BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 - Full 10 điểm

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10 15625/vap 2020 00083 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA ( Pangasianodon hypophthalmus ) Trần Thị Phương Dung * , Nguyễn Hồ Phương Uyên Tóm tắt : Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá Tra giống (45 - 50 g) khi nhiễm vi khuẩn Edwarsiella ictaluri sau 2 - 4 tuần Vi khuẩn Edwarsiella ictaluri là tác nhân gây chết cá Tra giống c hiếm tỉ lệ 51,2% Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p < 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu thoái hóa C ác loại bạch cầu lympho, bạch cầu mono hay bạch cầu trung tính đều biến động theo hướng giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 ) Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe Từ khóa: Edwardsiella ictaluri , Panga sianodon hypophthalmus , huyết học, miễn dịch 1 MỞ ĐẦU Cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus ) là m ộ t trong những loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao được nuôi phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long ( ĐBSCL ) (Phan v à nnk , 2009 ) Theo thống kê từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP) , trong 9 tháng đ ầ u năm 2018 kim ngạch xuất khẩu cá Tra đến 127 quốc gia trên thế giới đạt 1,6 tỉ USD, tăng 24% so với cùng kỳ năm 2017 Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá Tra đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định và việc thâm canh hóa với mật đ ộ nuôi cao đã làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Le & Cheong, 2010) B ệnh phổ biến và nguy hiểm trê n cá Tra gi ố ng ở ĐBSCL từ năm 2007 là bệnh mủ gan ( chiếm 51,2%) ( Lý Thị Thanh Loan, 2008) Hiện nay, các nghiên c ứ u về vaccine nhằm tăng cường kh ả năng đ ề kh á ng cao, góp phần thúc đẩy nghề nuôi th ủ y s ả n bền vững và hiệu quả hơn về kinh tế cũng như môi trường N hiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lí , sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được công bố trên các đối tượng cá Tra với các kích cỡ khác nhau làm nền tảng cho việc tạo vaccine Tuy nhiên , thông tin về sự biến đổi các chỉ số huyết học và khả năng miễn dịch của cá Tra bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri giai đoạn cá giống (45 - 50 g) rất ít và rời rạc Nghiên cứu này nhằm đánh giá tổng quát sự biến động các t ế bào máu và kháng thể đặc hiệu bảo vệ cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus) chống lại vi khuẩn E ictaluri khi nhiễm bệnh ngoài tự nhiên V ì vậy , nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học và khả năng tiêu diệt vi khuẩn huyết thanh của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai Trư ờ ng Đ ạ i h ọ c Sư ph ạ m Thành ph ố H ồ Chí Minh * Email: dungttp@hc mue edu vn PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 671 đoạn cá giống từ 45 - 50 g trong thời gian mắc bệnh dài từ 2 - 4 tuần được thực hiện góp phần cung cấp thêm thông tin làm cơ sở cho việc chẩn đo án và phòng bệnh bệnh mủ ga n một cách đầy đủ hơn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu Cá Tra giống ( Pangasianodon hypophthalmus ) có kích cỡ khoảng 45 - 50 g/con C á được nuôi ổn định 3 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm để cho cá quen với điều kiện sống trong bể Cá đư ợ c nuôi trong môi t rường nước pH=7 - 7, 5, nhiệt độ duy trì ở mức nhiệt độ phòng tương ứng nhiệt độ nước 27 - 28 o C Cá được cho ăn thức ăn công nghiệp 3 lần/ngày vào lúc 7 h, 12 h, 17 h Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh hoạ t và da sáng bóng Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với 3 nghiệm thức (NT) : (i) NT 1 cá tiêm nước