáp ứng bệnh hoàn toàn có thể lựa chọn điều trị bằng phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (Allo-HSCT: Allogeneic stem cell transplantation) để khôi phục tủy xương Đối với các bệnh nhân có nguy cơ cao, các bệnh nhân bị tái phát bệnh hoặc kháng trị, Allo-HSCT từ lâu đã được coi là phương pháp điều trị tiêu chuẩn và là lựa chọn tốt nhất để có đáp ứng lâu dài Điển hình là thử nghiệm LALA-94 đã cho thấy lợi ích của Allo-SCT so với phương pháp hóa trị liệu đơn thuần ở những bệnh nhân này [20], [21] Tuy nhiên, hạn chế chủ yếu của phương pháp này là phải tìm được người hiến tặng có hệ miễn dịch phù hợp với cơ thể của người bệnh.

Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị ALL cũng là một cách tiếp cận hết sức hiệu quả Kháng thể đơn dòng nhận biết các tế bào ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào và sẽ tiêu diệt tế bào ung thư thông qua các cơ chế tác động phụ thuộc vào vùng thụ thể Fc bao gồm gây độc tế bào qua trung gian kháng thể (ADCC) và gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC) [22] Điển hình như blinatumomab là một loại kháng thể đơn dòng đặc biệt bởi vì nó có thể gắn vào hai kháng nguyên khác nhau cùng một lúc Một phần của blinatumomab sẽ gắn với CD19, được tìm thấy trên tất cả các tế bào lympho B (bao gồm cả các tế bào ung thư bạch cầu và ung thư hạch) nhưng lại không tồn tại trong tế bào gốc tạo máu Một phần khác của blinatumomab gắn với CD3, vốn là thụ thể kích thích hoạt động của tế bào T Bằng cách liên kết với cả hai loại protein này, blinatumomab mang các tế bào ung thư và các tế bào T lại gần nhau, để các tế bào T tiến hành ly giải các tế bào ung thư [23].

Một hướng tiếp cận mới là liệu pháp sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo (CAR: Chimeric antigen receptors) Nguyên tắc của liệu pháp CAR-T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bào CAR-T mang các thụ thể nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư từ đó kích hoạt khả năng ly giải tế bào ung thư của tế bào T Hiện nay, liệu pháp CAR-T thành công nhất là các cấu trúc CAR nhận biết thụ thể CD19 Tổng hợp các kết quả của 11 thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp CAR-T kháng CD19, Lorentzen và cộng sự cho thấy có 83% bệnh nhân ALL đã thuyên giảm hoàn toàn bệnh [24] So với thuốc sinh học đặc trị như kháng thể đơn dòng, liệu pháp CAR-T cũng có khả năng trị liệu trúng đích, nhưng vượt trội về tính hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay cả ở những trường hợp đã kháng với hóa trị, xạ trị Đặc biệt, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh và tồn tại lâu dài trong cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát.

1.2 Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T

Năm 1989 Eshhar Z và công sự lần đầu tiên tạo ra cấu trúc mã hóa thụ thể khảm của tế bào T (chimeric TCR gene) Cấu trúc di truyền này có thể được biểu hiện ở tế bào T của người và giúp tế bào T nhận diện và phản ứng với các kháng nguyên đích với độ đặc hiệu cao, tương tự như phản ứng kháng nguyên-kháng thể Ngoài ra, sự phát hiện và phản ứng của tế bào T chuyển gen này không bị hạn chế bởi sự nhận diện phân tử MHC [25].

Năm 1993, nhằm kết hợp lợi ích từ tính đặc hiệu của kháng thể và hoạt động gây độc tế bào của tế bào T CD8+, nhóm nghiên cứu của Eshhar Z đã nối vùng biến thiên đơn chuỗi (single chain variable region hay scFv) của một phân tử kháng thể với vùng hằng định của thụ thể tế bào T (thường là chuỗi zeta của phức hợp TCR/CD3) Tiếp theo các kết quả này, Eshhar Z và đồng tác giả đã tạo ra cấu trúc thụ thể dạng khảm (chimeric receptor gene) trên tế bào T và kích thích chúng biểu hiện thành “scFvRζ T cells” (tế bào CAR-T thế hệ đầu tiên) [26] Tuy nhiên, các tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất này chỉ cho hiệu quả điều trị hạn chế trong thử nghiệm lâm sàng do không thể phát triển lượng tế bào CAR-T trong cơ thể [27] Vì thế, tế bào CAR-T thế hệ thứ hai đã được phát triển vào năm 1998, bằng cách gắn thêm một phân tử đồng kích thích (costimulatory signaling domain) của phân tử CD28 hoặc 4-1BB vào giữa vùng scFv và chuỗi CD3ζ Việc bổ sung thêm phân tử đồng kích thích này đã giúp kích hoạt tế bào T một cách bền vững, từ đó, tăng sự tiết cytokine và khuếch đại sự tăng sinh tế bào T khi tiếp xúc với kháng nguyên [28], [29].

Năm 2003 đánh dấu sự khởi đầu của liệu pháp CAR-T nhắm đến thụ thể CD19 trên tế bào lympho B Sadelain M và đồng tác giả tại Trung tâm Nghiên cứu Ung thư “Memorial Sloan-Kettering” lần đầu tiên chỉ ra rằng tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 có khả năng diệt trừ tế bào B ác tính trên mô hình chuột SCID/Beige Ngoài ra, việc đồng cảm ứng bằng CD80 và IL-15 cũng giúp tăng sinh tế bào CAR-T và tăng khả năng diệt tế

bào ung thư [30] Vào năm 2009, quy trình công nghệ sản xuất tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 lần đầu tiên được công bố; dựa vào đó, thử nghiệm lâm sàng Pha I đã được tiến hành trên các bệnh nhân mắc bạch cầu lympho mãn tính (CLL) và bạch cầu lympho cấp tính (ALL) [31] Kết quả của cuộc thử nghiệm lâm sàng này lần đầu được công bố vào năm 2013, chỉ ra sự thuyên giảm bệnh đáng kể của những bệnh nhân tham gia, đặc biệt là trên những bệnh nhân trưởng thành mắc B-ALL Cụ thể, toàn bộ 5 bệnh nhân sau khi điều trị bằng liệu pháp CAR-T 19-28z đều đạt trạng thái tồn lưu tối thiểu âm tính (MRD: minimal residual disease negative) Ngoài ra, sau khi được điều trị không còn phát hiện được đột biến tái tổ hợp ác tính trên gen IGH của các bệnh nhân [32] Dựa vào những kết quả nghiên cứu trên, liệu pháp sử dụng tế bào CAR-T nhắm đích CD19 được Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là một bước đột phá, mở đường cho nhiều nghiên cứu và tiến bộ trong lĩnh vực này Đến năm 2017, FDA đã cho phép dùng liệu pháp tế bào CAR-T trong chữa trị B-ALL ở người lớn và trẻ em [33], [34] Gần đây, nhiều liệu pháp tế bào CAR-T khác đã được FDA chấp thuận để điều trị nhiều loại ung thư khác nhau, bao gồm Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi) điều trị u lympho không Hodgkin tế bào B lớn tái phát hoặc không đáp ứng với điều trị ban đầu, Abecma (idecabtagene vicleucel) điều trị đa u tủy xương tái phát hoặc không đáp ứng với điều trị bước 1, Brexucabtagene autoleucel (Tecartus) để điều trị bệnh u lympho ác tính không hodgkin thể malt tái phát hoặc không phản ứng đối với điều trị ban đầu, và Liso-cel (liso-Liso-cel) điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin tế bào B lớn tái phát hoặc không đáp ứng với điều trị ban đầu [35], [36], [37], [38].

1.2.2 Cấu trúc thụ thể nhân tạo CAR

CAR là các cấu trúc thụ thể nhân tạo, được thiết kế để có cả chức năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích và khả năng hoạt hóa tế bào T Hiện nay, tế bào CAR-T đã phát triển đến thế hệ thứ tư, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc CAR-T đều bao gồm 3 mô-đun: mô-đun ngoại bào (ectodomain), mô-đun xuyên màng (transmembrane) và mô-đun nội bào (endodomain) (Hình 1.1).

Hình 1.1 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho T.

*Nguồn: theo Zhang C (2017) [39]

 Mô đun ngoại bào

Mô đun ngoại bào của tế bào CAR-T gồm có tín hiệu peptit dẫn đường (signal), vùng nhận diện kháng nguyên (scFv), và “vùng đệm” (spacer) Tín hiệu peptit dẫn đường có nhiệm vụ dẫn protein CAR đi qua mạng lưới nội chất đến biểu hiện trên bề mặt tế bào [40] Vùng nhận diện kháng nguyên đều bắt nguồn từ vùng khả biến của kháng thể đơn dòng dạng đơn chuỗi (scFv: chuỗi nặng VH liên kết với chuỗi nhẹ VL thông qua multimer của pentapeptide GGGGS) Vùng đệm “spacer” là vùng nối giữa scFv và vùng xuyên màng, thường có dạng “hinge-CH2–CH3 Fc” của kháng thể IgG1 [41].

 Mô đun xuyên màng

Mô đun xuyên màng có cấu tạo bao gồm các chuỗi xoắn alpha, có nhiệm vụ giữ ổn định cho cấu trúc CAR Hiện nay, mô đun xuyên màng của tế bào CAR-T thường được xây dựng dựa trên vùng xuyên màng của thụ thể CD3, CD4, CD8 và CD28 Tuy nhiên, thiết kế dựa trên CD8 và CD28 được cho là ổn định và thường được sử dụng nhất trong thiết kế tế bào CAR-T [40], [42].

 Mô đun nội bào

Mô đun nội bào là nơi thực hiện chức năng hoạt hóa tế bào CAR-T Vùng này luôn có chuỗi zeta của thụ thể tế bào T (CD247/CD3z) đi kèm với motif ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) [43], [44] Motif thường có dạng: Y – XX – L/I – X(6-8) – Y – XX – L/I (Y: tyrosine, X: amino axit bất kì, L: leucine, I: isoleucine)

Sau khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích, vùng nội bào có nhiệm vụ phát tín hiệu đến nhân tế bào nhằm kích hoạt hoạt động tế bào CAR-T Ngoài ra, tế bào CAR-T cũng cần tín hiệu từ vùng đồng kích thích (costimulatory domain) để có thể thực hiện đầy đủ các chức năng Vùng đồng kích thích thường được sử dụng là CD28, CD134 (OX-40) và CD137 (4-1BB).

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T

Như đã đề cập ở trên, đến nay, tế bào CAR-T đã phát triển đến thế hệ thứ tư Sự khác biệt về mặt cấu trúc giữa các thế hệ CAR-T được trình bày tóm tắt trong Hình 1.2 dưới đây.

Hình 1.2 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T Sự khác biệt giữa các thế hệ

ở mô đun nội bào, phân tử OX-40 còn được gọi là CD134 và 4-1BB là CD137, NFAT kích hoạt phiên mã gen biểu hiện tổng hợp interleukin 12

* Nguồn: Journal of Cellular Immunotherapy [45]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất

Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất có đặc điểm nổi bật là sử dụng chuỗi CD3 zeta hoặc FcεRIγ làm mô-đun nội bào Tuy nhiên, thiết kế này khiến tếRIγ làm mô-đun nội bào Tuy nhiên, thiết kế này khiến tế bào CAR-T không sản xuất đủ IL-2 cần thiết để duy trì hoạt động diệt tế bào ung thư Vì vậy, việc sử dụng tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất trong điều trị thường yêu cầu bổ sung IL-2 [44] Hầu hết các nghiên cứu sử dụng CAR-T thế hệ đầu đều không đạt được kết quả như mong đợi.

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ hai

Đặc trưng của thế hệ thứ hai là sử dụng tín hiệu kép cho việc hoạt hóa tế bào Tín hiệu đầu tiên được phát đi khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích Tín hiệu thứ hai được phát đi bởi một phân tử đồng kích thích CD28/B7/4-1BB nhằm tăng tổng hợp IL-2 để kích hoạt tế bào CAR-T một cách hoàn toàn và tránh hiện tượng “apoptosis” (chết tế bào theo chương trình) Chính vì vậy, các cấu trúc CAR-T thế hệ hai đã tích hợp thêm một phân tử đồng kích thích như CD28, CD134(OX-40) hoặc CD137(4-1BB) Phân tử CD28 có vai trò rất quan trọng trong điều chỉnh sự tăng sinh và tồn tại của tế bào lympho T, đặc biệt là trong hình thành tế bào T ghi nhớ và tế bào T hiệu ứng CD134 giúp duy trì sự tăng sinh và tăng sự tổng hợp IL-2 CD137 giúp duy trì tín hiệu đáp ứng của tế bào T, đóng vai trò quan trọng trong khả năng tồn tại của tế bào T nói chung và hình thành bộ nhớ cho tế bào T CD8+ [46] Hiện nay, các liệu pháp CAR-T được FDA phê duyệt đều là cấu trúc dạng này, điển hình như các cấu trúc CAR-T scFvCD19- CD137-CD3ζ hoặc scFvCD19-CD28-CD137-CD3ζ cho điều trị tế bào B ác tính [47], [48] Hơn nữa, nghiên cứu trên mô hình chuột (chuột gây mô hình bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B) chỉ ra rằng CD137 hoạt động tốt hơn so với CD28 trong cấu trúc CAR Cụ thể, tế bào CAR-T với cấu trúc scFvCD19-CD137-CD3ζ tồn tại ít nhất 180 ngày so với mức 150 ngày của cấu trúc scFvCD19-CD28-CD3ζ [49].

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba

Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba có đặc trưng là trong cấu trúc có sử dụng đồng thời nhiều vùng đồng kích thích Một số thiết kế điển hình như CD28-OX-40-CD3ζ hoặc CD28-CD137-CD3ζ, với mục đích tăng cường hơn nữa khả năng sinh IL-2 và khả năng diệt tế bào ung thư [50] Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng CAR-T thế hệ 3 cho điều trị ung thư bạch cầu lympho B cấp tính hiện đang được tiến hành trên thế giới [51] Tuy vậy, các nghiên cứu so sánh về hiệu quả điều trị giữa các cấu trúc CAR thế hệ thứ hai và thứ ba vẫn chưa thật rõ ràng và đang trong quá trình theo dõi Do đó, chưa thể kết luận liệu cấu trúc CAR-T thế hệ thứ ba có thực sự hiệu quả hơn so với thế hệ thứ hai hay không [52].

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ tư

Tế bào CAR-T thế hệ tư được tạo nên từ nền tảng thế hệ thứ 2 Về mặt kỹ thuật, CAR-T thế hệ thứ tư được tạo ra bằng cách chuyển nạp hai cấu trúc di truyền vào tế bào T của bệnh nhân Một cấu trúc nhằm biểu hiện thụ thể nhân tạo và cấu trúc còn lại nhằm biểu hiện các cytokine cảm ứng để hoạt hóa tế bào CAR-T Một trong các cytokine được tạo ra là IL-12 Khi được biểu hiện cảm ứng, IL-12 sinh ra sẽ giúp tế bào tăng sinh tổng hợp IFN-γ, hoạt hóa tế bào NK (Natural Killer cells), đại thực bào (macrophage) tham gia diệt tế bào ung thư Ngoài ra, IL-12 cũng giúp cải thiện hoạt động của các tế bào lympho T CD4+ và CD8+, hạn chế sự chết tế bào T theo chương trình [53], [54], [55] So với các cấu trúc CAR-T thế hệ thứ hai, thế hệ thứ tư có tính phức tạp hơn do phải chuyển đồng thời hai cấu trúc vào tế bào T của bệnh nhân Ngoài ra, việc tăng sự biểu hiện của IL-12 cũng có thể gây ra một số hiệu ứng phụ như hiệu ứng tấn công mục tiêu ngoài khối u “on-target, off-tumor”, gây độc cho cơ thể bệnh nhân [56] Ngoài IL-12, IL-15 cũng được tạo ra trong một số cấu trúc CAR-T thế hệ thứ tư nhắm đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho B Các kết quả nghiên cứu cho thấy cấu trúc CAR-T biểu hiện phân tử đồng kích thích mã

