NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN HẠC VỸ (DENDROBIUM APHYLLUM (ROXB ) FISHER) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO - Full 10 điểm

i M Ụ C L Ụ C M Ở ĐẦ U 1 PH Ầ N I T Ổ NG QUAN 3 1 1 Cơ s ở khoa h ọ c v ề nhân gi ố ng lan 3 1 1 1 B ả o t ồ n hoa lan 3 1 1 2 Các k ỹ thu ậ t v ề nhân gi ố ng hoa lan 3 1 2 M ộ t vài nét v ề loài D aphyllum ngh iên c ứ u 7 1 2 1 Phân lo ạ i 7 1 2 2 M ộ t s ố đặ c điể m th ự c v ậ t chính v ề loài lan D aphyllum 7 1 2 3 Phân b ố c ủ a lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ 9 1 2 4 Giá tr ị s ử d ụ ng và th ự c tr ạ ng khai thác loài lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ c ủ a Vi ệ t Nam 9 1 3 Yêu c ầ u đi ề u ki ệ n ngo ạ i c ả nh v ớ i chi Hoàng t h ả o ( Dendrobium ) 10 1 4Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o ( Dendrobium ) trên th ế gi ớ i và ở Vi ệ t Nam 11 1 4 1 Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o (Dendrobium) trên th ế gi ớ i 11 Dendrobium 12 1 4 2Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o (Dendrobium) ở Vi ệ t Nam 13 1 5 M ộ t s ố nghiên c ứ u v ề nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium 14 1 5 1 Tình hình nghiên c ứ u nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium th ế gi ớ i 15 1 5 2 Tình hình nghiên c ứ u nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium ở Vi ệ t Nam 16 1 6Nghiên c ứ u v ề nuôi tr ồ ng cây lan Dendrobium sau nuôi c ấ y mô 17 1 6 1 Ảnh hưở ng c ủ a giá th ể 17 1 6 2 Ảnh hưở ng c ủa dinh dưỡ ng 18 PH Ầ N II- V Ậ T LI Ệ U, N ỘI DUNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 19 2 1 V ậ t li ệ u 19 2 3 Phƣơng pháp nghiên c ứ u 19 2 3 1 Phương pháp khử trùng và nuôi c ấ y t ạ o v ậ t li ệ u kh ởi đầ u Lan D aphyllum 19 ii 2 3 2 Phương pháp nghiên cứ u nhân nhanh protocorms và ch ồ i 21 2 3 5 Phương pháp nghiên cứ u t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 22 2 4 Phƣơng pháp xử lý s ố li ệ u 23 PH Ầ N III- K Ế T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N 24 3 1 Nghiên c ứ u kh ử trùng và nuôi c ấ y kh ởi độ ng m ẫ u loài lan H ạ c v ỹ 24 3 1 1 K ế t qu ả nghiên c ứu xác đị nh phương pháp khử trùng đố i v ớ i qu ả lan 24 3 1 2 Ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưởng BA đế n giai đoạ n kh ởi độ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệu ban đầ u 25 3 2 Nghiên c ứ u kh ả năng nhân giố ng in vitro 26 3 2 1 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a BA + α NAA đ ế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i 27 3 2 2 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n khoai tây đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 28 3 2 3 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ốt đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 30 3 2 4 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a b ộ t t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 31 3 3 Nghiên c ứ u t ạ o cây hoàn ch ỉ nh in vitro 32 3 3 1 Ảnh hưở ng c ủ a IBA t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh 33 PH Ầ N 4- K Ế T LU ẬN VÀ ĐỀ NGH Ị 35 4 1 K Ế T LU Ậ N 35 4 2 ĐỀ NGH Ị 35 TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O 36 PH Ụ L Ụ C 42 iii DANH M Ụ C CÁC KÝ HI Ệ U, CÁC CH Ữ VI Ế T T Ắ T AC: Activated carbon (than ho ạ t tính) BA: Benzyladenine acid CT: Công th ứ c CTTN: Công th ứ c thí nghi ệ m CV(%): H ệ s ố bi ế n đ ộ ng (Correlation of Variants) CW : Coconut water (nướ c d ừ a) D: Dendrobium (lan Hoàng th ả o) Đ/C: Đố i ch ứ ng IBA: Indolbutyride acid α NAA : α - Naphthalene acetic acid LSD: So sánh theo giá tr ị khác bi ệt có nghĩa nhỏ nh ấ t ở m ứ c α  0,05 PLBs: Protocorm like bodies SH: Schenk and Hildebrandt T B: Trung bình TCLs: Thin cell layers TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW: Vacin and Went iv DANH MỤC CÁC BẢNG B ảng1 1 Đặc điể m th ự c v ậ t chính c ủ a loài lan nghiên c ứ u 8 B ả ng 3 1 Ảnh hưở ng c ủa phương pháp khử trùng đế n t ỷ l ệ m ẫ u s ố ng 24 và n ả y m ầ m c ủ a lan H ạ c v ỹ 24 B ả ng 3 2 Ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưởng BA đế n kh ả năng tạ o ch ồ i t ừ m ẫ u c ấy ban đầ u 26 B ả ng 3 3 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a BA + α NAA đ ế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i (sau 6 tu ầ n) 28 B ả ng 3 4 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch khoai tây nghi ềnđế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i ( sau 6 tu ầ n) 29 B ả ng 3 5 Ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ốt đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 30 B ả ng 3 6 Ảnh hưở ng c ủ a b ộ t t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 31 B ả ng 3 7 Ảnh hưở ng c ủ a IBA t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh 33 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 1 Lan H ạ c v ỹ 8 Hình 2 1 Qu ả lan H ạ c v ỹ đưa vào nuôi cấ y in vitro 20 Hình 3 1 S ự n ả y m ầ m c ủ a h ạ t lan H ạ c v ỹ 25 Hình 3 2 Nhân nhanh protocorm và ch ồ i 32 Hình 3 3 T ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 34 1 MỞ ĐẦU Chi Hoàng th ả o ( Dendrobium ) là m ộ t trong nh ữ ng chi l ớ n nh ấ t c ủ a h ọ Lan (Orchidaceae), ướ c tính có kho ả ng 1 184 loài (Leitch et al , 2009) và đượ c phân b ố t ừ vùng nhi ệt đớ i và c ậ n nhi ệt đới châu Á Thái Bình Dương đế n New Zealand (Govaerts et al , 2011) Lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) Fisher) thu ộ c chi Hoàng th ả o ( Dendrobium ) là loài lan r ừng đẹ p, có giá tr ị y h ọ c và giá tr ị thương mạ i cao Trên th ế gi ớ i chúng phân b ố ở Ấ n Đ ộ , Nepan, Butan, Trung Qu ố c, Mianma, N epal, Sri Lanka , Thái Lan, Lào, Camphuchia, Malaixia Ở Vi ệ t Nam, H ạ c v ỹ thư ờ ng m ọ c ở m ộ t s ố vùng : Lâm Đ ồ ng, Khánh Hòa, Lào Cai, Sơn La, B ắ c C ạ n, Ninh Thu ậ n … (Averyanov et al , 2005; Sách đ ỏ Vi ệ t Nam, 2007) Theo y h ọ c c ổ truy ề n Trung Qu ố c, L an D aphyllum có tác d ụ ng ch ữ a b ệ nh như: Dùng tr ị ho, đau h ọ ng, b ỏ ng l ử a; toàn cây tr ị kinh phong tr ẻ em, ăn u ố ng b ị ng ộ đ ộ c ( Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam, 200 7) Do nhu c ầ u s ử d ụ ng làm cây hoa c ả nh và dư ợ c li ệ u tăng m ạ nh trong th ờ i gian g ầ n đây nên loài D aphyllum đã b ị khai thác ki ệ t qu ệ M ặ t khác, t ỷ l ệ n ả y m ầ m t ừ h ạ t trong t ự nhiên r ấ t th ấ p và vùng phân b ố c ủ a D aphyllum b ị tàn phá nghiê m tr ọ ng nên loài cây này lâm vào tình tr ạ ng g ầ n như tuy ệ t ch ủ ng và đư ợ c đưa vào Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam, 200 7 và h ạ ng m ụ c IUCN ( Romand - Monnier, 2013) c ầ n ph ả i đư ợ c b ả o v ệ Do v ậ y c ầ n có các bi ệ n pháp k ỹ thu ậ t đ ể nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và phát tri ể n loài lan dư ợ c li ệ u có giá tr ị này c ủ a Vi ệ t Nam Nh ằ m góp ph ầ n làm phong phú ngu ồ n dư ợ c li ệ u quý c ủ a Vi ệ t Nam, làm đ ẹ p môi trư ờ ng c ả