muối sinh lí ; (ii) NT 2 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 10 4 CFU/mL ; (iii) NT 3 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 10 5 CFU/mL Mỗi NT 15 con (lặp lại 3 lần) Thu mẫu máu 15 cá thể /NT qua 3 thời điểm: (i) Lần 1: t rước cảm nhiễm; (ii) Lần 2: s au khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 2 tuần; (iii) Lần 3: s au khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 4 tuần 2 2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nhuộm vi khuẩn g ram âm mẫu phết mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014) : phết mẫu mô chứa vi khuẩn lên lam, cố định bằng đèn cồn, sau đó cho lần lượt các dung dịch Crustal violet (30 giây), lugon (60 giây), ethanol (15 - 30 giây), s afranin (60 - 80 giây) Tại mỗi bướ c đều rửa bằng nước cất 5 giây Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40) Phương pháp nhuộm HE mẫu mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014) : cố định mẫu bằng formalin 10% Sau đó cắt tỉa mẫu, khử nước, làm trong mẫu và ngấm paraffin Sau đó tiến hành đúc khối mẫu, cắt mẫu Nhuộm mẫu bằng Mayer’s Hematoxylin và Eosin (HE) Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40) Phương pháp định lượng số lượng hồng cầu Phương pháp được mô tả bởi Natt & Herrick (1952) có hiệu chỉnh : l ấy máu cá từ động mạch ch ủ đuôi bằng kim tiêm 1 mL tiệt trùng Dùng ống hút pha loãng hồng cầu hút máu lên đúng vạch 0,5 Đưa đầu ống pha loãng vào dung dịch pha loãng hồng cầu (Hayems) , hút từ từ đến vạch 101, vừa hút vừa xoay nhẹ ống pha loãng Ngừng hút khi đ ến vạch 101, rút ống pha loãng ra khỏi dung dịch pha loãng, đặt ngón trỏ vào đầu của ống pha loãng, tháo dây hút ra Lắc ống pha loãng trong 3 phút Bỏ 3 - 4 giọt đầu, lau khô đầu ống pha loãng, Cho hỗn hợp dung dịch lan tỏa vào đầy buồng đếm , để yên trong 2 phút Đếm hồng cầu 4 ô lớn (1 ô lớn có 16 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm Công thức tính mật độ hồng cầu: N1 = A x (4000 : 80) x 200 = A x 10000 (số hồng cầu đếm được trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) là A) 672 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Phương pháp định lượng số lư ợng bạch cầu tổng Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al , ( 2000) như sau: n hỏ một giọt máu cách đầu lam kính 1 cm Một tay giữ lam kính, tay còn lại cầm lam kéo, nghiêng 45 o tiếp xúc cạnh ngắn vào giọt máu để cho máu lan tỏa theo cạnh này, khi giọt máu đã được chia đều, đẩy nhanh và đều lam kéo theo chiều dài của lam nằm ngang Cố định tiêu bản bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30 o , tay phải cầm pipet nhỏ 3 - 4 giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản, nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu Nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm Giem sa phủ kín diện tích máu, để 15 - 20 phút sau đó rửa tiêu bản Đếm tổng số 1 500 tế bào hồng cầu và bạch cầu trên mẫu nhuộm TBC = (Số bạch cầu trong 1 500 tế bào × R) / Số hồng cầu trong 1 500 tế bào ( TBC là số lượng bạch cầu trong 1 mm 3 máu R là số lượng hồng cầu trong 1 mm 3 máu Phương pháp định lượng số lượng từng loại bạch cầu Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al , ( 2000) : đ ếm tổng số bạch cầu bằng 100 tế bào M ật độ từng loại bạch cầu (tb/mm 3 ) = (số lượng mỗi loại BC × mật độ TBC)/100 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Phương pháp được mô tả bởi Từ Thanh Dung và nnk ( 2013 ) như sau: Dùn g kim tiêm 1 mL để lấy máu và cho vào ống eppendorf 1,5 mL , để yên và giữ lạnh ở 4 o C trong vòng 2 - 3 giờ Tiến hành li tâm 6 000 vòng/phút trong 5 phút Sau khi li tâm, lấy phần huyết thanh cho vào ống eppendorf sạch và tiến hành xác định hiệu giá