hóa gen biểu hiện cytokin cảm ứng là IL-15 giúp duy trì tính bền vững cấu trúc CAR-T, tăng cường đáp ứng chống tế bào ung thư qua ức chế AICD, kéo dài tuổi thọ tế bào CAR-T Các nghiên cứu cũng cho thầy cấu trúc CAR-T này cho phép giảm thời gian tăng sinh tế bào CAR-T từ 28 ngày xuống còn 2 ngày, mở ra cơ hội giảm chi phí sản xuất [57].

Hiện nay, để đảm bảo tính an toàn của liệu pháp CAR-T các chiến lược sử dụng gen tự sát như HSV-TK (herpes simplex vi rút thymidine kinase) hoặc hệ thống iCasp9 (inducible caspase-9) trong cấu trúc Khi tế bào CAR-T tăng sinh không kiểm soát trong cơ thể, sử dụng ganciclovir hoặc chất dimer hóa AP20187 để tiêu diệt tế bào CAR-T.

1.3 Các kỹ thuật để tạo khối tế bào CAR-T

1.3.1 Sản xuất plasmid bằng E coli

Quá trình sản xuất plasmid bao gồm các bước như sau Đầu tiên, véc tơ

trị liệu cần được biến nạp và khuếch đại trong E.coli Bên cạnh các trình dànhcho gen mục tiêu, các véc tơ này cần có gốc sao chép phù hợp cho E.coli và

gen dành cho quá trình sàng lọc dòng tế bào Sau khi đã biến nạp được

plasmid vào một chủng E.coli thích hợp, vi khuẩn được tăng sinh trong môi

trường tối ưu hóa và được thu sinh khối cho quá trình xử lý tiếp theo

Các liệu pháp gen hoặc thử nghiệm lâm sàng hiện tại yêu cầu sản xuất plasmid với số lượng gram hoặc thậm chí kilogram Một chiến lược để tăng hàm lượng plasmid tương đối được mô tả bởi Reinikainen P và cộng sự [58] Họ đã sử dụng một plasmid có nguồn gốc pBR322 gây đột biến điểm nhạy

cảm với nhiệt độ, sự ổn định phân ly ở E coli được duy trì bằng cách bổ sung

kháng sinh thường xuyên.

1.3.2 Tinh sạch plasmid ADN

Trong dịch ly giải vi khuẩn, plasmid ADN chỉ chiếm xấp xỉ 3%, với hầu hết phần còn lại là nhiễm tạp protein và ARN Phần lớn ARN tồn tại trong dịch ly giải có thể được loại bỏ bằng cách xử lý bằng RNase A trước khi

tinh sạch sắc ký Tuy nhiên, RNase A thường có nguồn gốc từ tuyến tụy bò, do đó, cần được điều chỉnh nhằm loại bỏ hoàn toàn tạp chất có nguồn gốc từ động vật này, nhằm tuân thủ các quy định quản lý [59].

Trong sắc ký phân tách, sắc ký trao đổi anion đã chiếm ưu thế trong lĩnh vực tinh chế plasmid trong những năm gần đây Ngoài ra, phương pháp siêu lọc (UF) cũng có thể được áp dụng, với khả năng phân tách các phân tử theo kích thước Việc tách hoàn toàn ADN plasmid khỏi ARN cũng có thể đạt được bằng bước tách nhóm với Sepharose 6 FF với sự hiện diện của đệm amoni sunfat 2M [60]

1.3.3 Tạo tế bào CAR-T sử dụng hệ thống sleeping beauty transposon

Quá trình sản xuất tế bào CART về cơ bản được thực hiện bằng cách kích hoạt các tế bào T bằng cách sử dụng các hạt từ phủ kháng thể kháng CD3/CD28, sau đó là quá trình tải nạp bằng véc tơ retrovirus hoặc lentivirus, tăng sinh trong chai hoặc túi nuôi cấy [61] Mặc dù đây là một cách tiếp cận khả thi, tuy nhiên để tạo ra khối tế bào CAR-T bằng cách này rất tốn kém, đòi hỏi phải sản xuất và sử dụng các véc tơ vi rút đảm bảo tiêu chuẩn GMP và phải được kiểm soát về chất lượng.

Hệ thống SB (sleeping beauty) có thể biến đổi di truyền trong tế bào động vật nhờ cơ chế “cắt và dán” [62] Bằng cách sử dụng các enzym SB transposase như SB100X, cho thấy hiệu quả và sự biểu hiện tích hợp gen có thể so sánh với các véc tơ vi rút, và việc biến đổi gen hiệu quả của tế bào lympho T cũng khả thi [63], [64] SB có cấu hình tích hợp ngẫu nhiên, thường tích hợp gen quan tâm ở các vị trí nhiều dinucleotide TA Điều này trái ngược với các véc tơ retrovirusvà véc tơ lentivirus, chúng tích hợp gần các vị trí bắt đầu phiên mã hoặc vào các đơn vị phiên mã và có thể có khả năng thay đổi cơ chế điều hòa phiên mã [63] Những đặc điểm này đã thúc đẩy sự phát triển của liệu pháp gen qua hệ thống SB và việc sử dụng nó để tạo ra các tế bào CAR-T đã được sử dụng để điều trị bệnh nhân bị u lympho tế bào B.

Kết hợp xung điện là phương pháp được lựa chọn để cung cấp hai thành phần cấu thành hệ thống chuyển vị SB (véc tơ chuyển vị chứa gen quan tâm và véc tơ biểu hiện enzym transposase) Việc sử dụng kết hợp xung điện để chuyển gen đã được phát triển vào đầu những năm 1980 và về cơ bản bao gồm việc mở các lỗ trong màng tế bào thông qua việc sử dụng các xung điện [65].

1.3.4 Quy trình tạo khối tế bào CAR-T

Quy trình chung tạo khối tế bào CART đã được chuẩn hóa tương đối, tuy nhiên có sự khác nhau ở các bước Ví dụ, bước chuyển nạp cấu trúc di truyền có thể sử dụng véc tơ vi rút hoặc véc tơ không vi rút (hình 1.3)

Hình 1.3 Các bước sản xuất tế bào CAR-T.

* Nguồn: Stock S (2019) [66]

Quá trình sản xuất tế bào CAR-T (hình 1.3) bao gồm phân lập và làm giàu nguồn tế bào T ban đầu, kích hoạt hóa tế bào T, nuôi cấy tăng sinh tế bào T, chuyển cấu trúc di truyền vào tế bào T bằng véc tơ vi rút hoặc hệ thống véc

tơ không vi rút, tiếp theo là nuôi cấy tăng sinh tế bào CAR-T ex vivo Khối tế

bào CAR-T thu được chính là sản phẩm cuối cùng của quy trình và sau đó được bảo quản lạnh trước khi sử dụng Yếu tố chất lượng luôn được đảm bảo và phải được kiểm soát trong suốt quá trình sản xuất cũng như đối với sản phẩm tế bào CAR-T khi bảo quản lạnh Thông thường các bệnh nhân ung thư được nhận các liệu điều trị trước khi sử dụng liệu pháp tế bào CAR-T để loại bỏ bớt tế bào lympho và giảm sự cạnh tranh của tế bào CAR-T với tế bào lympho nội sinh.

1.3.4.1 Phân lập và làm giàu tế bào T

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được sử dụng thường phân lập từ máu ngoại vi Ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng ficoll để loại bỏ bạch cầu hạt, hồng cầu và tiểu cầu là phương pháp thường được sử dụng [67] Ngoài ra, có thể sử dụng máy rửa tế bào tự động để phân lập tế bào T [68] Để tối ưu hóa các bước cũng như thuận lợi tạo ra tế bào CAR-T, các hệ thống

máy ra đời và được phát triển như: hệ thống xử lý tế bào Sefia™ dùng để

phân lập, thu nhận và tạo ra sản phẩm là tế bào CAR-T hoặc hệ thống

CliniMACS Prodigy® để sản xuất tế bào CAR-T tự động tuân thủ tiêu chuẩn

chất lượng GMP [69].

Tỷ lệ thành phần tế bào sau phân lập thu được có thể ảnh hưởng đến kiểu hình của tế bào CAR-T Bởi vì, những bệnh nhân có số lượng tế bào ung thư cao trong máu như bệnh nhân mắc bạch cầu lympho mạn tính (CLL) không được điều trị khi phân lập nhận thấy số lượng tế bào T ít biệt hóa hơn trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi [61] Các yếu tố tế bào nội sinh có thể là nơi hấp thụ các cytokine khi được bổ sung, dẫn đến có thể làm giảm tác dụng qua trung gian cytokine đối với các tế bào CAR-T [70] Hệ thống phân lập tế bào T dựa trên hạt từ tính, chẳng hạn như hệ thống CliniMACS®, với các hạt từ phủ kháng CD3+, kháng CD4+, hoặc kháng CD8+, cũng được lựa chọn để loại bỏ các loại tế bào T cụ thể trong PBMC [67] Sự phát triển của quá trình phân lập có chọn lọc, chuyển nạp và mở rộng tế bào ở quy mô lâm sàng của những tế bào T ít biệt hóa để sản tạo khối tế vào CAR-T là rất có lợi [71].

1.3.4.2 Kích hoạt tế bào T

Kích hoạt tế bào lymhpho T là bước không thể thiếu của quá trình sản xuất tế bào CAR-T Sự hoạt hóa tối ưu sẽ dẫn đến sự nuôi cấy đủ tế bào T mà không gây ra sự biệt hóa lớn về mặt sinh lý của tế bào T hoặc sự chết tế bào do kích hoạt (AICD) Tế bào trình diện kháng nguyên (APC), chẳng hạn như tế bào đuôi gai (DCs), làm trung gian cho sự hoạt hóa tế bào T Tuy nhiên, khó nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và ứng dụng vào lâm sàng nên không dùng để hoạt hóa tế bào CAR-T được [67].

 Sử dụng kháng thể kháng CD3/CD28

Các hạt từ gắn các kháng thể kháng CD3 hoặc kháng thể kháng CD28 giúp kích thích tăng sinh các tế bào CAR-T sau đó chúng có thể được loại bỏ bằng lực từ của nam châm [72] Việc sản xuất cytokine với sự hoạt hóa tế bào T và hạt từ có kết quả cao hơn khi so sánh với sự hoạt hóa với OKT-3 và interleukin (IL)-2 [73] Hơn nữa, các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/kháng CD28 có thể tạo ra các tế bào T ít biệt hóa hơn, có khả năng ít già hơn cũng như các tế bào CAR-T có khả năng tăng sinh được nâng cao và phản

ứng chống khối u in vivo sớm hơn so với kích thích bằng OKT -3 và IL-2 liều

cao [74], [75] Trong các thử nghiệm lâm sàng gần đây, việc sản xuất

Kymriah® (Tisagenlecleucel; CTL019) và Lisocabtagene maraleucel (liso-cel;JCAR017) được sử dụng các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/khángCD28, trong khi việc sản xuất Yescarta® (Axicabtagene Ciloleucel; KTE-019)

sử dụng kháng thể kháng CD3 với IL-2 [76], [77].

Một sản phẩm nanomatrix (T Cell TransAct ™) polymer hóa kết hợp với chất chủ vận là CD3 và CD28 tái tổ hợp được nhân bản hóa cùng với môi trường không chứa huyết thanh (TexMACS ™) được sử dụng để kích hoạt tế bào T trong quá trình sản xuất tế bào CAR-T Ngoài ra, chiến lược kích hoạt này làm trung gian cho sự mở rộng, hỗ trợ sự tăng sinh của các tế bào T CD4 + với tỷ lệ CD4: CD8 trung bình là 2: 1 và cũng dẫn đến hoạt

động phân giải tế bào thấp hơn khi so sánh với sự kích hoạt với chất kháng CD3/khángCD28 [78].

 Sử dụng tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (APC)

Trong các nghiên cứu gần đây, việc kích hoạt tế bào T để sản xuất tế bào CAR-T đã được thực hiện với các APC nhân tạo có chứa kháng nguyên liên kết với khối u (TAA) [79] Với mục đích này, tế bào K-562 đã được biến đổi gen để đồng biểu hiện các phân tử kích thích và TAA [80] Khi được chiếu xạ bất hoạt, tế bào K-562 này có thể được sử dụng làm môi trường nuôi cấy tăng sinh số lượng các tế bào CAR-T Ưu điểm của phương pháp này là không có sự biểu hiện của các kháng nguyên bạch cầu người HLA-A hoặc HLA-B và đảm bảo các tiêu chuẩn chất lượng.

1.3.4.3 Chuyển gen tạo khối tế bào CAR-T

Chuyển gen là bước rất quan trọng trong sản xuất tế bào CAR-T, quyết định hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng như giá thành của sản phẩm Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen có thể được áp dụng vào tế bào T như tải nạp bằng véc tơ vi rút, transposons, mARN hoặc sử dụng hạt nano, liposome, kỹ thuật xung điện (electroporation) Tuy nhiên, có hai loại phương pháp chính đã được thử nghiệm lâm sàng là tải nạp bằng vi rút và transposon kết hợp với kỹ thuật xung điện.

 Tải nạp bằng véc tơ vi rút

Tải nạp bằng véc tơ vi rút hiện đang là phương pháp phổ biến để tạo tế bào CAR-T Các véc tơ vi rút bao gồm retrovirus(lentivirus, γ-retrovi rút) và adenovi rút có khả năng lây nhiễm nhưng không còn khả năng nhân bản Quy trình sản xuất véc tơ vi rút đạt tiêu chuẩn GMP rất phức tạp và phải được thực hiện trong môi trường vô trùng Để sản xuất một mẻ véc tơ vi rút thường cần hai tuần Hầu hết thời gian trên được dành cho việc tạo đủ lượng tế bào vật chủ, có thể là HEK293T hoặc PG13 để phục vụ quá trình “đóng gói” vi rút Đầu tiên, các tế bào vật chủ được tăng sinh trên môi trường nuôi cấy thích

hợp đến liều lượng nhất định trước khi được chuyển nạp với 4 plasmid bao gồm: (i) cấu trúc Gag/Pol mã hóa protein Gag và enzyme Pol của virrus; (ii) cấu trúc mã hóa lớp vỏ glycoprotein dị nguyên đã được thiết kế nhằm loại bỏ

khả năng nhân bản; (iii) cấu trúc mã hóa gen rev trong trường hợp sử dụng

lentivirrus; (iv) cấu trúc mã hóa CAR và các trình tự khác nhằm đảm bảo hiệu quả phiên mã ngược, đóng gói và tích hợp gen chuyển vào hệ gen vật chủ Khoảng 48 giờ sau chuyển nạp, các hạt vi rút chứa cấu trúc CAR bắt đầu được tạo ra Trong các ngày tiếp theo, virrus có thể được thu hoạch theo mẻ bằng cách thay mới môi trường nuôi cấy Sau đó, véc tơ vi rút được tinh sạch và làm giàu bằng các bước lọc, loại bỏ cặn tế bào và các tạp chất khác, lọc vô trùng và bảo quản ở -80oC Trước khi sử dụng, các véc tơ vi rút được kiểm tra chất lượng theo quy trình của FDA [81].

