lOMoARcPSD|11346942 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Thu Hà CHUẨN HOÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MALONDIALDEHYDE NHẰM ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG STRESS OXY HOÁ TRÊN MẪU MÔ CƠ VÀ MÁU Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành Sinh học (Chương trình đào tạo chuẩn) Hà Nội - 2020 lOMoARcPSD|11346942 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Thu Hà CHUẨN HOÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MALONDIALDEHYDE NHẰM ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG STRESS OXY HOÁ TRÊN MẪU MÔ CƠ VÀ MÁU Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành Sinh học (Chương trình đào tạo chuẩn) Cán bộ hướng dẫn: TS Đỗ Minh Hà Hà Nội - 2020 lOMoARcPSD|11346942 LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Đỗ Minh Hà, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận này Tôi vô cùng trân trọng những đam mê, tính kiên trì và cẩn thận, phương pháp tư duy, trách nhiệm cùng tình yêu khoa học mà thầy muốn gửi gắm cho thế hệ của chúng tôi! Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Trịnh Hồng Thái đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian tôi học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh Học,trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý học & Sinh học người đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường! Trong quá trình học tập và làm việc tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình, chia sẻ kinh nghiệm làm việc của TS Nguyễn Thị Tú Linh, ThS Lê Lan Phương, TS Bùi Phương Thảo cùng các anh, các chị và các bạn sinh viên cùng khóa Tôi xin chân thành cảm ơn! Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học sự sống - Khoa Sinh học và Trung tâm khoa học vật liệu - Khoa Vật Lý, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG HN vì đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng các thiết bị nghiên cứu, giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khoa luận tốt nghiệp Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận này Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 6 năm 2020 Sinh viên Viết tắt lOMoARcPSD|11346942 AA MG Nguyễn Thu Hà GSIS HNE DANH MỤC VIẾT TẮT HPLC MDA Tên đầy đủ PUFAs Axit Arachidonic (Arachidonic acid) ROS Methyl Glyoxal TBA Glucose stimulate insulin secretion TBARS Hexanal-4-hydroxynonenal TMP High performance liquid chromatography Malondialdehyde Polyunsaturated fatty acids Reactive Oxygen Species Thiobarbituric acid Thiobarbituric acid reactive substance 1,1,3,3-tetramethoxypropane lOMoARcPSD|11346942 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Các giá trị hằng số hấp thụ phân tử [26] .18 Bảng 2 Danh sách các hóa chất dùng trong nghiên cứu .20 Bảng 3.Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21 lOMoARcPSD|11346942 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Các dạng cấu hình của MDA [19] 10 Hình 3 Quá trình hình thành và chuyển hóa MDA 12 Hình 4 Phản ứng hình thành MDA từ TMP 13 Hình 5 Phản ứng hình thành MDA từ TEP 14 Hình 6 Phản ứng tạo dẫn xuất màu TBARS của hai phân tử TBA với MDA [19] .16 Hình 7 Phương pháp chung 22 Hình 8 Đồ thị dải phổ hấp thụ của MDA được tạo từ chất chuẩn TMP 26 Hình 9 Đồ thị dải phổ hấp thụ của chất chuẩn TMP .26 Hình 10 Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 30 phút .27 Hình 11 Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 60 phút .28 Hình 12 Biểu đồ so sánh giá trị độ hấp thụ trung bình tại các điểm pH, nhiệt độ khác nhau 29 Hình 13 Giá trị độ hấp thụ trung bình của TBARS khi có mặt của Hemoglobin 30 Hình 14 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của MSU 31 Hình 15 Giá trị trung bình độ hấp thụ của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Sucrose 32 Hình 16 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Glucose 33 Hình 17 Giá trị trung bình của độ hấp thụ khi ủ các mẫu máu vào các dung dịch PBS, MSU 200 mM, MSU 800mM, Glucose 75 mg/L, Glucose 150 mg/L 34 Hình 18 Giá trị độ hấp thụ khi cho các mẫu gan chuột vào trong