kháng thể hoặc trữ lạnh ( - 20 o C) Vi khuẩn E ictaluri được bất hoạt bằng formol 2% và giữ trong ngăn mát tủ lạnh 24 giờ Sau đó, du ng dịch vi khuẩn được li tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút để rửa sạch formol bằng nước muối sinh lí tiệt trùng, thao tác được lặp lại 2 - 3 lần Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác định bằng phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng Cho 25 μL huyết thanh vào giếng số 1 và 2 Từ giếng số 2 trở đi cho vào mỗi giếng 25 μL nước muối sinh lí Trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lí ở giếng 1, hút 25 μL chuyển sang giếng số 2 rồi trộn đều, tiếp tục hút 25 μL ở giếng số 2 chuyển sang giếng 3 rồi trộn đều Tiếp tục làm như vậy cho đến giếng cuối cùng (ở giếng 12 lấy ra 25 μL bỏ đi) Cho 25 μL kháng nguyên (vi khuẩn E ictaluri bị bất hoạt) vào mỗi giếng rồi trộn đều Để yên 4 - 5 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả Dương tính (+) : đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rộng Âm tính ( - ) : ở đáy giếng chỉ có một chấm tròn nhỏ màu trắng 2 3 Xử lí số liệu S ố liệu được xử lí dựa trên một nhân tố bằng cách sử dụng phần mềm MS Excel nhập và xử lí số liệu Các s ố liệu trung bình được trình bày ở dạng TB ± SD Phân tích thống kê bằng phương sai một yếu tố mẫu đo lường có lặp lại ( ONE WAY ANOVA) Sử dụng kiểm định so sánh đối chiếu Duncan được dùng để so sánh sự khác biệt giữa các mức của yếu tố thí nghiệm Mức xác suất p < 0,05 được chấp nhận như tiêu chuẩn đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Tất cả các phân tích thống kê đư ợc thực hiện bằng phần mềm I BM SPSS Statistics version 22 0 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 673 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n hình thái n ộ i quan và mô h ọ c c ủ a cá Tra Các đặc điểm về hình thái nội quan và mô học cá Tra nhiễm vi khuẩn E ictaluri qua nghiên cứu này trên cá Tra giống giai đoạn 45 - 50 g cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào các nội quan sau 12 h cảm nhiễm; khi bị xâm bởi nhiễm vi khuẩn E ictaluri thì các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng xuất hiện các biểu hiện đặc trưng cho bệnh mủ gan nh ư xung huyết, xuất huyết, xuất hiện đốm trắng mủ từ 1 - 3 mm sau 3 ngày gây nhiễ m và hoại tử các nội quan khi quan sát mô học khi nhuộm HE dưới kính hiển vi (Hình 1) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Suanyuk et al , (2013) và Soto (2012) với các bệnh tích điển hình do vi khuẩn Edwarsiella ictaluri Hình 1 a N ộ i quan cá v ớ i nhi ề u đ ố m tr ắ ng; b Vi khu ẩ n xâm nh ậ p vào mô cá sau 12 h (nhu ộ m Gram âm v ệ t ph ế t m ẫ u mô); c T ổ n thương xu ấ t huy ế t và ngh ẽ n c ầ u th ậ n trên mô th ậ n sau 72 h (nhu ộ m HE); d T ổ n thương xu ấ t huy ế t trên mô gan sau 72 h (X40) (nhu ộ m HE) 3 2 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u c ủ a cá Tra Bên cạnh hồng cầu trưởng thành với hình dạng bình thường với cấu trúc hình cầu , ở những bể cá được cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trong đợt thu mẫu lần 2 và 3 còn ghi nhận được sự xuất hiện của nhiều dạng hồng cầu bất thường như hồng cầu khôn g nhân và hồng cầu bị thoái hóa (Hình 2) Hình 2 a Vi khu ẩ n bao quanh HC sau 6 h c ả m nhi ễ m; b HC m ấ t nhân sau 2 tu ầ n c ả m nhi ễ m; c HC thoái hóa sau 2 tu ầ n c ả m nhi ễ m (X40) b c d a b a c 674 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Trong những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk (2011 ) cũng ghi nhận được sự xuất hiện của các dạng hồng cầu bất thường ở đối tượng cá Tra bị nhiễm bệnh B ả ng 1 S ự bi ế n đ ộ ng s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u (x10 6 