Ưu điểm của phương pháp tải nạp bằng véc tơ vi rút là hiệu quả chuyển gen cao và sự tích hợp cấu trúc CAR vào hệ gen vật chủ một cách ổn định Hai đặc trưng của retrovirus khiến chúng đặc biệt thích hợp để làm véc tơ chuyển gen là: (i) phần lớn hệ gen vi rút có thể được thay bằng một hoặc nhiều gen chuyển mong muốn; (ii) khi chuyển nạp, bộ gen của vi rút được tích hợp vĩnh viễn vào hệ gen của tế bào vật chủ Vì những lí do này, một số γ-retrovirus đơn giản như “moloney murine leukemia vi rút” (Mo-MLV) đã ứng dụng thành công để phục vụ tải nạp gen Các lentivirus cũng thường được sử dụng, điển hình như các véc tơ thiết kế dựa trên vi rút HIV Thông thường, tế bào T sẽ được hoạt hóa bằng hạt từ gắn kháng thể kháng OKT3, CD28 (hoặc Dynabead CD3/CD28) trước khi cho ủ với véc tơ chuyển gen Sau khi véc tơ vi rút dung hợp với màng tế bào T, lõi vi rút mang cấu trúc CAR sẽ được chuyển vào tế bào chất, di chuyển dọc theo các vi ống đến nhân tế bào để thực hiện quá trình tích hợp với hệ gen vật chủ Phương pháp này cho phép tạo tế bào CAR-T với hiệu suất lên đến 68% [82].

Tuy nhiên, để đạt được những tiêu chí an toàn cao trong nghiên cứu lâm sàng, véc tơ vi rút được sử dụng phải được chứng minh không có khả năng nhân bản, ít gây độc tế bào và ít gây phản ứng miễn dịch Vì thế, giá thành sản xuất của phương pháp này khá cao, tạo nên rào cản lớn trong việc sử dụng rộng rãi liệu pháp CAR

 Hệ thống véc tơ Transposon-transposase

Transposon là các yếu tố di truyền kép, bao gồm một plasmid mang cấu trúc CAR và một plasmid mang gen mã hóa transposase Một số hệ thống điển hình có thể kể đến như “Sleeping Beauty”, “piggyBac” thường sẽ được chuyển trực tiếp vào tế bào chủ bằng kỹ thuật xung điện nhằm tích hợp cấu trúc di truyền vào hệ gen của tế bào vật chủ một cách ổn định Cơ chế của các phương pháp này là enzyme transposase sẽ nhận biết và bám vào các vùng ITR (inverted terminal repeats: trình tự lặp đầu cuối đảo ngược) tại hai đầu của cấu trúc cần chuyển, sau đó cắt và dán cấu trúc di truyền vào hệ gen tế bào chủ So với các véc tơ vi rút truyền thống, transposon có ưu điểm cơ bản là giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần (do bản chất của các cấu trúc là các plasmid), an toàn hơn So với hệ thống “Piggybac”, “Sleeping Beauty” có lợi thế hơn trong chỉnh sửa gen tế bào T do khả năng tích hợp ngẫu nhiên vào các vùng trình tự TA trong hệ gen tế bào chủ; trong khi đó, công nghệ “piggyBac” thường tích hợp gen chuyển vào gần vùng điều hòa gen (regulatory region) như “Transcriptional start site” (TSS) và các đảo CpG [83], [84].

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Cooper J.N tại Đại học Texas, Mỹ đã công bố kết quả thử nghiệm pha I của tế bào CAR-T được chế tạo bằng công nghệ “Sleeping Beauty” [85] Cấu trúc CAR được sử dụng trong nghiên cứu này là CD19RCD28 được chèn vào plasmid “Sleeping Beauty” để chuyển nạp vào 2  108 tế bào PBMC bằng thiết bị Nucleofector II cùng với plasmid mã hóa cho SB transposase Các tế bào T sau chuyển nạp được nuôi cấy trong môi trường được bổ sung IL-2, IL-21 với sự có mặt của tế bào trình diện