nh quan, nâng cao thu nh ậ p cho ngư ờ i tr ồ ng lan, chúng tôi th ự c hi ệ n đ ề tài: “Nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) F isher) b ằ ng k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y in vitro ” 1 M ụ c tiêu c ủa đề tài Nhân nhanh đượ c loài lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) Fisher) b ằ ng k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y in vitro , nh ằ m góp ph ầ n b ả o t ồ n và phát tri ển loài Lan dượ c li ệ u quý hi ế m c ủ a Vi ệ t Nam 2 Ý nghĩa khoa h ọ c và th ự c ti ễ n c ủa đề tài 2 1 Ý nghĩa khoa họ c 2 * K ế t qu ả c ủ a đ ề tài có th ể đư ợ c s ử d ụ ng làm tài li ệ u tham kh ả o cho vi ệ c nghiên c ứ u, gi ả ng d ạ y v ề hoa lan nói chung và chi lan Hoàng t h ả o nói riêng * Góp ph ầ n xây d ự ng quy trình nhân gi ố ng in vitro lan D aphyllum v ốn chưa đượ c nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam * Cung c ấ p s ố li ệ u và thông tin khoa h ọ c cho các nhà nghiên c ứ u khoa h ọ c tham kh ả o 2 2 Ý nghĩa thự c ti ễ n c ủa đề tài * Góp ph ầ n b ả o t ồ n và phát tri ển cây dượ c li ệ u, cây c ả nh có giá tr ị c ủ a Vi ệ t Nam Giúp bà con vùng núi cao xóa đói giả m nghèo, ổn đị nh cu ộ c s ố ng, không ch ặ t phá r ừ ng * Góp ph ầ n p hát tri ể n khu du l ị ch sinh thái * Đề xu ất phương pháp nhân nhanh giố ng v ớ i s ố lượ ng l ớ n, s ạ ch b ệ nh, giá thành phù h ợp, đáp ứ ng nhu c ầ u c ủ a th ị trườ ng cung c ấ p nguyên li ệ u cho ngành Dượ c ph ụ c v ụ n ộ i tiêu, nâng cao s ứ c kh ỏ e c ộng đồ ng và ti ế n t ớ i tham gia xu ấ t kh ẩ u 3 Đối tƣợ ng và ph ạ m vi nghiên c ứ u * Qu ả lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum ) thu th ậ p t ừ Khánh Hòa và đư ợ c đưa vào nuôi c ấ y in vitro t ạ i phòng nuôi c ấ y mô t ế bào th ự c v ậ t c ủ a Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ - B ộ KH&CN * Các nghiên c ứ u đư ợ c ti ế n hành t ạ i Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ - B ộ KH &CN 3 PHẦN I TỔNG QUAN 1 1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan 1 1 1 Bảo tồn hoa lan Trên th ế gi ớ i nhi ều loài lan đang có nguy cơ tuyệ t ch ủ ng, hi ếm và đượ c li ệ t kê trong ph ụ l ụ c II c ủ a CITES, do nhi ều nguyên nhân như biến đổ i khí h ậ u, khai thác quá m ứ c, buôn bán b ấ t h ợ p pháp và l ấ n chi ếm đất đai Hoa lan đượ c bi ết đến như là cây c ả nh quan tr ọ ng ở Vi ệt Nam, đặ c bi ệ t là lan r ừ ng Các loài lan r ừ ng c ủ a Vi ệ t Nam n ổ i ti ế ng v ớ i v ẻ đẹp và tính năng riêng biệ t c ủa chúng và đang có nhu cầ u s ử d ụ ng làm c ả nh và làm thu ố c cao trên toàn th ế gi ới Do đó cầ n có các bi ệ n pháp k ỹ thu ật để nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và phát tri ể n loài lan có giá tr ị c ủ a Vi ệ t Nam Hoa lan, có th ể đượ c duy trì trong t ự nhiên (b ả o t ồ n in situ ) và chuy ể n kh ỏ i môi trườ ng s ố ng c ủ a chúng (b ả o t ồ n ex situ ) B ả o t ồ n in situ là cách t ố t nh ất để b ả o t ồ n s ự đa dạ ng di truy ền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong m ộ t th ờ i gian dài và có nguy cơ bị m ấ t do b ị sâu b ệ nh, sinh h ọ c và stress phi sinh h ọ c Ngoài ra, r ấ t t ố n kém do s ử d ụng lao động và đấ t (Montakarn Pimsen, 2014) B ả o t ồ n ngu ồ n gen b ằ ng nuôi c ấ y in vitro và b ả o qu ả n l ạnh đượ c s ử d ụng để b ả o t ồn đa d ạ ng di truy ề n c ủa chúng Đây là cơ sở khoa h ọc để đề tài ứ ng d ụ ng k ỹ thu ậ t này trong công tác b ả o t ồ n loài lan Ngh ệ tâm và H ạ c v ỹ 1 1 2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan 1 1 2 1 Nhân gi ố ng h ữ u tính H ạ t lan r ấ t nh ỏ , có c ấ u t ạ o không hoàn ch ỉ nh M ộ t qu ả lan có th ể ch ứ a 1 300 -4 000 000 h ạ t H ạ t lan có hình d ạng, kích thướ c và màu s ắ c r ấ t khác nhau H ầ u h ế t các h ạ t lan có chi ề u r ộ ng 0,09 - 0,27 mm và chi ề u dài 0,25 -1,2 mm Tr ọ ng lượ ng h ạ t t ừ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 μg) Các h ạ t có ch ứ a m ộ t phôi nh ỏ , thi ế u n ội nhũ, do đó muố n h ạ t n ả y m ầ m ph ả i t ạo đủ điề u ki ện dinh dưỡ ng và môi trườ ng M ặ t khác, trong t ự nhiên h ạ t lan ph ải đượ c nhi ễ m nhi ề u lo ạ i n ấ m kí sinh thu ộ c chi Rhizoctonia m ớ i có th ể n ả y m ầm đượ c (Montakarn Pimsen, 2014) Phương pháp n ả y m ầ m h ạ t lan in vitro là m ộ t ph ầ n quan tr ọ ng c ủ a trương trình b ả o t ồ n và nhân gi ố ng các loài lan quý hi ế m, cung c ấ p cây con cho chương trình 4 ph ụ c h ồ i tái sinh r ừ ng 1 1 2 2 Nhân gi ố ng vô tính M ộ t s ố phương pháp nhân giố ng vô tính b ằ ng tách ch ồi vượt, giâm hom nhưng đề u cho h ệ s ố ng nhân gi ố ng th ấ p, c ầ n di ệ n tích l ớ n, c ầ n nhi ề u cây m ẹ , cây d ễ b ị b ệ nh, nhanh b ị lão hóa, kh ả năng sinh trưở ng kém, r ấ t khó s ử d ụ ng vào m ục đích thương mạ i K ỹ thu ậ t nuôi c ấy mô đang phát triể n r ộng rãi để nhân gi ố ng các loài lan, nh ờ k ỹ thu ậ t này, nh ữ ng gi ống lan quý đã có thể nhân gi ố ng d ễ dàng v ớ i h ệ s ố nhân gi ống cao, cây đồng đề u, ổn đị nh v ề m ặ t di truy ề n, s ạ ch b ệ nh, có s ứ c s ố ng cao Có th ể dùng nhi ề u b ộ ph ậ n c ủ a hoa lan làm b ộ ph ậ n nuôi c ấy như: gieo h ạ t invitro , đỉnh sinh trưở ng, m ắ t ng ủ trên thâ n, phương pháp lớ p m ỏ ng t ế bào… a) Các phương pháp nhân giố ng in vitro - Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưở ng Nuôi c ấy đỉnh sinh trưở ng là m ộ t trong nh ữ ng k ỹ thu ậ t h ữ u hi ệ u nh ằm đả m b ả o các đặ c tính di truy ề n c ủ a m ẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960) Khi nuôi c ấ y đỉnh sinh trưở ng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như mộ t s ố gi ố ng cây khác là hình thành c ấ u trúc protocorm để sau đó có thể bi ệ t hóa thành cây Nhân các protocorm s ẽ t ạ o thành các protocorm m ớ i g ọ i là protocorm like body (Morel, 1964) Không như trong nuôi cấ y mô s ẹ o in vitro c ủ a nh ữ ng loài th ự c v ậ t khác, vi ệ c thi ế t l ậ p gen c ủ a protocorm đượ c xác đị nh ngay t ừ protocorm hình thành ban đầ u (Neumann et al , 2009) - Th ể ti ề n ch ồ i (Protocormlike body) Protocorm like body (PLB) là thu ậ t ng ữ đề ch ỉ nh ữ ng c ấ u trúc gi ố ng v ớ i protocorm và có ngu ồ n g ố c t ừ nuôi c ấ y in vitro đỉnh sinh trưở ng hay mô phân sinh c ủ a ch ồ i b ất đị nh ở các loài lan (Joseph& Robert, 1992) Đây là cấ u trúc l ần đầ u tiên được đặ t ra b ở i Morel khi nuôi c ấy đỉ nh ch ồ i c ủ a Cymbidium để t ạ o ra nh ữ ng cây s ạ ch virus v ớ i các protocorm hình thành t ừ đỉnh sinh trưở ng mà không ph ả i là t ừ h ạt Như vậ y, nuôi c ấ y mô phân sinh h ọ Lan s ẽ hình thành các protocormlike body (Morel, 1964) K ỹ thu ậ t này v ừ a t ạ o ra cây s ạ ch b ệ nh virus , đồ ng nh ấ t v ề ki ể u gen v ừ a cho t ỷ l ệ nhân gi ố ng cao - Phương pháp nuôi c ấ y l ớ p m ỏ ng t ế bào L ớ p m ỏ ng t ế bào (TCL) bao g ồ m các m ẫu có kích thướ c nh ỏ c ắ t t ừ nh ữ ng t ổ 5 ch ứ c th ự c v ật (thân, lá, phát hoa, sơ khở i hoa hay t ổ ch ứ c hoa, lá m ầ m tr ụ trên/dướ i lá m ầm, vùng đỉ nh hay phôi) Các lát c ắ t có th ể c ắ t d ọ c (lTCL), hay c ắ t ngang (tTCL) Các 1TCL ch ỉ ch ứ a m ộ t lo ại mô như tầ ng các t ể bào bi ểu bì nhưng các tTCL l ạ i bao g ồ m các t ế bào t ừ các ki ể u mô khác nhau: t ế bào bi ể u bì, vùng v ỏ , t ầ ng phát sinh g ỗ , quanh m ạ ch và lõi, nhu mô Nuôi c ấ y các TCL có th ể phân l ậ p các t ế bào, các t ầ ng mô và ph ụ thu ộ c vào tr ạ ng thái di truy ề n, các y ế u t ố ngoài gen, các điề u ki ện sinh trưở ng có ki ể m soát (ánh sáng, nhi ệt độ , pH, ch ất điề u hòa sinh trưở ng th ự c v ậ t, các ch ấ t b ổ sung vào môi trườ ng ) d ẫ n t ớ i s ự c ả m ứ ng in vitro phát sinh hình thái Kh ả năng phát sinh hình thái c ủ a m ộ t TCL ph ụ thu ộ c các y ế u t ố như: sự nh ậ n bi ế t các d ấ u hi ệu đúng, sự truy ề n tính tr ạ ng, kh ả năng di truyền để đáp ứ ng và ph ả n ứ ng v ớ i các d ấ u hi ệ u này, tình tr ạ ng sinh lý và ngu ồ n g ố c (mô hay t ổ ch ứ c) c ủ a TCL, các y ế u t ố stress, các tr ạ ng thái im l ặ ng c ủ a gen Các t ế bào trong TCL có th ể ph ả n bi ệ t hóa d ẫn đế n vi ệ c thi ế t k ế các ki ể u hình Trong các TCL, con đườ ng phát sinh hình thái c ủ a nh ữ ng mô chuyên trách xu ấ t phát t ừ các t ế bào, các mô có th ể được điề u khi ể n và ki ể m soát rõ ràng, cho phép nghiên c ứ u v ề s ự thay đổ i phân t ử , sinh lý, sinh hóa có th ể x ảy ra Các TCL cũng sử d ụ ng trong tăng cường trao đổ i các h ợ p ch ấ t th ứ c ấp, dượ c ch ấ t qua vi ệ c nuôi c ấ y các t ổ ch ứ c chuy ể n gen, nuôi c ấ y th ự c v ậ t t ự dưỡ ng b ằ ng bioreactor ( Dương Tấ n Nh ự t, 2007) Các l ớ p t ế bào m ỏng đã đượ c s ử d ụ ng thành công trong th ể ti ề n ch ồ i ( protocorm-like body ) và t ạ o callus ở Aranda , Coelogyne cristata , Cymbidium spp , Dendrobium spp , Doritaenopsis , Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis, Spathoglottis và X enikophyton ( Jaime A Te ixeira da Silva, 2013b) b) Môi trường dinh dưỡ ng trong nuôi c ấ y in vitro Có nhi ề u lo ại môi trườ ng nuôi c ấ y thích h ợ p cho vi nhân gi ống hoa lan như: Knuson L (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW) (1949)…Mỗ i lo ại môi trường đề u có ch ất vi lượng và đa lượ ng, vitamin khác nhau Nói chung, s ự sinh trưở ng và phát tri ể n c ủ a cây in vitro đề u ph ụ thu ộ c vào môi trườ ng nuôi c ấ y - Các h ợ p ch ấ t h ữ u cơ t ự nhiên M ộ t s ố lượ ng l ớ n các ch ấ t h ữu cơ tự nh iên như: peptone, nướ c ép cà r ốt, nướ c ép cà chua, chi ế t xu ấ t t ừ th ị t bò, d ịch khoai tây, nướ c d ừ a và d ị ch chu ố i, d ị ch bí ngô, t ảo,…thường đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấ y có tác d ụ ng r ấ t t ố t trong 6 vi ệ c phát tri ể n cây gi ống đã đượ c báo cáo ở nhi ề u loài lan như: Nướ c d ừa đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấy hoa lan để kích thích mô s ẹ o ho ặ c hình thành protocorm và thường đượ c s ử d ụ ng là 10 - 25% Nướ c d ừ a 30% cho t ỷ l ệ phôi n ả y m ầ m t ối đa vớ i lan D ovatum (Willd ) (Thejaswini et al , 2017) D ị ch nghi ề n c ủ a khoai tây có ch ứa cacbonhydrat dướ i d ạ ng saccaroza, glucose và fructose, amino axít (21 lo ạ i bao g ồ m c ả lysine là m ột axít amin thườ ng không có trong protein th ự c v ậ t), các mu ối khoáng (K, Fe, Mg…) và đặ c bi ệ t là các vitamin (C, B1, B6) D ị ch nghi ền khoai tây thườ ng đượ c b ổ sung vào môi trườ ng vi nhân gi ố ng hoa lan và đặ c bi ệ t có hi ệ u qu ả v ớ i m ộ t s ố loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis Nướ c ép cà r ố t ch ứ a cytokinin, giàu ch ấ t khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E) và glutamin đượ c s ử d ụ ng kích thích s ự phân chia t ế bào c ủ a th ự c v ậ t * B ổ sung b ộ t t ả o Spirulina ở n ồng độ 50 mg/l có tác độ ng hi ệ u qu ả đế n t ỷ l ệ s ố ng c ủ a ch ồ i và s ố ch ồi đạ t c ủ a lan Paphiopedilum delenatii Guillaumin (Nguy ễ n Th ị Cúc và cs , 2014) Than ho ạt tính đượ c b ổ sung vào môi trườ ng giúp làm gi ảm độ c t ố b ằ ng cách đào thả i các h ợ p ch ất độ c phenolic ti ế t ra trong th ờ i gian nuôi c ấ y B ổ sung than ho ạ t tính có tác d ụ ng hi ệ u qu ả lên s ự phát sinh và tăng sinh mô sẹ o, s ự phát sinh phôi và nhân phôi cũng được đề c ập trên đối tượ ng D dixanthum Lindley(Su et al , 2014) Không ch ỉ có các ch ấ t h ợ p ch ấ t h ữu cơ đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấ y, các ch ất điều hòa sinh trưở ng th ự c v ật cũng đượ c s ử d ụ ng ph ổ bi ế n trong nuôi c ấ y hoa lan Có hai nhóm chính c ủa điều hòa sinh trưở ng th ự c v ậ t: cytokinin và auxin Các cytokinin thường được dùng trong môi trườ ng nuôi c ấ y mô th ự c v ậ t: BA, kinetin và TDZ để kích thích s ự phân chia t ế bào, gây ra s ự hình thành ch ồ i và s ự gia tăng chồ i nách và làm ch ậ m s ự hình thành r ễ Các Auxin (2,4-D, α NAA, IAA và IBA) thư ờ ng đư ợ c dùng trong nuôi c ấ y hoa lan đ ể kích thích s ự phân chia t ế bào, bi ệ t hoá r ễ , hình thành mô s ẹ o, kìm hãm s ự phát tri ể n ch ồ i và t ạ o ra các r ễ ph ụ Ngoài ra, Axit abscisic (ABA) đư ợ c b ổ sung đ ể ứ c ch ế ho ặ c kích thích s ự phát tri ể n mô s ẹ o, thúc đ ẩ y s ự trư ở ng thành c ủ a phôi sinh dư ỡ ng, ứ c ch ế s ự nhân phôi th ứ c ấ p, ngăn c ả n s ự n ả y m ầ m s ớ m c ủ a phôi sinh dư ỡ ng (Saad et al , 2012) - Các h ợ p ch ấ t ch ứ a carbon Carbon là thành ph ầ n r ấ t quan tr ọng trong môi trườ ng nuôi c ấ y cho s ự tăng 7 trưở ng và phát tri ể n c ủ a các mô Hi ện nay cacbon đượ c b ổ s ung vào môi trườ ng nuôi c ấ y vì thi ế u ánh sáng và n ồng độ CO 2 th ấp trong điề u ki ệ n in vitro Đường đã đượ c s ử d ụng như mộ t ngu ồn carbon và như là cơ quan quả n th ẩ m th ấ u trong môi trườ ng nuôi c ấ y Có nhi ề u lo ại đường đượ c s ử d ụ ng trong nuôi c ấ y in vitro như: sucrose, glucose, maltose, fructose, lactose và sorbitol Sucrose ở n ồng độ 20 và 30 g/l đượ c s ử d ụ ng ph ổ bi ế n nh ấ t trong nghiên c ứ u nuôi c ấ y mô hoa lan (Montakarn Pimsen, 2014) 1 2 Một vài nét về loài D aphyllum nghiên cứu Chi lan Hoàng Th ả o ( Dendrobium ) được đặ t tên vào nă m 1799, Dendrobium đượ c hi ể u là lan s ố ng trên cây, ti ế ng Vi ệ t Nam g ọ i là chi lan Hoàng Th ả o Lan Hoàng Th ả o có nhi ề u màu s ắ c và hình thái khác nhau (Tr ầ n Duy Quý,2005) Chi Hoàng th ả o (Dendrobium ) là một trong những chi lớn nhất củahọ Lan (Orchidaceae) , ướ c tính có kho ả ng 1 400 loài (Jin et al , 2009) S ố lượ ng các loài lan Hoàng th ả o Vi ệ t Nam có kho ả ng 110 loài (Leonid et al , 2013) 1 2 1 Phân loại Theo các tác gi ả (Tr ầ n H ợ p, 1998; Leltch và cs , 2009) cây lan HoàngTh ả o thu ộ c chi Dendrobium , phân lo ạ i nh ư sau: Lan H ạ c v ỹ có tên khoa h ọ c là: Dendrobium aphyllum (Roxb ) C Fisch Đ ồ ng danh: Limodorum aphyllum Roxb 1795; Dendrobium pierardii Roxb ex Hook 1822 Chi: lan Hoàng T h ả o D e nd r o b i um H ọ : Phong lan Or c h i d ac ea e B ộ : b ộ lan O r c h i d a l e s 1 2 2 Một số đặc điểm thực vật chính về loài lan D aphyllum M ộ t s ố đặc đ i ể m th ự c v ậ t chính v ề loài lan D aphyllum ( b ả n g 1 1 ) 8 Hình 1 1 Lan Hạc vỹ Bảng1 1 Đặc điểm thực vật chính của loài lan nghiên cứu Đ ặ c đi ể m Lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ Tên khoa h ọ c D e nd r o b i um aphyllum T h ân L an ph ụ sinh , t hân dài 60 - 80 cm, hình tr ụ , d ầ y 0,4 - 0,5 cm, lóng dài 2,5 - 3 cm Lá L á hình mác nh ọ n, dài 6 - 8 cm, r ộ ng 1,5 - 2 cm H o a C ụ m hoa bên, 1 - 2 hoa, m ọ c su ố t d ọ c chi ề u dài thân không còn lá Lá b ắ c hình b ầ u d ụ c, dài kho ả ng 0,3 cm, hoa màu tím nh ạ t, đư ờ ng kính kho ả ng 4 cm, cu ố ng hoa và b ầ u dài 2,0 - 2,5 cm Các lá đài hình mác h ẹ p, đ ỉ nh nh ọ n dài 2,4 - 2,7 cm, r ộ ng 0,6 - 0,7 cm Môi màu vàng nh ạ t, đôi khi pha tím r ấ t nh ạ t, hình g ầ n tròn, dài 2,7 - 3 cm, r ộ ng 2,5 - 2,6 cm, mép có lông ng ắ n, b ề m ặ t ph ủ lông thưa, có 3 đư ờ ng s ố ng ng ắ n ở ph ầ n g ố c, hai bên 9 g ố c có v ạ ch chéo màu tía C ộ t màu tr ắ ng, cao kho ả ng 0,5 cm; tuy ế n m ậ t hình bán nguy ệ t; răng c ộ t có đ ỉ nh nh ọ n N ắ p màu tr ắ ng, đ ỉ nh màu tím, ph ủ nhú m ị n Q u ả Q u ả n a n g h ì n h c h ùy , v ỏ q u ả d à y , qu ả có 4 k h ố i p h ấ n , c h ứ a r ấ t n h i ề u h ạ t n ằ m x en l ẫ n n h ữ n g s ợ i l ô n g m ả nh 1 2 3 Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ Trên th ế gi ớ i lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ phân b ố ở Ấ n Đ ộ , Nêpan, Butan, Trung Qu ố c, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia Ở Vi ệ t Nam, lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ phân b ố t ạ i Lâm Đ ồ ng (Lang Bian, Đà L ạ t: Prenn; Đơn Dương), Khánh Hòa (Su ố i Giao, Yersin, Hòn Bà) , Lào Cai , B ắ c C ạ n, Ninh Thu ậ n ( Averyanov L , Av eryanova A, 2005 ; Sách đ ỏ Vi ệ t Nam, 2007 ) , Chúng m ọ c bám trên cây g ỗ l ớ n trong r ừ ng ở đ ộ cao 400 - 1500 m 1 2 4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của Việt Nam V ớ i đặ c điể m r ấ t đa d ạ ng v ề ki ể u dáng,s ặ c s ỡ v ề màu s ắ c hoa và n ở hoa vàonhi ề u th ờ i điể m khác nhau nên các loài lan Hoàng th ả o b ả n đị a ở nướ c ta b ị khai thác tri ệ t để ph ụ c v ụ nhu c ầ u trang trí, thưở ng lãm Hơn th ế n ữ a, m ộ t s ố loài thu ộ c chi Hoàng Th ả o cũng là v ị thu ố c dân t ộ c c ổ truy ề n dùng để ch ữ a b ệ nh Nhi ề u loài đượ c s ử d ụ ng làm thu ố c như:D loddigesii Rolfe , D fimbriatum Hook Var oculatum Hook , D candidum Wall Ex Lindl , D chrysanthum Wall ex Lindl , D nobile Lindl (Đ ỗ Huy Bích, 2004) , D aphyllum ( Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam , 2007) Lan H ạ c v ỹ ( D aphyllum (Roxb )Fisch ) đượ c coi là m ộ t lo ạ i cây thu ố c quý, trong s ố các ―Thầ n nông th ảo dược‖ và đượ c x ế p vào lo ạ i s ả n ph ẩ m cao c ấ p có tác d ụ ng b ổ âm thanh nhi ệ t, t ạo nướ c b ọ t có l ợ i cho d ạ dày, b ổ ph ế và gi ả m ho B ằ ng phương pháp phân tích quang phổ , các nhà khoa h ọc đã chứ ng minh các polysaccharides (đường đa) AP là Acetylglucose - O, ch ứ a liên k ế t β (l - ›4), d ạ ng vòng c ủ a m ỗ i ch ấ t c ặ n th ủ y phân có d ạ ng tháp trong đó các m ạ ch chính đư ợ c c ấ u t ạ o b ở i D - manose và D - glucose Các thí nghi ệ m lâm sàng ti ế n hành trên đ ộ ng v ậ t cho th ấ y AP có ho ạ t tính t ổ ng h ợ p ch ấ t mi ễ n d ị ch t ố t (Zhao Yong - Ling et al , 1994) 10 Zh ang, (2008) đã xác định đượ c trong thân lan H ạ c v ỹ có ch ứ a: moscatilin, gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và p- hydroxylbenzylacetic acid Veronika Cakova et al , (2017) cho r ằ ng ngoài polysaccharides còn có các h ợ p ch ấ t phenol n hư moscatin, moscatilin và tricetin 3'''', 4'''', 5''''-trimetyl ete 7-O-  - glucopyranoside, ứ c ch ế s ả n xu ấ t NO, có ho ạ t đ ộ ng đi ề u hòa mi ễ n d ị ch Các ch ấ t ch ống oxy hoá peptide đượ c chi ế t xu ấ t t ừ H ạ c v ỹ (D aphyllum (Roxb ) Fisch )bao g ồ m superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys ch ỉ ra r ằ ng peptit DA- P có hàm lượ ng ch ất dinh dưỡ ng cao và có ho ạt độ ng ch ố ng oxy hoá t ối ưu (Huifan Liu et al , 2017) T ừ các nghiên c ứ u trên cho th ấ y r ấ t c ầ n thi ế t ph ả i nhân gi ố ng loài lan H ạ c v ỹ ph ụ c v ụ cho s ứ c kh ỏe con người cũng như bả o t ồ n ngu ồ n gen quý 1 3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng t hảo ( Dendrobium ) Nhi ệt độ Lan Hoàng th ả o thu ộ c lo ại cây ưa nóng, sinh trưở ng t ố t ở nhi ệt độ 24-33 0 C Dướ i 12 0 C và trên 37 0 C đề u làm ch ậ m và ảnh hưở ng l ớn đế n s ự ra hoa c ủ a cây Trong th ự c t ế s ả n xu ấ t t ạ i mi ề n B ắc có mùa đông lạ nh và mùa hè nóng thì c ầ n h ạ n ch ế tác độ ng x ấ u c ủ a nhi ệt độ b ằng cách vào mùa đông thì che phủ nilon quanh nhà tr ồ ng lan ho ặ c th ắ p điện còn mùa hè che lướ i ph ả n quang, có h ệ th ố ng phun tướ i thích h ợ p và t ạo điề u ki ệ n thông thoáng trong nhà lan s ẽ đem lạ i hi ệ u qu ả rõ r ệ t (Nguy ễ n Th ị Kim Lý, 2009) Ẩm độ Độ ẩ m thích h ợp giúp cho cây đượ c phát tri ển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn Lan Hoàng th ả o cũng như đa số các gi ố ng lan khác ch ỉ phát tri ể n t ốt trong điề u ki ệ n không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩ m kho ả ng t ừ 40-60%, vào ban đêm độ ẩ m thích h ợ p t ừ 60-90% thì cây s ẽ phát tri ể n t ốt hơn Loạ i giá th ể quá ẩ m và úng s ẽ là điề u ki ệ n b ấ t l ợ i cho s ự sinh trưở ng c ủ a gi ố ng Dendrobium vì có th ể b ị th ố i toàn b ộ r ễ và bi ể u hi ệ n là các cây con m ọ c t ừ ph ầ n ng ọ n c ủ a thân (Bùi Th ị Thu Hi ề n, 2009) Ánh sáng 11 Lan Hoàng th ả olà gi ống ưa sáng, có thể tr ồng trong điề u ki ệ n ánh sáng tr ự c ti ế p hay khu ế ch tán Ánh sáng h ữ u hi ệ u cho gi ố ng Lan Hoàng th ả olà 70%, vì th ế giàn che v ới độ che sáng 30% dưới đấ t và 40% ở trên cao v ới cường độ ánh sáng t ừ 15 00030 000 lux r ấ t thích h ợ p cho s ự phát tri ể n c ủ a Lan Hoàng th ả o Mùa hè c ủ a mi ề n B ắc cường độ ánh sáng m ạ nh, nhu c ầ u ánh sáng c ủ a lan Hoàng Th ả o kho ả ng 70-80% ánh sáng tr ự c ti ếp Trong điề u ki ện râm mát cây thườ ng y ế u, m ọng nướ c, r ấ t d ễ nhi ễ m b ệ nh v ề mùa đông cường độ ánh sáng y ế u và th ờ i gian chi ế u sáng ng ắn, để lan Hoàng th ảo sinh trưở ng và phát tri ể n t ốt và ra hoa đượ c thì c ầ n b ổ sung ánh sáng b ằ ng cách th ắp điện cho vườ n lan (Bùi Th ị Hi ề n, 2009) Dinh dƣỡ ng Lan Hoàng th ả o yêu c ầ u m ột lượng dinh dưỡ ng nh ất định để sinh trưở ng và phát tri ển Tuy không đòi hỏ i s ố lượ ng l ớn nhưng phải đầy đủ các thành ph ầ n dinh dưỡ ng N, P, K và các nguyên t ố trung, vi lượ ng Tu ỳ t ừng giai đoạn sinh trưở ng mà nhu c ầu đố i v ớ i các thành ph ần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân, Đặ ng Th ị T ố Nga, 2008) Giá th ể Giá th ể c ủ a Lan Hoàng th ả oc ầ n ch ậ u ph ả i th ật thoáng và không úng nướ c Tuy nhiên do b ản năng sinh họ c và c ấ u trúc th ự c v ậ t v ớ i gi ả hành có thân, các loài thu ộ c gi ố ng Lan Hoàng th ả oc ầ n giá th ể hơi ẩm chút