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát Th ờ i gian Đ ố i ch ứ ng NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 2,071 ± 0,134 xa 2,057 ± 0,113 xa 2,099 ± 0,123 xa L ầ n 2 2,103 ± 0,124 xa 1,279 ± 0,089 yb 1,284 ± 0,090 yb L ầ n 3 2,131 ± 0,129 xa 1,310 ± 0,068 yb 1,301 ± 0,075 yb Các ch ữ cái x, y trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái a, b trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 T ừ k ế t qu ả đ ị nh lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở B ả ng 1 có th ể nh ậ n th ấ y: (1) s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở NT đ ố i ch ứ ng qua các l ầ n thu m ẫ u không có s ự khác bi ệ t có ý nghĩ a th ố ng kê (p > 0,05) ch ứ ng t ỏ trong su ố t th ờ i gian ti ế n hành thí nghi ệ m không có s ự ả nh hư ở ng c ủ a các tác nhân ngo ạ i c ả nh làm thay đ ổ i các ch ỉ s ố huy ế t h ọ c; (2) cá sau khi c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri ở c ả hai NT 10 4 và 10 5 CFU/m đ ề u có s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u thu ở l ầ n 2 , l ầ n 3 gi ả m có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) so v ớ i l ầ n 1 trư ớ c khi c ả m nhi ễ m và so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng Nguyên nhân là do vi khu ẩ n xâm nh ậ p vào xung quanh h ồ ng c ầ u và gây v ỡ h ồ ng c ầ u sau 24 gi ờ sau gây nhi ễ m (Quách Văn Cao Thi, 2017) S ự bi ế n đ ộ n g s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u theo chi ề u hư ớ ng gi ả m ở l ầ n thu m ẫ u th ứ 2 và 3 ở NT 2 và NT3 cũng phù h ợ p v ớ i m ộ t s ố nghiên c ứ u khác, như Nguy ễ n Th ị Thúy Li ễ u và nnk (2011 ) khi phân tích các thông s ố huy ế t h ọ c ở cá Tra nuôi b ị b ệ nh m ủ gan đã xác đ ị nh s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở cá b ệ nh ch ỉ còn 0,75x10 6 TB/mm 3 , gi ả m 63,4% so v ớ i cá kh ỏ e 3 3 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n t ổ ng s ố lư ợ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra B ả ng 2 S ự bi ế n đ ộ ng s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u (x10 4 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát Th ờ i gian Đ ố i ch ứ ng NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 13,773 ± 2,815 xa 13,046 ± 2,350 xa 12,633 ± 2,431 xa L ầ n 2 13,146 ± 2,780 xa 4,889 ± 1,091 yb 4,855 ± 1,021 yb L ầ n 3 13,040 ± 2,508 xa 8,138 ± 1,175 zb 7,835 ± 1,218 zb Các ch ữ cái x, y, z trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái a, b trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 T ừ B ả ng 2 cho th ấ y: (i) k ế t qu ả đ ị nh lư ợ ng t ổ ng BC c ủ a cá kh ỏ e trư ớ c khi thí nghi ệ m c ủ a các NT không có s ự khác bi ệ t (p > 0, 05) và đ ạ t giá tr ị trung bình là (13,773 ± 2,815)x10 4 TB/mm 3 đ ố i v ớ i NT đ ố i ch ứ ng , NT1 và NT2 l ầ n lư ợ t là (13,046 ± 2,350)x10 4 TB/mm 3 và (12,633 ± 2,431)x10 4 TB/mm 3 ; (ii) s ố lư ợ ng t ổ ng BC ở NT đ ố i ch ứ ng qua c ả 3 l ầ n thu m ẫ u đ ề u không có s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p > 0,05) ch ứ ng t ỏ trong su ố t th ờ i gian ti ế n hành thí nghi ệ m, s ự bi ế n đ ộ ng c ủ a s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u không ch ị u ả nh hư ở ng c ủ a các tác nhân n go ạ i c ả nh; (iii) ở các NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, lư ợ ng PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 675 t ổ ng b ạ ch c ầ u đ ề u gi ả m ở l ầ n 2 và b ắ t đ ầ u tăng tr ở l ạ i vào l ầ n 3 v ớ i s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) và t ổ ng BC ở NT2 và NT3 qua l ầ n l ấ y m ẫ u 2 và 3 đ ề u th ấ p hơn NT1 đ ố i ch ứ ng K ế t qu ả này phù h ợ p nghiên c ứ u Benli & Yildiz (2004) khi c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n