kháng nguyên nhân tạo (artificial antigen presenting cell hay aAPC) là tế bào K562 biểu hiện đồng thời CD19, CD64, CD86 và CD137 Sau 28 ngày nuôi cấy, lượng tế bào T được tăng sinh khoảng hơn 2000 lần, trong đó 84% có biểu hiện cấu trúc CAR, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu về liều sử dụng trong điều trị Giải trình tự bằng hệ thống Illumina (7,5 triệu trình tự thô) cho thấy 99,9% các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty” là vào các vị trí dinucleotide TA và rải đều trên toàn bộ thể gen Hầu hết các vị trí chèn vào thể gen rơi vào vùng không mã hóa, do vậy nguy cơ gây đột biến phát sinh ung thư là rất thấp Khi kết hợp cùng với ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài, sau 30 tháng theo dõi, có tới 83% các bệnh nhân đã thuyên giảm hoàn toàn Điều đặc biệt là toàn bộ các bệnh nhân này đều còn sống, cho thấy tính an toàn của liệu pháp Tính trung bình, tế bào CAR-T tồn tại trong các bệnh nhân Allo-SCT là 201 ngày Bên cạnh đó, Cooper và cộng sự còn sử dụng công nghệ “Sleeping Beauty” để đồng biểu hiện cytokin hoạt hóa IL-15 cùng với cấu trúc CAR CD19RCD28 [86] Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đồng biểu hiện IL-15 giúp tế bào CAR-T có thể tồn tại lâu hơn với kiểu hình tương tự như các tế bào T ghi nhớ Đặc biệt các thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuột cho thấy các tế bào CAR-T CD19RCD28 đồng biểu hiện IL-15 có thể được sử dụng chỉ sau 2 ngày nuôi cấy (thay vì 28 ngày để đạt được liều lượng tế bào CAR-T thông thường) mà vẫn đạt được kết quả điều trị mong muốn Các kết quả khích lệ này cho thấy tính hiệu quả của công nghệ chuyển gen “Sleeping Beauty” cũng như các ưu việt của việc đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR-T.

Trong năm 2017, Monjezi R và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu sử dụng công nghệ “Sleeping Beauty” kết hợp với công nghệ minicircle nhắm đích thụ thể CD19 để thử nghiệm khả năng điều trị ALL [87] Minicircle là các vec tơ dạng vòng, kích thước nhỏ do đã loại bỏ hoàn toàn gốc sao chép, các gen chọn lọc, và chỉ giữ lại các cấu trúc di truyền cần chuyển Cũng tương

tự như nghiên cứu đã trình bày ở trên, kết quả giải trình tự trên hệ thống Illumina cho thấy hầu hết các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty” đều nằm ngoài các gen liên quan đến ung thư và biểu hiện mạnh Khi thử nghiệm trên mô hình chuột, tế bào CAR-T được tạo bởi công nghệ “Sleeping Beauty” dưới dạng minicircle cho phép loại bỏ hoàn toàn các tế bào ung thư Bên cạnh đó, hiệu quả chuyển gen bằng xung điện của các cấu trúc “Sleeping Beauty” dưới dạng minicircle là cao hơn nhiều lần so với khi sử dụng plasmid thông thường 49,8% tế bào T biểu hiện CAR khi sử dụng minicircle so với tỷ lệ 12,8% của plasmid Một điểm mới của nghiên cứu này so với nghiên cứu của Kebriaei và đồng tác giả là việc sử dụng mARN mã hóa SB transposase thay vì plasmid mang gen mã hóa Điều này sẽ giúp tránh hiện tượng gen mã hóa SB transposase hòa nhập vào thể gen của tế bào T, gây ra đột biến không mong muốn, do vậy giúp tăng tính an toàn của liệu pháp.

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty.

* Nguồn: theo Geurts A.M (2003) [88]

 Chuyển nạp sử dụng mARN

Việc biểu hiện ARN có một số lợi thế so với cách sử dụng ADN hay vi rút, ví dụ như không cần phiên mã, khiến cho protein được biểu hiện nhanh chóng sau khi chuyển nạp Ngoài ra, ARN ở lại tế bào chất mà không vào nhân tế bào, khiến cho hiệu suất biểu hiện được cải thiện và biểu hiện gen không lâu dài.

Sử dụng xung điện để chuyển nạp vật liệu di truyền vào tế bào lần đầu được mô tả vào năm 1982 Kể từ đó, tính linh hoạt của kỹ thuật này đã được chứng minh trong nhiều loại tế bào và các tổ chức cơ quan để chuyển nạp các cấu trúc di truyền khác nhau tùy thuộc vào mục đích ứng dụng [89] So với kỹ thuật chuyển gen bằng véc tơ vi rút, kỹ thuật này tạo ra một giải pháp thay thế an toàn hơn cho sự biểu hiện protein mà không có nguy cơ gây đột biến chèn và khả năng sinh miễn dịch thấp hơn

Trước khi thẩm thấu điện, màng tế bào ở trạng thái không thấm được đặc trưng bởi độ dẫn điện thấp, hằng số điện môi và tính phân cực Những thay đổi này cho phép tạo ra các lỗ nano ưa nước mà qua đó các ion trong dung dịch nước có thể đi qua Các ion di chuyển từ điện cực dương sang điện cực âm sẽ tạo ra lực điện động cho phép ARN (một polyanion) di chuyển đến điện cực dương

 Sản xuất mARN cho ứng dụng chuyển nạp bằng xung điện trong lâm sàng

Trong bối cảnh sự phát triển mạnh mẽ của liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư và ứng dụng kỹ thuật chuyển nạp mARN vào tế bào miễn dịch, mARN có thể được coi là nguyên liệu ban đầu và hoạt chất để tạo ra các chế phẩm thuốc trị liệu tiên tiến (ATMP: Advanced Therapy Medicinal Products) dựa trên tế bào Vì lý do này, các sản phẩm mARN không hoàn toàn tuân thủ các yêu cầu tiêu chuẩn GMP, nhưng chất lượng được kiểm soát chặt chẽ, được coi là nguyên liệu ban đầu hợp lệ cho sản xuất các sản phẩm thuốc thử