môi trường PBS, MSU, Glucose 36 Hình 19 Giá trị độ hấp thụ khi ủ các mẫu cơ đùi trong môi trường PBS, MSU,Glucose 37 lOMoARcPSD|11346942 MỞ ĐẦU Stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và mãn tính cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa ở người như bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường Trạng thái stress oxy hóa của cơ thể có thể được đánh giá thông qua việc định lượng các biomarker chính của quá trình Peroxit hóa lipid như: MDA, HNE, Acrolein, F2-IsoProstane, Pentane, Ethane Trong đó, MDA là một trong số các biomarker được nghiên cứu nhiều nhất trong các trạng thái sinh lý và bệnh lý cả trên mô hình động vật và trên người Có rất nhiều phương pháp định lượng MDA khác nhau, trong đó phương pháp phản ứng TBAR là một trong những phương pháp đơn giản, và thông dụng nhất Ưu điểm của phương pháp phản ứng TBARS là dễ thực hiện, năng suất cao, không đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại và có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ Tuy nhiên, kết quả phản ứng TBARS chịu nhiều ảnh hưởng bởi các hóa chất, quy trình cũng như các sản phẩm phụ gây nhiễu đến kết quả Để khắc phục một phần các nhược điểm của phương pháp phản ứng TBARS truyền thống, các thiết bị phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký khí (GC), Khối phổ (MS) đã được áp dụng để cải tiến phản ứng TBARS Nhưng trên thực tế, không phải phòng thí nghiệm nào cũng được trang bị các thiết bị phân tích hiện đại này Trên cơ sở các vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Chuẩn hóa quy trình định lượng Malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa trên mẫu mô cơ và máu" với mục đích: - Chuẩn hóa và kiểm soát quy trình phản ứng TBARS để có một phương pháp định lượng sơ bộ Malondialdehyde tốt nhất - Phân tích ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa tới quy trình tạo MDA và định lượng MDA từ chất chuẩn và trong mô cơ và máu bằng phản ứng TBARS Đề tài được tiến hành tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội lOMoARcPSD|11346942 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Stress oxy hóa Stress oxy hóa là một thuật ngữ chỉ trạng thái mất cân bằng giữa sự sản xuất, hoạt động của các "gốc tự do có nguồn gốc oxy" hay còn được gọi là các "hình thái oxy hóa hoạt động" (Reactive oxygen species - ROS) và khả năng của cơ thể sống trong việc khử các hợp chất trung gian hoạt tính cao, cũng như sửa chữa hư hại do những chất này gây nên Ngày nay, stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và mãn tính, cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa như bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường [17, 41] Gốc tự do có thể được định nghĩa là các phân tử hoặc mảnh vỡ phân tử có chứa một hoặc nhiều electron độc thân trong orbital nguyên tử hoặc phân tử Các gốc tự do ROS là một trong các “gốc hình thái hoạt động” quan trọng nhất trong cơ thể sống [41] ROS có thể được tạo thành từ nguồn gốc ngoại sinh hoặc nội sinh Nguồn gốc ngoại sinh như tia UV, tia X, tia γ hoặc do các chất ô nhiễm trong khí quyển Nguồn gốc nội sinh như: là sản phẩm phụ của chuỗi truyền điện tử trong ty thể; hay được sản xuất bởi bạch cầu trung tính, đại thực bào trong viêm; hoặc là sản phẩm của các phản ứng được xúc tác bởi kim loại hay các enzymeví dụ NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) [42] 1.2 Peroxit hóa lipid Một trong các tác động phá hủy của ROS lên các đại phân tử sinh học đặc biệt phải chú ý đến là sự peroxit hóa lipid (Lipid peroxidation – LPO) Sự peroxit hóa lipid màng gây thay đổi các đặc tính sinh học của màng, làm bất hoạt các thụ thể liên kết màng hay các enzyme dẫn đến làm giảm chức năng của các tế bào bình thường và tăng tính thấm của màng Hơn nữa, sự peroxit hóa lipid còn có thể gây ra và “khuếch đại” các tổn thương tế bào do tạo ra các sản phẩm oxi hóa thứ cấp [43] Khác với các gốc tự do có thời gian tồn tại ngắn, các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxit hóa lipid có thời gian bán hủy dài hơn và có khả năng khuếch tán qua màng tế