trên cá đã k ế t lu ậ n r ằ ng kho ả ng vài ngày đ ầ u sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, t ổ ng lư ợ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá s ẽ tăng cao đ ể ch ố ng l ạ i s ự xâm nh ậ p và t ấ n công c ủ a vi khu ẩ n Bên c ạ nh đó, m ộ t s ố ngh iên c ứ u g ầ n đây cũng đã ghi nh ậ n r ằ ng s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u ở cá b ệ nh khi thu m ẫ u ở nh ữ ng giai đo ạ n khác nhau s ẽ có s ự bi ế n đ ộ ng khác nhau Ngoài ra, nghiên c ứ u c ủ a T ừ Thanh Dung (2010) k ế t lu ậ n r ằ ng m ậ t đ ộ t ổ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra có s ự thay đ ổ i rõ r ệ t tùy thu ộ c vào m ứ c đ ộ nhi ễ m b ệ nh c ủ a cá D ự a trên nh ữ ng cơ s ở và nghiên c ứ u trên, có th ể d ự đoán s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra ngay sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri có tăng so v ớ i cá kh ỏ e đ ể ch ố ng l ạ i s ự xâm nhi ễ m và t ấ n công c ủ a vi khu ẩ n, nh ằ m b ả o v ệ cơ th ể Tuy nhiên ở th ờ i đi ể m thu m ẫ u l ầ n 2, s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u có s ự suy gi ả m m ạ nh có th ể gi ả i thích do chính s ự tác đ ộ ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri lên c ấ u trúc mô c ủ a m ộ t s ố cơ quan, đ ặ c bi ệ t là th ậ n trư ớ c và t ỳ t ạ ng trong m ộ t th ờ i gian dài t ừ đó làm bi ế n đ ổ i c ấ u trúc và suy gi ả m ch ứ c năng t ạ o máu c ủ a nh ữ ng cơ quan này (Brason, 1993) Theo nghiên c ứ u v ề đ ặ c đi ể m mô b ệ nh h ọ c c ủ a cá Tra b ị b ệ nh m ủ gan c ủ a Quách Văn Cao Thi (2017 ), ở ngày th ứ 2 sau khi c ả m nhi ễ m quan sát mô th ậ n c ủ a cá th ấ y đã b ắ t đ ầ u xu ấ t hi ệ n hi ệ n tư ợ ng xung huy ế t, xu ấ t huy ế t d ẫ n đ ế n th ậ n m ấ t đi nh ữ ng ch ứ c năng quan tr ọ ng và làm suy gi ả m ch ứ c năng t ạ o h ồ ng c ầ u, b ạ ch c ầ u, không còn kh ả năng t ạ o kháng th ể và th ự c bào Đây chính là nh ữ ng nguyên nhân làm cho s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u và t ổ ng b ạ ch c ầ u trong hai NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri đ ề u gi ả m đáng k ể ở l ầ n thu m ẫ u sau hai tu ầ n c ả m nhi ễ m Tuy nhiên, ở l ầ n thu m ẫ u sau b ố n tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u và b ạ ch c ầ u đ ề u có s ự tăng nh ẹ so v ớ i l ầ n thu m ẫ u trư ớ c có th ể gi ả i thích do vai trò đáp ứ ng mi ễ n d ị ch t ạ o kháng th ể nguyên phát (Đ ặ ng Th ị Hoàng Oanh và Đoàn Nh ậ t Phương , 2007) 3 4 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n s ố lư ợ ng các lo ạ i b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra Trong quá trình phân tích đ ị nh lo ạ i và đ ị nh lư ợ ng t ế bào b ạ ch c ầ u, đã ghi nh ậ n đư ợ c s ự xu ấ t hi ệ n c ủ a các lo ạ i b ạ ch c ầ u như: b ạ ch c ầ u lympho, b ạ ch c ầ u đơn nhân, b ạ ch c ầ u trung tính, không quan sát đư ợ c b ạ ch c ầ u ưa bazơ , b ạ ch c ầ u ưa axit r ấ t hi ế m g ặ p nên không th ể đ ị nh lư ợ ng (Hình 3) Hình 3 a BC Lympho; b BC mono; c BC trung tính (mũi tên) (X40) b a c 676 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Nghiên c ứ u v ề s ự bi ế n đ ộ ng c ủ a các y ế u t ố mi ễ n d ị ch không đ ặ c hi ệ u trên cá Tra nuôi nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri c ủ a Nguy ễ n Th ị Thúy Li ễ u và nnk (2011 ) cũng cho k ế t qu ả không quan sát đư ợ c b ạ ch c ầ u ưa axit và b ạ ch c ầ u ưa bazơ 3 5 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n t ỉ l ệ các lo ạ i b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra B ả ng 3 S ự bi ế n đ ộ ng t ỉ l ệ các l ọ ai b ạ ch c ầ u (x10 6 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát NT B ạ ch c ầ u Đ Ố I CH Ứ NG NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 Lympho 11,164 ± 2,322 xa 10,799 ± 2,633 xa 10,619 ± 2,135 xa 10,539 ± 1,829 xa 3,181 ± 0,775 yb 5,399 ± 0,721 zb 10,394 ± 2,208 xa 3,511 ± 0,684 yb 5,670 ± 0,926 zb Neutro 1,253 ± 0,435 xa 1,079 ± 0,286 xa 1,048 ± 0,338 xa 1,145 ± 0,480 xa 0,748 ± 0,261 yb 1,157 ± 0,491 xa 1,043 ± 0,387 xa 0,586 ± 0,231 yb 0,964 ± 0,246 xa Mono 1,323 ± 0,370 xa 1,269 ± 0,348 xa 1,331 ± 0,291 xa 1,365 ± 0,357 xa 0,958 ± 0,217 yb 1,581 ± 0,290 xb 1,189 ± 0,248 xa 0,755 ± 0,199 yb 1,201 ± 0,188 xa Các ch ữ cái a, b,c, trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái x,y trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 D ự a vào k ế t qu ả s ố lư ợ ng t ừ ng lo ạ i BC phân tích ở B ả ng 3, nhìn chung các lo ạ i BC lympho, BC mono hay BC trung tính đ ề u bi ế n đ ộ ng theo hư ớ ng gi ả m ở th ờ i đi ể m sau hai tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n nhưng tăng tr ở l ạ i sau b ố n tu ầ n T rong 2 NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng , t ỉ l ệ các lo ạ i BC l ạ i có s ự bi ế n đ ộ ng gi ả m sau 2 tu ầ n và vào th ờ i đi ể m b ố n tu ầ n có s ự b ắ t đ ầ u tăng l ạ i c ủ a các lo ạ i b ạ ch c ầ u S ự thay đ ổ i t ỉ l ệ các lo ạ i BC trư ớ c và sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri có th ể đư ợ c gi ả i thí ch do BC neutro có vai trò trong ph ả n ứ ng viêm, là lo ạ i BC đ ầ u tiên đ ế n v ị trí vi khu ẩ n xâm nh ậ p v ớ i s ố lư ợ ng l ớ n, ngoài ra còn có kh ả năng th ự c bào Do đó s ự tăng nh ẹ t ỉ l ệ BC trung tính cho th ấ y t ạ i th ờ i đi ể m thu m ẫ u sau hai tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n ho ạ t đ ộ ng c ủ a h ệ b ạ ch huy ế t đang đư ợ c gia tăng đ ể tiêu di ệ t các vi sinh v ậ t l ạ xâm nh ậ p vào cơ th ể BC mono là t ế bào tham gia vào h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch không đ ặ c hi ệ u v ớ i vai trò th ự c bào tiêu di ệ t vi khu ẩ n và đ ặ c bi ệ t là kh ả năng trình di ệ n kháng nguyên đ ể th ự c hi ệ n bư ớ c kh ở i đ ầ u c ủ a quá trình đáp ứ ng mi ễ n d ị ch đ ặ c hi ệ u Sau hai tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, t ỉ l ệ BC mono có gia tăng nh ẹ nh ằ m giúp h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch nh ậ n b i ế t đư ợ c kháng nguyên, s ả n xu ấ t kháng th ể chuyên bi ệ t M ặ t khác, BC lympho có vai trò quan tr ọ ng trong mi ễ n d ị ch d ị ch th ể và mi ễ n d ị ch t ế bào nên s ự gi ả m nh ẹ t ỉ l ệ BC lympho có th ể do s ự xâm nhi ễ m c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri vào cơ th ể cá làm suy gi ả m h ệ mi ễ n d ị ch và tình tr ạ ng này kéo dài trong hai tu ầ n gây ra hi ệ n tư ợ ng đó Sau 4 tu ầ n vi khu ẩ n b ị suy y ế u nên các lo ạ i b ạ ch c ầ u tăng đ ể s ả n xu ấ t kháng th ể tham gia đáp ứ ng mi ễ n d ị ch K ế t qu ả này phù h ợ p v ớ i hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20 - 30 sau khi tiêm kháng nguyên ( Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương , 2007) PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 677 3 6 Xác đ ị nh hi ệ u giá kháng th ể c ủ a cá Tra sau b ố n tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri Kháng th ể huy ế t thanh thư ờ ng xu ấ t hi ệ n ngay trư ớ c th ờ i đi ể m s ố lư ợ ng tương bào đ ạ t c ự c đ ạ i kho ả ng ngày th ứ 10 - 15 và hàm lư ợ ng kháng th ể tăng lên mãnh li ệ t đ ể đ ạ t c ự c đ ạ i kho ả ng ngày th ứ 20 - 30 sau khi tiêm kháng nguyên (Đ ặ ng Hoàng Oanh và Đoàn Nh ậ t Phương , 2007) D ự a trên cơ s ở đó thí nghi ệ m gây đáp ứ ng mi ễ n d ị ch cho cá Tra đư ợ c th ự c hi ệ n ở th ờ i đi ể m sau b ố n tu ầ n k ể t ừ ngày c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri cho cá đ ể đ ả m b ả o hi ệ u giá kháng th