ít nhưng không đượ c làm th ố i căn hành Vì thế m ộ t s ố loài Lan Hoàng th ả o có th ể phát tri ể n trên các giá th ể là xơ d ừ a hay c ả qu ả d ừa, dùng như mộ t cái ch ậ u ch ứ a s ẵ n giá th ể Tuy nhiên n ế u giá th ể là xơ dừ a ph ả i h ạ n ch ế s ố l ần tưới nướ c, n ế u ch ậ u là qu ả d ừ a nguyên ph ải cưa phầ n đáy, nế u không cây b ị th ố i vì quá ẩm Cũng có thể tr ồ ng cây lan Lan Hoàng th ả ov ới căn hành cách đáy chậ u kho ả ng 3cm, r ồ i r ả i th ật thoáng xung quanh căn hành là m ộ t s ố r ễ l ụ c bình gi ặ t s ạ ch V ớ i cách tr ồng này thì kích thướ c ch ậ u và cây ph ả i th ật tương xứ ng Tuy nhiên, giá th ể than và g ạ ch nung v ẫ n t ỏ ra hi ệ u qu ả nh ấ t đố i v ớ i các loài Lan Hoàng th ả o 1 4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới và ở Việt Nam 1 4 1 T ình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới 12 Hoa Lan chi ế m m ộ t ph ầ n l ớn trong thương mạ i toàn c ầ u v ề tr ồ ng hoa trong ch ậ u và hoa c ắt cành và ướ c tính kho ảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mạ i trên th ị trườ ng qu ố c t ế Giá tr ị thương mạ i trung bình c ủ a hoa lan c ắ t cành t ừ năm 2007 đến năm 2012 là 483,000,000 $ US Trong năm 2012, trên th ế gi ớ i đã có hơn 40 nướ c xu ấ t kh ẩ u hoa lan và 60 nướ c nh ậ p kh ẩ u hoa lan và t ổ ng giá tr ị thương m ạ i toàn c ầ u là 504,740,644$ US ( Nguồn : Department of Foreign Trade, Thailand (2013) ; (Jayarama Reddy, 2016) Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39 67%), tiếp theo Th ái Lan (28,41%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%) Các n ước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%) Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài lan Dendrobium chiếm 85% và Phalaenopsis , Cymbidium chiếm 15% (Cheamuangphan et al, 2013; L C De et al , 2014 ) Thái Lan là nướ c xu ấ t kh ẩ u l ớ n nh ấ t th ế gi ớ i c ủ a các loài lan nhi ệt đớ i Trung Qu ố c là nướ c tiêu th ụ l ớ n nh ấ t c ủ a hoa phong lan c ắ t t ừ Thái Lan 7493 t ấ n, theo sau là Nh ậ t B ả n, M ỹ , Ý, Ấn Độ, Đài Loan, Việ t Nam và Hà Lan t ạ i 4407, 2892, 2395, 1830, 983, 793 và 689 t ấ n N ăm 2012, t ạ i Thái Lan người ta ướ c tính r ằ ng 46% s ản lượng hoa lan đã đượ c tiêu th ụ trong nước và 54% đượ c xu ấ t kh ẩ u( K Thammasiri, 2015) Dendrobium là loài hoa tr ồ ng trong ch ậ u và hoa c ắ t cành ph ổ bi ế n trên toàn th ế gi ớ i, Dendrobium đư ợ c đánh giá cao vì s ự đa d ạ ng đáng kinh ng ạ c c ủ a chúng v ớ i đ ặ c đi ể m r ấ t đa d ạ ng v ề ki ể u dáng, s ặ c s ỡ v ề màu s ắ c hoa và n ở hoa vào nhi ề u th ờ i đi ế m khác nhau và đ ộ b ề n hoa kéo dài Hawaii, California và Florida là vùng tr ồ ng Dendrobium trong ch ậ u l ớ n t ạ i Hoa K ỳ Giá tr ị m ặ t hàng này ở Hawaii đã đư ợ c tìm th ấ y trong nhi ề u th ậ p k ỷ và doanh thu tăn g t ừ 2,4 tri ệ u USD năm 1991 lên 5,6 tri ệ u USD trong năm 2000 ( L C De, N G Debnath Correct, 2011 ) Ở Thái Lan có r ấ t nhi ề u Công ty l ớ n, s ở h ữ u vài ch ụ c ha lan như Công ty Thái Orchid ở Ratchaburi, Công ty Siam Taiyo ở Samut - sakhon Các công ty này ngoài di ệ n tích tr ự c ti ế p qu ả n lý 15 – 20ha, h ọ còn liên k ế t v ớ i các công ty, nông tr ạ i nh ỏ t ạ o thành h ệ th ố ng v ệ tinh; trong đó, h ọ là h ạ t nhân trong s ả n xu ấ t và xu ấ t kh ẩ u Kho ả ng 60 – 70% s ả n lư ợ ng lan c ắ t cành c ủ a Thái Lan đư ợ c xu ấ t kh ẩ u đ ế n 38 nư ớ c trên th ế gi ớ i, đ ạ t giá tr ị 104 tri ệ u USD (2009) Trong đó, xu ấ t kh ẩ u sang 13 Vi ệ t nam, trong đó: Dendrobium c ắ t cành: 22 917 059 cành, Dendrobium tr ồ ng ch ậ u: 2 502 178 ch ậ u (Ngu ồ n: B ộ Nông nghi ệ p & HTX Thái Lan ) T ạ i Hà Lan, vi ệ c s ả n xu ấ t hoa lan Dendrobium tr ồ ng trong ch ậ u hi ện tăng ph ổ bi ến đạt 40 đế n 50 tri ệu cây Thái Lan là nướ c xu ấ t kh ẩ u l ớ n nh ấ t th ế gi ớ i v ề các loài lan c ắ t cành nhi ệt đớ i và nhà cung c ấ p l ớ n th ứ hai vào th ị trườ ng EU, chi ế m 22% ngu ồ n cung vào th ị trườ ng EU Thái Lan n ắ m gi ữ m ộ t v ị th ế m ạ nh trong s ả n xu ấ t lan Dendrobium ( L C De et al, 2014) Theo Weichao Zhang et al , (2009) trên th ị trườ ng các lo ạ i th ự c ph ẩ m ch ứ c năng có nguồ n g ố c t ừ t ự nhiên t ừ lan D aphyllum, D devonianum và D oYcinale đượ c bán bán v ớ i giá r ấ t cao 2 000-4 000 USD/kg 1 4 2T ình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam Vi ệ t Nam n ằ m trong vùng nhi ệt đớ i gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên ch ủ ng lo ạ i lan r ừ ng r ấ t phong phú, có điề u ki ệ n khí h ậ u thu ậ n l ợ i có th ể thích h ợ pphát tri ể n các gi ố ng lan thu ộ c chi Dendrobium, Cattleya, Oncidium Di ệ n tích tr ồ ng hoa lan ở Vi ệ t Nam còn ở m ứ c h ế t s ứ c khiêm t ố n, ch ỉ chi ế m 10% di ệ n tích các lo ại hoa đang đượ c tr ồ ng S ả n xu ấ t hoa lan ở Vi ệ t Nam t ập trung theo 2 hướ ng chính: - S ả n xu ấ t theo quy mô công nghi ệ p các loài lan m ớ i lai t ạ o ho ặc đượ c nh ậ p n ộ i (lan công nghi ệ p) - Khai thác và nuôi tr ồ ng các loài hoa lan b ản đị a (lan r ừ ng) Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận Xã Đông La, La Phù, La Khê – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc và chủ yếu là chi lan Hoàng Thảo Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, với quy mô từ 300 - 500m2,… (Hoàng Xuân Lam, 2014) 14 Ở TP H ồ Chí Minh ch ủ y ế u tr ồ ng các loài lan ( Dendrobium, Mokara, Vanda, Oncidium …) và di ệ n tích khá khiêm t ố n, kho ả ng 200ha, b ằ ng 5,4% so v ớ i hoa Lan Thái Ở mi ề n B ắ c, m ộ t s ố cơ quan nghiên c ứ u như Vi ệ n Di truy ề n Nông nghi ệ p, Vi ệ n Nghiên c ứ u Rau qu ả , H ọ c vi ệ n Nông nghi ệ p Vi ệ t Nam, Vi ệ n Ứ ng d ụ ng công ngh ệ , trong nh ữ ng năm v ừ a qua đã t ậ p trung nghiên c ứ u phương pháp nhân gi ố ng vô tính in vitro K ế t qu ả đã s ả n xu ấ t m ỗ i năm đư ợ c hàng v ạ n cây con gi ố ng hoa lan có giá tr ị trong đó có lan Hoàn g th ả o N ăm 2015 Vi ệ n Di truy ề n Nông nghi ệ p đã xây d ự ng mô hình nhân gi ố ng các gi ố ng hoa lan Dendrobium di ệ n tích 1 000 m 2 quy mô 30 000 cây/năm, mô hình s ả n xu ấ t hoa thương ph ẩ m di ệ n tích 15 000 m 2 , s ả n xu ấ t đư ợ c 60 000 cây gi ố ng D oanh thu đ ạ t 280 tri ệ u/1 000 m 2 … Đ ố i v ớ i th ị trư ờ ng trong nư ớ c, s ả n lư ợ ng hoa phong lan cũng chưa đáp ứ ng đư ợ c nhu c ầ u c ủ a ngư ờ i tiêu dùng Các cơ s ở s ả n xu ấ t hoa lan cũng ch ỉ đáp ứ ng đư ợ c 30 – 40% nhu c ầ u lan c ắ t cành còn l ạ i ph ả i nh ậ p t ừ các nư ớ c khác Hi ệ n nay, m ỗ i năm V i ệ t Nam v ẫ n ph ả i chi hàng t ỷ đ ồ ng đ ể nh ậ p phong lan t ừ các nư ớ c láng gi ề ng cho nhu c ầ u n ộ i đ ị a Th ị trư ờ ng nh ậ p kh ẩ u lan c ắ t cành chính c ủ a Vi ệ t Nam trong th ờ i gian qua là Thái Lan v ớ i g ầ n 90% lư ợ ng lan c ắ t cành ( Dendrobium ) và lan ch ậ u ( Cattleya, Oncidium ) Hiện nay, các loài lan Hoảng thảo bản địa đang b ị khai thác ồ ạ t, chúngkhông ch ỉ đượ c tiêu th ụ trong n ướ c mà còn đượ c các th ươ ngláing ườ iTrungQu ố cthugomvàxu ấ t kh ẩu theo con đườ ng ti ể ung ạ ch Giábán c ủ acáccâylan nàyđượ cthugombán trên th ị trườ ngth ườ ngt ừ 700- 900 000đồ ng/kg cây tươi Như vậ y, v ấn đề s ả n xu ấ t, kinh doanh, hoa lan ở Vi ệ t Nam t ừ trước đế n nay v ẫ n ở d ạ ng ti ềm năng Trong khi đó, sứ c c ạ nh tranh trên th ị trườ ng th ế gi ớ i là r ấ t l ớ n Nh ữ ng ho ạt độ ng kinh doanh và xu ấ t kh ẩ u trong th ờ i gian qua ch ỉ m ớ i có ý nghĩa khởi độ ng, h ứ a h ẹ n m ộ t s ự phát tri ển trong tương lai dự a trên nh ững điề u ki ệ n thu ậ n l ợ i s ẵ n có cho s ự phát tri ể n ngành tr ồ ng lan 1 5 M ộ t s ố nghiên c ứ u v ề nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium 15 1 5 1 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới Trong nh ững năm gần đây, trên thế gi ới đã có nhiều cơ sở nghiên c ứ u tìm các bi ệ n pháp nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và lưu gi ữ các loài Lan quí hi ế m có nguy cơ b ị tuy ệ t ch ủ ng Dutta et al , ( 2011) s ử d ụ ng h ạ t c ủ a D aphyllum 15 tu ầ n tu ổ i đư ợ c n ả y m ầ m trên môi trư ờ ng MS H ạ t gi ố ng hình thành protocorm sau 5 tu ầ n nuôi c ấ y Các PLBs cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m, s ố ch ồ i và r ễ nhi ề u hơn trên môi trư ờ ng MS b ổ sung IAA + KN Dake Zhao et al , (2013) nghiên c ứ u nhân gi ố ng và t ạ o hoa trong ố ng nghi ệ m loài lan D wangliangii G W Hu, C L Long & X H Jin Xin Qian et al , (2014) nghiên c ứ u s ả n xu ấ t hoa và h ạ t gi ố ng loài lan D officinale Kimura et Migo trong ố ng nghi ệm đã tạo đượ c calluses t ừ các đỉ nh ch ồi trên môi trườ ng MS b ổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l α NAA, nhi ề u ch ồ i đư ợ c tái sinh t ừ các m ẫ u PLBs khi c ấ y trong môi trư ờ ng MS + 1 mg/l α NAA Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có kh ả năng ra hoa cao (83,2%) v ớ i t ỷ l ệ hoa bình thư ờ ng 73,6% khi c ấ y trên môi trư ờ ng MS + 15% nư ớ c d ừ a + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tu ầ n Mohammad Musharof Hossain et al , (2013) nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan H ạ c v ỹ cho r ằng môi trườ ng Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho h ạ t n ả y m ầ m t ố t trong lúc h ệ s ố nhân protocorm trên môi trườ ng Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l α NAA khá cao Đ ố i v ớ i loài l an D jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al , 2016) cho r ằ ng môi trư ờ ng MS thích h ợ p cho nuôi c ấ y t ừ hoa, môi trư ờ ng KC phù h ợ p v ớ i nuôi c ấ y t ừ lá, môi trư ờ ng VW phù h ợ p v ớ i nuôi c ấ y t ừ đ ố t thân Tapash Kumar Bhowmik et al , (2017) k ế t lu ận: môi trườ ng Phytamax (PM) có b ổ sung 20 g/l sucro đem lạ i t ỷ l ệ h ạ t n ả y m ầ m loài D palpebra Lindley , cao hơn so v ớ i gluco và fructo Thejaswini et al , (2017) cho r ằng nước ép cà chua và nướ c d ứ a 15% cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m t ố t nh ấ t khi gieo h ạ t in vitro lan D ovatum (Willd ) Theo Edy Setiti WidaUtami et al , (2017), b ổ sung 2 g/l peptone trong môi trườ ng VW đã đượ c ch ứng minh là hàm lượ ng thích h ợ p cho s ự n ả y m ầ m c ủ a h ạ t, hình thành ch ồ i v ớ i s ự phát tri ể n c ủ a protocorm Nghiên c ứ u v ề nuôi c ấ y c ắ t lát m ỏng đã đượ c các tác gi ả th ự c hi ệ n trên m ộ t s ố đối tượ ng: nuôi c ấ y c ắ t lát m ỏ ng ngang thân cây con in vitro lan D chrysotoxum Lindley(chi ề u dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al , 16 (2018) nhân gi ố ng lan D aphyllum (Roxb ) Fisch t ừ các l ớ p t ế bào lát m ỏ ng c ắ t ngang (t - TCL); Parthibhan et al , (2018) nghiên c ứ u tái sinh phôi soma đư ợ c hình thành t ừ các l ớ p t ế bào lát m ỏ ng c ắ t ngang (tTCL) c ủ a lan D aqueum Lindley 1 5 2 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium ở Việt Nam Ở Vi ệ t Nam hi ện nay đã có mộ t s ố tác gi ả nghiên c ứ u nhân gi ố ng các loài lan Hoàng th ả o quý nh ằ m b ả o t ồ n và phát tri ể n ngu ồn gen có nguy cơ tuyệ t ch ủ ng: Nguy ễn Thanh Tùng và cs , 2010)đã nuôi cấ y nh ữ ng lát m ỏ ng theo chi ề u ngang (tTCL) c ủ a D aduncum v ới kích thướ c kho ả ng 1,0 - 1,5 mm Lát m ỏ ng t ế bào đượ c c ấy lên môi trườ ng t ối ưu cả m ứ ng protocorm - like bodies là môi trườ ng ½ MS b ổ sung 0,5 mg/l BAP cho 29,85 protocorm - like bodies/lát m ỏ ng sau 8 tu ầ n nuôi c ấ y Nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan d ượ c li ệu Kim Điệ p ( D chrysotoxum ), Long nhãn (D Fimbriatum Hook ) b ằng phương pháp gieo hạ t in vitro v ớ i m ục đích bả o t ồ n và phát tri ể n loài lan quý (Nguy ễn Văn Song và cs, 2011 ); Nguy ễ n Th ị Sơn và cs, 2012) Vũ Ngọ c Lan, Nguy ễ n Th ị Lý Anh (2013), đã nghiên cứ u nhân gi ố ng gieo h ạ t in vitro Lan D nobile Lindl , s ử d ụ ng qu ả 5 tháng tu ổi; môi trườ ng gieo h ạ t là MS + (10% CW + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít môi trườ ng Trong nhân in vitro kinh điển, môi trườ ng nhân nhanh protocorm t ối ưu là KC+ 10% CW + 10g/l saccharose + 6,0g/l agar; nhân nhanh c ụ m ch ồ i t ố t nh ấ t là MS + (10% CW + 10g/l saccharose + 6,0g/l agar) Trong nhân in vitro c ả i ti ế n: nuôi c ấ y l ỏ ng l ắ c nút bông và l ỏ ng l ắc màng thoáng khí đã tăng hệ s ố nhân protocorm đạ t 1,9 và 2,3 l ầ n so v ớ i nhân in vitro kinh điể n Nuôi c ấy đặ c thoáng khí giúp gi ảm 25% lượ ng saccharose b ổ sung vào môi trường và tăng hệ s ố nhân protocorm lên g ấ p 1,4 l ầ n so v ớ i nuôi c ấy kinh điể n Nhân nhanh c ụ m ch ồ i b ằ ng k ỹ thu ậ t bioreactor gi ả m ½ th ờ i gian nhân gi ống Môi trườ ng t ối ưu tạ o cây hoàn ch ỉ nh là RE + (10g saccharozase + 0,5g THT)/lít, cường độ ánh sáng 2300lux Nguy ễ n Th ị Sơn và cs, (2014)nghiên cứ u nhân gi ố ng b ằ ng gieo h ạ t in vitro loài lan D officinale trên môi trườ ng VW+ 10% CW + 10g/l sucrose + 6g/l agar + 10% CW, nhân nhanh c ụ m ch ồ i t ố t nh ất trên môi trườ ng MS + 10% CW + 20g/l sucrose + 6g/l agar + 60g/l chu ố i chín Nhân gi ố ng vô tính thông qua nuôi c ấ y 17 đoạ n thân mang m ắ t ng ủ s ử d ụng đoạ n thân in vitro mang 2 m ắ t ng ủ và nuôi c ấ y trên môi trườ ng MS + 20g/l sucrose + 10% CW + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α - NAA + 6g/l agar Môi trư ờ ng t ạ o cây hoàn ch ỉ nh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α - NAA 1 6 Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 1 6 1 Ảnh hƣởng của giá thể Giá th ể có ý nghĩa quan trọng đố i v ớ i nuôi tr ồng cây lan, đặ c bi ệ t là trong giai đoạn vườm ươm Sử d ụ ng giá th ể phù h ợ p s ẽ gi ữ am giúp cho cây sinh trưở ng, phát tri ể n t ố t Nhi ề u tác gi ả Trung qu ốc đã quan tâm nghiên cứ u v ề ảnh hưở ng c ủ a giá th ể đến sinh trưở ng, phát tri ể n c ủ a cây lan Dendrobium Theo Pan Chun-xiang et al , (2009) các lo ạ i giá th ể v ỏ cây, mùn cưa, gạ ch v ụn đã ảnh hưởng đế n c ấ u trúc r ễ c ủ a cây D chrysanthum K ế t qu ả cho th ấ y các cây tr ồ ng trên giá th ể g ạ ch v ụ n có s ố t ế bào chóp r ễ nhi ều hơn và thành củ a các t ế bào nhu mô t ủ y và nhu mô m ạ ch c ủ a r ễ l ại dày hơn so vớ i tr ồ ng trên các lo ạ i giá th ể khác Bijaya Pant et al , ( 2012) cho răng giái thể thích h ợ p cho loài lan D primulinum Lindlgiá th ể g ạ ch: rêu v ớ i t ỷ l ệ 2: 1 T ỷ l ệ cây s ống sót đạ t 70% ở ngoài vườn ươm Mohammad Musharof Hossain et al , ( 2013) cho r ằ ng giá th ể thích h ợ p tr ồ ng cây con D aphyllum h ỗ n h ợ p m ả nh g ạ ch , than, xơ dừ a và ch ấ t khoáng (1: 1: 0,5: 0,5) Selvaraju Parthibhan et al , (2015) cho r ằ ng tr ồ ng cây D aqueum Lindley trên giá th ể m ả nh g ạ ch và than c ủi (1:1), để rêu trên b ầ u và ch ụ p túi polyethylene giúp làm ẩ m, cho cây t ỷ l ệ cây con s ố ng cao Abdul Aziz Mirani et al , (2017a) đã nghiên ảnh hưở ng các giá th ể đế n t ỷ l ệ s ống và sinh trưở ng c ủ a lan D nobile Lindley, tác gi ả cho r ằng cây con đượ c c ấ y trên môi trườ ng MS + 3 mg/l α NAA, sau đó cây đư ợ c tr ồ ng trên giá th ể h ỗ n h ợ p than bùn x ừ a: cát: đá trân ch âu (1,0: 1,0: 0,2) là t ố t nh ấ t cho t ỉ l ệ s ố ng 100% sau 120 ngày 18 1 6 2 Ảnh hƣởng của dinh dƣỡng Trong giai đoạn vườn ươm, cây lan cấy mô đượ c cung c ấp dinh dưỡng dướ i d ạ ng phun dung d ị ch phân bón lên toàn b ộ b ề m ặ t cây Dinh dưỡng NPK đóng mộ t vai trò quan tr ọ ng trong s ự tăng trưở ng và phát tri ể n c ủ a cây lan Ở giai đoạn vườ n ươm, cây lan cấy mô đượ c cung c ấp dinh dưỡng dướ i d ạ ng phun dung d ị ch phân bón lên toàn b ộ b ề m ặt cây Dwiyani (2012) đã kế t lu ậ n, s ử d ụ ng Hyponex làm tăng chiề u cao cây và s ố lá c ủ a Dendrobium sp Kabir et al , (2012) đã xác đị nh trên loài lan Dendrobium sp, xu hướng tăng chi ề u dài lá, chi ề u r ộ ng lá, di ệ n tích lá, s ố lá và t ổ ng di ệ n tích lá là cao nh ấ t khi phun N: P: K v ớ i t ỷ l ệ 10:25:30 phun 1tu ầ n/l ầ n Chi ều cao cây và đườ ng kính thân đạ t t ối đa khi phun dinh dưỡ ng N: P: K t ỷ l ệ 15:20:20 phun 1tu ầ n/l ầ n 19 PHẦN II - VẬT LIỆU , NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu * V ậ t li ệ u th ự c v ậ t: V ậ t li ệ u nuôi c ấ y in vitro là qu ả c ủ a loài cây D Aphyllum đượ c thu th ậ p ở Hòn Bà-Khánh Hòa * Hóa ch ấ t : - Ch ấ t kh ử trùng dùng trong thí nghi ệ m H 2 O 2 , HgCl 2, NaOCl * Môi trƣ ờ ng nuôi c ấ y: - Murashige & Skoog (MS), các ch ấ t đi ề u ti ế t sinh trư ở ng, N6 - benzyladenine (BA), Indolbutyride acid (IBA), sucrose, activated carbon ( AC), , đư ợ c b ổ sung vào tùy m ụ c đích thí nghi ệ m * Trang thi ế t b ị : - Bu ồ ng c ấ y vô trùng (Bioiogical safety Cabinets) - N ồ i h ấ p kh ử trùng (Auto Clave) c ủ a hãng Tomy Nh ậ t B ả n - Cân điệ n t ử c ủa Đứ c - Má y đo pH - T ủ s ấ y - Bình tam giác có kích thướ c t ừ 250ml - 500ml, pipet lo ạ i 1ml, d ụ ng c ụ nuôi c ấ y 2 2 N ộ i dung th ự c hi ệ n c ủa đề tài: Để đạt đượ c m ục đích nghiên cứu, đề tài th ự c hi ệ n các n ộ i dung chính sau đây: 2 2 1 Nghiên c ứ u t ạ o v ậ t li ệ u kh ởi đầ u cho nuôi c ấ y in vitro 2 2 2 Nghiên c ứ u nhân nhanh protocorms và ch ồ i 2 2 3 Nghiên c ứ u t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 2 3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2 3 1 Phƣơng pháp khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu Lan D aphyllum Qu ả lan được thu hái khi đạ t kho ả ng 10 tháng tu ổ i sau khi th ụ ph ấ n Qu ả đượ c r ử a s ạ ch b ằng nướ c xà phòng, sau đó khử trùng15%H 2 O 2 , 0,1%HgCl 2 , 20 hypochlorite - Na ( 3% NaOCl) , trong 10 phút r ồ i r ử a l ạ i nhi ề u l ầ n b ằ ng nư ớ c c ấ t vô trùng, sau đó c ắ t, r ạ ch qu ả và gieo h ạ t trên môi trư ờ ng Vacin Went (VW) + 20 g /l đư ờ ng + 100ml/l nư ớ c d ừ a + 5,5 g/l th ạ ch , pH 5,5, b ổ sung ch ấ t kích thích s inh trư ở ng Benzyladenine acid (BA) n ồ ng đ ộ dao đ ộ ng t ừ 0,1 – 3,0mg/ l Các thí nghi ệ m ti ế n hành: Thí nghi ệ m 1: Nghiên c ứ u ả nh hư ở ng c ủ a ch ấ t kh ử trùng H 2 O 2 , HgCl 2 và NaOCl, t ớ i t ỷ l ệ s ố ng vô trùng c ủ a m ẫ u c ấ y + CT1: Kh ử trùng qu ả trong H 2 O 2 15 % trong 10 phút + CT2: Kh ử trùng qu ả trong HgCl 2 0,1% trong 10 phút + CT3: Kh ử trùng qu ả trong 3%NaOCl 0,1% trong 10 phút Thí nghi ệ m trên m ẫ u qu ả v ớ i 3 công th ứ c, b ố trí 3 l ầ n l ặ p l ạ i, m ỗ i l ầ n l ặ p l ạ i trên 3 qu ả /công th ứ c Hình 2 1 Quả lan Hạc vỹ đưa vào nuôi cấy in vitro Thí nghi ệ m 2 : Ả nh hư ở ng c ủ a ch ấ t đi ề u ti ế t sinh trư ở ng BA đ ế n giai đo ạ n kh ở i đ ộ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệ u ban đ ầ u CT1(Đ/C): Nề n (VW + 20g/l đườ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5mg/l BA CT3: N ề n + 1,0mg/l BA CT4: N ề n + 1,5mg/l BA CT5: N ề n + 2,0mg/l BA Gieo h ạ t lan trên 5 công th ứ c, m ỗ i công th ứ c b ố trí trên 3 bình, 03 l ầ n l ặ p l ạ i 21 2 3 2 Phƣơng pháp nghiên cứu nhân nhanh protocorms và chồi H ạ t lan n ả y m ầ m có th ể s ả n xu ấ t ra m ộ t kh ố i t ế bào chưa phân hoá rõ ràng đư ợ c g ọ i là protocorm C ắ t các c ụ m th ể sinh ch ồ i protocorm thu đư ợ c trong môi trư ờ ng nuôi c ấ y ban đ ầ u đư ợ c chuy ể n sang môi trư ờ ng nhân nhanh ch ồ i VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5,5g/ l th ạ ch pH 5,5 và b ổ sung các ch ấ t kích thích sinh trư ở ng Benzyladenine acid (BA), Naphtyl axetic axit ( α NAA) n ồ ng đ ộ dao đ ộ ng t ừ 0,1 – 3 ,0mg/ l tùy theo m ụ c đích thí nghi ệ m Ngoài ra trong mô i trư ờ ng nuôi c ấ y còn b ổ sung h ợ p ch ấ t h ữ u cơ t ự nhiên như d ị ch nghi ề n khoai tây , táo, b ộ t t ả o Spirulina Các thí nghi ệ m ti ế n hành c ấ y vào m ỗ i bình 5 c ụ m protocorm có đườ ng kính 5mm, m ỗ i công th ứ c c ấ y 05 bình, thí nghi ệ m 03 l ầ n l ặ p l ạ i Thí nghi ệ m 3: Ảnh hưở ng c ủ a t ổ h ợ p ch ất điề u ti ết sinh trưở ng (BA + α NAA ) đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i Đề tài tìm hi ể u ảnh hưở ng c ủa Auxin đế n quá trình phát sinh ch ồ i có s ự tương tác với BA Đề tài ti ế n hành b ổ sung α NAA v ớ i các n ồ ng đ ộ khác nhau vào môi trư ờ ng là VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5,5 g/ l th ạ ch + 1,5 mg/BA, pH 5,5 (môi trư ờ ng này xác đ ị nh là môi trư ờ ng kh ở i đ ộ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệ u ban đ ầ u t ố t nh ấ t ở thí nghi ệ m 2 ), n ồ ng đ ộ α NAA thay đ ổ i là: CT1(Đ/C): Nề n (VW + 20g/l đườ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a + 1,5 mg/l BA, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5mg/l α NAA CT3: N ề n + 1,0mg/l α NAA CT4: N ề n + 1,5mg/l α NAA CT5: N ề n + 2,0mg/l α NAA Thí nghi ệ m 4 : Ả nh hư ở ng c ủ a d ị ch nghi ề n khoai tây đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg /l α NAA , pH 5,5) CT2: N ề n + 20g/ l khoai tây CT3: N ề n + 40g/l khoai tây CT4: N ề n + 60g/l khoai tây 22 CT5: N ề n + 80g/l khoai tây CT6: N ề n + 100g/lkhoai tây N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 3 Thí nghi ệ m 5: Ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ố t đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg/ l α NAA + 60g/ lkhoai tây ) CT2: N ề n + 10g/l cà rốt CT3: N ề n + 20g/l cà rốt CT4: N ề n + 30g/l cà rốt CT5: N ề n + 40g/l cà rốt CT6: N ề n + 50g/l cà rốt N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 4 Thí nghi ệ m 6: Ảnh hưở ng c ủ a t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg/ l α NAA + 60g/ l khoai tây + 30g/ l cà rốt ) CT2: N ề n + 0,5 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT3: N ề n + 1,0 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT4: N ề n + 1,5 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT5: N ề n + 2,0 g/ l b ộ t tảo Spirulina N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 5 2 3 5 Phƣơng pháp nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh Khi các ch ồi đạ t chi ề u cao kho ả ng 3-5cm v ớ i kho ả ng 3-4 lá thì chuy ể n sang giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh Ti ế n hành các thí nghi ệm xác đị nh ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưở ng IBA(0,5 – 2,0mg/l), t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh Theo dõi, đánh giá theo các chỉ tiêu như: về kh ả năng sinh trưở ng c ủ a cây, chi ề u cao trung bình (cm), s ố lá trung bình (lá/cây), s ố r ễ trung bình (r ễ /cây), sau 8 tu ầ n nuôi c ấ y Thí nghi ệ m 7: Ảnh hưở ng c ủ a IBA đế n kh ả năng t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 23 CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/l đư ờ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nư ớ c d ừ a + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5 mg/lIBA CT3: N ề n + 1,0 mg/l IBA CT4: N ề n + 1,5 mg/l IBA CT5: N ề n + 2,0 mg/lIBA Các thí nghi ệm đượ c b ố trí theo kh ố i ng ẫ u nhiên hoàn toàn, 3 l ầ n nh ắ c l ạ i Các thí nghi ệm đượ c ti ế n hành t ạ i phòng nuôi c ấ y mô Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ Điề u ki ệ n nuôi c ấ y : Nhi ệt độ phòng 25±2 0 C, ẩm độ 60-70%, th ờ i gian chi ế u sáng 16gi ờ /ngày , cường độ ánh sáng 1 500 - 2 300 lux 2 4 Phƣơng pháp xử lý số liệu - Nh ậ p và x ử lý s ố li ệu thông thườ ng b ằng chương trình Microsoft Excel - X ử lý th ố ng kê b ằng chương trình IRRISTAT 5 0 24 PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Nghiên cứu khử trùng và nuôi cấy khởi động mẫu loài lan Hạc vỹ 3 1 1 Kết quả nghiên cứu x ác định phƣơng pháp khử trùng đối với quả lan H ạ t lan r ấ t nh ỏ , có c ấ u t ạ o không hoàn ch ỉ nh, do đó muố n h ạ t n ả y m ầ m ph ả i t ạo đủ điề u ki ện dinh dưỡng và môi trườ ng Ở nhi ều nướ c trên th ế gi ới, phương th ứ c n ả y m ầ m h ạ t lan in vitro là m ộ t ph ầ n quan tr ọ ng c ủa trương trình bả o t ồ n và nhân gi ố ng các loài lan quý hi ế m, cung c ấp cây con cho chương trình ph ụ c h ồ i tái sinh r ừ ng Dutta et al , (2011) đã sử d ụ ng h ạ t c ủ a H ạ c v ỹ 15 tu ầ n tu ổi đượ c n ả y m ầ m trên môi trườ ng MS H ạ t gi ố ng hình thành protocorm sau 5 tu ầ n nuôi c ấ y Các PLBs cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m, s ố ch ồ i và r ễ nhi ều hơn trên môi trườ ng MS b ổ sung IAA + KIN Chính vì th ế , chúng tôi ti ế n hành nghiên c ứ u cách kh ử trùng qu ả lan làm ngu ồ n v ậ t li ệ u trong nhân gi ố ng in vitro các k ế t qu ả đư ợ c th ể hi ệ n t ạ i b ả ng 3 1 Bảng 3 1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống và n ảy mầm của lan Hạc vỹ Ch ỉ tiêu theo dõi Công th ứ c thí nghi ệ m T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng và phát sinh protocorm (%) T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng và phát sinh ch ồ i (%) CT1 Kh ử trùng qu ả trong H 2 O 2 15 % trong 10 phút 95 5 CT2 Kh ử trùng qu ả trong HgCl 2 0,1% trong 10 phút 96 4 CT3 Kh ử trùng qu ả trong 3%NaOCl 0,1% trong 10 phú t 9 8 2 T ừ k ế t qu ả thu đư ợ c cho chúng tôi th ấ y: Sau 4 tu ầ n gieo h ạ t ở c ả 03 công th ứ c thí nghi ệ m đ ề u cho t ỷ l ệ n ẩ y m ầ m cao đ ạ t 100% Tuy nhiên, chúng tôi l ự a ch ọ n công th ứ c 3 đ ể kh ử trùng m ẫ u qu ả c ủ a loài lan r ừ ng này, b ở i công th ứ c 3 ít t ố n kém, ít đ ộ c h ạ i 25 Sau khi gieo h ạ t, có 9 8 % h ạ t phát sinh th ể s inh ch ồ i (protocorm ), 2 % n ả y c ụ m ch ồ i trên môi trư ờ ng cơ b ả n (N ề n VW + 20g/l đư ờ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nư ớ c d ừ a , pH 5,5) Hình 3 1 Sự nảy mầm của hạt lan Hạc vỹ 3 1 2 Ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng BA đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầu BA là m ộ t ch ất điề u ti ết sinh trưở ng nhân t ạ o thu ộ c nhóm Cytokinin, là nhóm đượ c s ử d ụ ng r ộ ng rãi nh ấ t trong k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y mô hi ệ n nay Tác d ụ ng ch ủ y ế u c ủ a nó là kích thích s ự phân chia t ế bào, thúc đẩ y s ự ho ạt độ ng c ủ a ch ồ i bên N ồng độ s ử d ụng khác nhau tùy đối tượ ng th ự c v ậ t nuôi c ấ y, các k ế t qu ả nghiên c ứ u cho th ấ y: ở n ồng độ 22μM thích h ợ p v ớ i s ự phát tri ể n ch ồ i ở Cymbidium aloifolium , nhưng đố i v ớ i D aphyllum và D moschatum n ồng độ thích h ợ p nh ấ t cho s ự phát tri ế n c ủ a ch ồ i l ạ i là 44μM (N R Nayak et al , 1997) Để tìm n ồng độ phù h ợ p c ủ a BA đế n giai đoạ n kh ởi độ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệu ban đầ u cho cây lan H ạ c v ỹ , trong thí nghi ệ m này chúng tôi b ố trí 5 n ồ n g độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0mg/l Sau 4 tu ầ n nuôi c ấ y k ế t qu ả đượ c trình bày ở b ả ng 3 2 Qua k ế t qu ả thu đư ợ c ở b ả ng 3 2 cho th ấ y: h ệ s ố nhân protocorm đ ạ t cao nh ấ t ở n ồ ng đ ộ 1,5 mg/ l BA đ ạ t 3,9 l ầ n, s ố ch ồ i 4, 20 l ầ n Trong khi đó ở công th ứ c không b ổ sung (Đ/C) có h ệ s ố nhân protocorm đ ạ t th ấ p nh ấ t là 2, 3 0 l ầ n, s ố ch ồ i 1,4 0 l ầ n Đố i v ớ i ch ỉ tiêu chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồ i cho th ấ y: T ấ t c ả các công th ứ c có b ổ sung BA đề u cho k ế t qu ả cao hơn công thứ c không b ổ sung BA vào môi trườ ng nuôi c ấ y Chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồi dao độ ng t ừ 1,20 cm đế n 2,43cm Trong 26 đó: Ở n ồng độ 1,5 – 2,0 mg/l có chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồi đạ t cao nh ấ t là 2,31 – 2,43cm; công th ức (Đ/C) không bổ sung BA có chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồ i th ấ p nh ấ t là 0,30cm Ở n ồng độ BA t ừ 1,5 đế n 2,0 mg/l ch ồ i m ậ p, lá xanh th ẫ m Bảng 3 2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu Nồng độ BA (mg/l ) Hệ số nhân protocorm (lần) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) 0 (Đ/C) 2, 3 0 1,4 0 0,3 0 0,5 2, 80 2, 2 0 1, 20 1,0 3, 2 0 2, 40 1,8 5 1,5 3 , 9 0 4, 20 2,4 3 2,0 3 , 1 0 3,4 0 2,3 1 CV(%) 4,3 4,7 3,0 LSD 0,05 0,24 0,57 0,70 Ghi chú : Đ/C: Nền môi trườ ng VW + 20g/l đườ ng + 5,5 g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a , pH 5,5 Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA vượ t quá 2,0mg/l ch ất lượ ng ch ồ i có xu hướ ng gi ả m, ch ồ i g ầ y, lá xanh nh ạ t và b ị d ị d ạ ng (lo ạ i kém) T ừ ph