BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TRẦN NHẬT TRƯỜNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CAO THEO HƯỚNG HỮU CƠ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI VĂN THẮNG Hà Nội, 2023 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Đề tài nghiên cứu của tôi “Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) năng suất và chất lượng cao theo hướng hữu cơ” Đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Bùi Văn Thắng Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu nội dung và kết quả nghiên cứu không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2023 Người cam đoan Trần Nhật Trường ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự động viên, khuyến khích, hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy giáo, cô giáo Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành chương trình học tập tại Trường và thực hiện đề tài này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo - PGS TS Bùi Văn Thắng, người đã tận tình và dành rất nhiều thời gian cũng như tâm huyết hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới quý Công ty Cổ phần Dược liệu Hataco Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ về cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm, kinh phí để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách tốt nhất Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó Với sự nỗ lực hết sức của bản thân, tôi đã cố gắng hoàn thành luận văn với nội dung đầy đủ, sâu sắc, có hướng mở Tuy nhiên, do hạn chế về nhận thức và thời gian nghiên cứu, luận văn chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo, góp ý của quý thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp để luận văn được hoàn thiện hơn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2023 Học viên Trần Nhật Trường iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1 Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 3 1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại Cordyceps militaris 3 1.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm Cordyceps militaris 4 1.1.3 Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris 5 1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 5 1.2.1 Giá trị dược liệu 5 1.2.2 Hợp chất có hoạt tính sinh học từ Cordyceps militaris 10 1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong nước về nấm Cordyceps militaris 12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16 Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 23 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 23 2.2 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 23 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 24 iv 2.3 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 24 2.3.1 Chủng nấm Cordyceps militaris 24 2.3.2 Nguyên liệu hữu cơ 25 2.3.3 Các chất đa lượng và hóa chất phân tích 25 2.3.4 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian khử trùng và độ tuổi quả thể nấm được phân lập đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris 26 2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris (giống cấp 2) 28 2.4.3 Nghiên cứu xác định môi trường rắn hữu cơ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin của nấm Cordyceps militaris 29 2.4.4 Phương pháp nuôi trồng, đánh giá năng suất, hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được cấy bằng dung dịch giống lỏng hữu cơ trên ký chủ Tằm dâu nguyên con 32 2.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng cordycepin và adenosine bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 34 2.5 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu 35 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian khử trùng và độ tuổi phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris 36 3.1.1 Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian khử trùng đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của nấm Cordyceps militaris 36 3.1.2 Kết quả sự ảnh hưởng của độ tuổi mẫu phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris 39 v 3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris 41 3.3 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tổng hợp hữu cơ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin của nấm Cordyceps militaris 44 3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cơ chất đến quá trình sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris 44 3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cơ chất đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm Cordyceps militaris 58 3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cơ chất đến khối lượng và năng suất sinh học của sinh khối nấm Cordyceps militaris 75 3.3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cơ chất đến hoạt chất cordycepin và adenosine trong Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 83 3.4 Kết quả nghiên cứu nuôi trồng, đánh giá năng suất, hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được cấy bằng dung dịch giống lỏng hữu cơ trên ký chủ Tằm dâu nguyên con 96 3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khả năng hình thành hệ sợi và quả thể nấm Cordyceps