ể thu đư ợ c đ ạ t c ự c đ ạ i Hình 4 Bi ế n đ ộ ng hi ệ u giá kháng th ể c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri (CFU/ml) kh ả o sát K ế t qu ả phân tích hi ệ u giá kháng th ể cho th ấ y có s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) gi ữ a các NT sau b ố n tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri C ụ th ể , hi ệ u giá kháng th ể trung bình c ủ a cá ở NT đ ố i ch ứ ng có giá tr ị là 0,27 ± 0,57, ch ứ ng t ỏ h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch ở nhóm cá đ ố i ch ứ ng chưa đư ợ c kích thích nên lư ợ ng kháng th ể r ấ t th ấ p Ở các NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình tăn g rõ r ệ t so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng, c ụ th ể , ở NT1 cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri m ậ t đ ộ 10 4 CFU/mL thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình ghi nh ậ n đư ợ c là 1,8 ± 0,83, cao g ấ p 6,7 l ầ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng Ở NT2 cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri m ậ t đ ộ 10 5 CFU/mL thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình ghi nh ậ n đư ợ c là 2,47 ± 0,72, cao g ấ p 1,4 l ầ n so v ớ i NT1 và g ấ p 9,15 l ầ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng và s ự sai khác hi ệ u giá kháng th ể ở c ả ba NT đ ề u có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05 ) K ế t qu ả trên còn cho th ấ y hi ệ u giá khán g th ể trung bình tăng t ỉ l ệ theo m ậ t đ ộ vi khu ẩ n c ả m nhi ễ m cho cá K ế t qu ả này cũng phù h ợ p v ớ i nghiên c ứ u c ủ a Bùi Quang T ề (2004), m ứ c đ ộ s ả n xu ấ t kháng th ể trong đáp ứ ng mi ễ n d ị ch nguyên phát có tương quan thu ậ n v ớ i li ề u lư ợ ng kháng nguyên đưa vào cơ th ể Vì v ậ y, trên cá T ra trong 3 NT kh ả o sát thì NT tiêm vi khu ẩ n m ậ t đ ộ 10 5 CFU/mL thì t ạ o kháng th ể t ố t nh ấ t cho vi ệ c đáp ứ ng mi ễ n d ị ch trong 4 tu ầ n trên cá giai đo ạ n 45 - 50 g 4 K Ế T LU Ậ N Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p< 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu 0 27 1 8 2 47 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 Đối chứng NT1 NT2 Hiệu giá kháng thể Mật độ vi khuẩn E ictaluri (CFU/ml) khảo sát Hiệu giá kháng thể 678 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM thoái hóa Các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến động theo hướng giả m ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 ) Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu khác khi tiêm vaccine cho cá ở dải nồng độ rộng hơn và khảo sát trong khoảng thời gian dưới 2 tuần vì qua hai tuần các tế bào bạch cầu bắt đầu giảm làm giảm khả năng miển dịch trên cá Tra giai đoạn 46 - 50 g Tuy nhiên, việc tạo và duy trì kháng thể trong 4 tuần khi cá được tiêm vi khuẩn rất có ý nghĩa trong việc tạ o vaccine giúp cho việc tăng khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cá TÀI LIỆU THAM KHẢO Benli A C K , H Y Yildiz, 2004 Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L ) spontaneously infected with Ewardsiella tarda Short communication, Aquaculture Research, pp 1388 - 1390 Branson E , 1993 Basic anatomy and physiology Abbott Laboratories, North Chicago, USA, 447pp Từ Thanh Dung, Trần Hoa Cúc, Nguyễn Hoàng Nhật Uyên, Mã Lê Diễm Trang, 2013 Khả năng đáp ứng miễn dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại Edwardsiella ictaluri Tạ p chí khoa học Đại học Cần Thơ, 26 (2013): 269 - 276 Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Ngu yễn Anh Tuấn, 2012 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) và giải pháp phòng trị Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, trang 136 - 145 Ferguson