bào, tấn công tới các đích ở xa nơi chúng được hình thành Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxit hóa lipid là các aldehyde như malonaldehyde (MDA), hexanal, 4-hydroxynonenal (HNE) hay acrolein đã được chứng minh có thể phản ứng với các đại phân tử sinh học như ADN, Protein và Phospholipid [17, 23] lOMoARcPSD|11346942 Hiện nay, peroxit hóa lipid được xem là nguyên nhân chính liên quan đến việc oxy hóa, phá vỡ cấu trúc màng và tạo ra các chất độc có thể làm tổn hại hay gây chết tế bào Peroxit hóa lipid là một quá trình phức tạp xảy ra ở cả thực vật và động vật Nó liên quan đến sự hình thành và phát tán các gốc lipid dư thừa điện tử, sự sắp xếp lại các liên kết đôi trong chất béo không bão hòa (PUFA) dẫn đến phá hủy màng lipid, cũng như sản xuất một loạt các sản phẩm phụ gây độc, trong có các gốc rượu, xeton, andehyde và ete [13] Sự peroxit hóa các lipid chứa gốc acid béo có thể dẫn đến một chuỗi các “phản ứng dây chuyền phân nhánh” tạo ra thêm gốc tự do mới Sở dĩ như vậy bởi vì từ một gốc tự do kích thích ban đầu (R°) có thể dẫn đến sự hình thành của rất nhiều các gốc tự do bên cạnh lipid hydroperoxyde (LOOH) như là: LO°, °OH và LOO° [18] Các gốc LOO° & LO° được gọi là các “sản phẩm sơ cấp” của quá trình peroxit hóa lipid, chúng có thể phân hủy theo nhiều cơ chế khác nhau tạo ra vô số các sản phẩm thứ cấp ổn định hơn và gây độc cho tế bào Sự peroxit hóa của các PUFAs là rất phức tạp vì có rất nhiều các loại axit béo có mặt trong cơ thể của động vật có vú Ngoài ra sự phức tạp này còn do vị trí của các gốc peroxyl Esterbauer ước tình rằng có khoảng 120-150 sản phẩm có thể tạo ra từ quá trình peroxit hóa lipid, chẳng hạn như các gốc lipid alkoxyl (LO°) tiếp theo có thể phân cắt beta tạo ra các sản phẩm ngắn hơn (từ C2 đến C12 với một dải các nhóm chức khác nhau) hoặc bị biến đổi phần carboxylic của nó (phân cắt tạo HNE); các gốc lipid peroxyl (LOO°) có thể tạo sản phẩm trung gian bicyclic endoperoxide rồi từ đó tạo ra MDA [23, 42] Các “sản phẩm thứ cấp” của quá trình peroxit hóa lipid có thể là aldehyde, alkane, isoprostane, alkene, ketone, alcohol và furane dưới các điều kiện phản ứng khác nhau Các sản phẩm aldehyde đặc biệt được chú ý bởi chúng là các sản phẩm hoạt động và có độc tính với tế bào Trong các aldehyde thì MDA được xem như chỉ thị sinh học của sự peroxit hóa các axit béo omega-3, omega-6 và được sử dụng nhiều nhất để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid [18, 23] 1.3 Malondialdehyde 1.3.1 Đặc điểm, tính chất của MDA Malondialdehyde (MDA) là một trong những sản phẩm cuối của quá trình peroxit hóa lipid đang được quan tâm hàng đầu hiện nay MDA là chỉ thị của mức độ tổn thương lOMoARcPSD|11346942 oxy hóa ở các tế bào và mô MDA cũng được sử dụng như một chỉ thị của tổn thương màng tế bào MDA có thể được tìm thấy trong hầu hết các mẫu sinh học bao gồm huyết tương, huyết thanh, mô và nước tiểu MDA có bản chất hóa học một hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp (M=72,04 g/mol), có công thức cấu tạo là C3H4O2, với hai nhóm aldehyde ở vị trí C1 và C3 và có tính axit yếu, pKa=4,46 MDA là một chất dễ bay hơi, ổn định dưới điều kiện trung tính Trong dung dịch và pha khí, MDA bị enol hóa hoàn toàn và nhanh chóng giữa các dạng liên kết Hidro nội phân tử không đối xứng (Hình 1.b và d) với một hàng rào thấp để biến đổi lẫn nhau thông qua cấu trúc cộng hưởng liên kết Hidro đối xứng (Hình 1.c) H椃nh 1 Các dạng cấu hình của MDA [27] Trong các dung môi hữu cơ, MDA tồn tại ở dạng cấu hình cis (Hình 1.b và d) Tuy nhiên trong nước, MDA tồn tại ở dạng cấu hình trans, dưới dạng bazo liên hợp (Hình 1.a và e) MDA hấp thụ bước sóng ở vùng tử ngoại với dung môi là nước có tính axit, chúng hấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm với hằng số hấp thụ điện tử ε = 13.103(cm-1 M-1) (Hình 2)[27] MDA được xem là sản phẩm có khả năng đột biến cao [3] MDA có độ ổn định hóa học cao và khả năng thấm qua màng tốt hơn các gốc tự do chứa oxy (ROS) khác, đồng thời MDA cũng không độc như 4-HNE và methyl glyoxal (MG) [20] Một số nghiên cứu