militaris 96 3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm Cordyceps militaris 99 3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khối lượng sinh khối nấm Cordyceps militaris 102 3.4.4 Kết quả xác định hàm lượng cordycepin và adenosin trong nấm Cordyceps militaris trên ký chủ Tằm dâu nguyên con 103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa đầy đủ BE Chỉ tiêu năng suất sinh học (%) CT Công thức ĐTHT Đông trùng hạ thảo HPLC Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao NT Nghiệm thức OD Phép đo mật độ quang của dung dịch chất thử Mức ý nghĩa quan sát, tương ứng với giá trị thống p kê kiểm định Potatose dextrose Aga PDA vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris cấp 1 ở các mức nồng độ ethanol và thời gian khử trùng mẫu khác nhau 36 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu phân lập đến sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống cấp 1 39 Bảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của loại môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris 41 Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nhộng Tằm dâu đến khả năng hình thành và phát triển quả thể 44 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Tằm dâu đến khả năng hình thành và phát triển quả thể 48 Bảng 3.6 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Đuông dừa đến khả năng hình thành và phát triển quả thể 52 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng gan Lợn đến khả năng hình thành và phát triển quả thể 55 Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nhộng Tằm dâu đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm 59 Bảng 3.9 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Tằm dâu đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm 63 Bảng 3.10 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Đuông dừa đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm 67 Bảng 3.11 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng gan Lợn đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm 71 Bảng 3.12 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nhộng Tằm dâu đến khối lượng và năng suất sinh học sinh khối nấm Cordyceps militaris 75 Bảng 3.13 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Tằm dâu đến khối lượng và năng suất sinh học sinh khối nấm Cordyceps militaris 77 viii Bảng 3.14 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Đuông dừa đến khối lượng và năng suất sinh học sinh khối nấm Cordyceps militaris 79 Bảng 3.15 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng gan Lợn đến khối lượng và năng suất sinh học sinh khối nấm Cordyceps militaris 81 Bảng 3.16 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nhộng Tằm dâu đến hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 83 Bảng 3.17 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Tằm dâu đến hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 86 Bảng 3.18 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng Đuông dừa đến hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 89 Bảng 3.19 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng gan Lợn đến hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 93 Bảng 3.20 Kết quả thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khả năng hình thành hệ sợi và quả thể nấm Cordyceps militaris 97 Bảng 3.21 Kết quả thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể Cordyceps militaris 99 Bảng 3.22 Kết quả thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khối lượng sinh khối nấm Cordyceps militaris 102 Bảng 3.23 Kết quả xác định hàm lượng cordycepin và adenosin trong nấm Cordyceps militaris trên ký chủ Tằm dâu nguyên con 104 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris ở ngoài tự nhiên (A) và nuôi trồng (B) 4 Hình 1.2 Nấm C militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử 4 Hình 3.1 Đường kính khuẩn lạc sau 15 ngày phân lập 37 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc nấm C militaris sau 15 ngày nuôi cấy 40 Hình 3.3 Cầu nấm C militaris trong các môi trường dịch lỏng khác nhau sau 10 ngày nuôi lắc 42 Hình 3.4 Hệ sợi phát triển trên cơ hữu cơ được chất bổ sung nhộng Tằm sau 5 ngày ủ tối 45 Hình 3.5 Quả thể nấm C militaris hình thành, phát triển trên môi trường hữu cơ bổ sung nhộng Tằm dâu sau 15 ngày chiếu sáng 46 Hình 3.6 Hệ sợi phát triển trên cơ hữu cơ được chất bổ sung Tằm dâu sau 5 ngày ủ tối 49 Hình 3.7 Quả thể nấm C militaris hình thành, phát triển trên môi trường hữu cơ bổ sung Tằm dâu sau 15 ngày chiếu sáng 49 Hình 3.8 Hệ sợi phát triển trên cơ hữu cơ được chất bổ sung Đuông dừa sau 5 ngày ủ tối 52 Hình 3.9 Quả thể nấm C militaris hình thành, phát triển trên môi trường bổ sung Đuông dừa sau 15 ngày chiếu sáng 53 Hình 3.10 Hệ sợi phát triển trên cơ hữu cơ được chất bổ sung gan lợn sau 5 ngày ủ tối 56 Hình 3.11 Quả thể nấm C militaris hình thành, phát triển trên môi trường bổ sung bột gan lợn sau 15 ngày chiếu sáng 56 Hình 3.12 Hình ảnh mẫu nấm C militaris 55 ngày nuôi trồng trên môi trường bổ sung nhộng Tằm dâu 59 Hình 3.13 Kích thước mẫu nấm C militaris 55 ngày nuôi trồng trên môi trường bổ sung nhộng Tằm dâu 60