H W , J F Turnbull, A Shin, K Thompson, T T Dung, M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage), from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 24: 509 - 513 Hrubec T C , J L Cardinale, S A Smith, 2000 Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured Tilap ia (Oreochromis hybrid ) Vet Clin Pathol , 29:7 - 12 Le T C , Cheong F , 2010 Perceptions of risk and risk management in Vietnamese catfish farming: An empirical study Aquaculture Economics and Management, 14: 282 - 314 Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bí ch Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011 Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao bị bệnh mũ gan Khoa Th ủy sản, Đại học Cần Thơ, 17a: 20 - 29 Lí Thị Thanh Loan, 2008 Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường x uyên “Quan trắc, cảnh báo môi trường và dịch bệnh thủy sản một số vùng nuôi thủy sản các tỉnh đ ồ ng bằng sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 Natt M P , Herrick C A , 1952 A new blood diluent for counting erythrocytes and leukocytes of the chicken Poult Sci , 31: 735 - 738 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, 2007 Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản Nxb Trường Đại học Cần Thơ Phan L T , Tam B M , Thuy N T T , Gooley G J , Ingram B A , H ao N V , Phuong N T , De Silva S S , 2009 Current status of farming practices of striped catifish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296: 227 - 236 Soto E , 2012 Edwardsiella ictaluri as the Causative Agent of Mort ality in Cultured Nile Tilapia Journal of Aquatic Animal Health, 24(2): 81 - 90 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 679 Suanyuk N , Rogge M , Thune R , Watthanaphiromsakul M , Champhat N , Wiangkum, W , 2013 Mortality and pathology of hybrid catfish, Clarias macrocephalus (Günther) × Clarias gariepinus (Burchell), associated with Edwardsiella ictaluri infection in sou thern Thailand J Fish Dis , 37(4): 385 - 95 Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sả n Viện nghiên cứu N uôi trồng thủy sản I Quách Văn Cao Thi, 2017 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học v à cơ chế đa khá ng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và A eromonas hydrophila gây bệnh trên cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus ) nuôi t hâm canh ở đồng bằng sông Cửu L ong Luận án tiến sĩ Chuyên ngành vi sinh vật, Đại Học Cần Thơ Lưu Thị T ha nh Trúc, 2014 Thực hành chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản N xb Nông n ghiệp STUD Y ING THE EFFECTIVENESS OF Edwardsiella ictaluri Bacteria ON HEMATO LOGICAL INDICATORS OF STRIPED CATFISH ( Pangasianodon hypophthalmus ) Tran Thi Phuong Dung * , Nguyen Ho Phuong Uyen Abtracts : This study aimed to evaluate the difference s in haematological parameters and ability to kill bacteria using serum from fish (45 - 50 g) infected by Edwardsiella ictaluri bacteria at 2 - 3 weeks Edwarsiella ictaluri bacteria accounts for 51 2% of Tra catfish deaths Results from haematological analysis revealed a significant reduction ( p < 0 05) in the total number of red blood cell s, t he presence of non - nuclear red cells and degraded red blood cells in infected fish Both mono and neutral lymphocytes fluctuated for two weeks after the fish became infected, but generally trended downward However, lymphocyte levels significantly increased again after 4 weeks The ability to kill bacteria in the serum of diseased fish was higher than in healthy fish Keywords: Edwardsiella ictaluri , Pangasianodon hypophthalmus , haematology, immune response Ho Chi Minh City University of Education * Email: dungttp@hcmue edu vn