Đang tải... (xem toàn văn)
Trang 2 BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINHKHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM----o0o----TÊN ĐỀ TÀIĐịnh Lượng Coliform Bằng Phương Pháp Màng LọcNhóm: 12 GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN
BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM o0o TIỂU LUẬN HỌC PHẦN ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC NHĨM: 12 Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM o0o TÊN ĐỀ TÀI Định Lượng Coliform Bằng Phương Pháp Màng Lọc Nhóm: 12 GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Chúng em xin cam đoan đề tài tiểu luận: Định lượng coliform phương pháp màng lọc nhóm nghiên cứu thực Chúng em kiểm tra liệu theo quy định hành Kết làm đề tài Định lượng coliform phương pháp màng lọc trung thực khơng chép từ tập nhóm khác Các tài liệu sử dụng tiểu luận có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng Ký ghi rõ họ tên MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN NỘI DUNG 1.Tổng quan Coliform 1.1.Giới thiệu Coliform 1.2 Phương pháp màng lọc 2 Định lượng Coliform phương pháp màng lọc 2.1 Phạm vi áp dụng: 2.2 Thiết bị dụng cụ 2.3 Mơi trường, hóa chất Vai trị thành phần 2.3.1 Mơi trường hóa chất 2.3.2 Thành phần 2.3.3 Vai trò thành phần 2.4 Đặc tính hiệu 2.5 Qui trình định lượng Coliform 2.6 Mục đích bước Kết 3.1 Cơng thức tính kết quả, biểu thị kết 3.1.1 Trường hợp khái quát 3.1.2 Trường hợp sau khẳng định PHẦN KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO TRẮC NGHIỆM 10 PHẦN MỞ ĐẦU Coliform xem vi sinh vật chỉ thị an tồn vệ sinh, bởi số lượng chúng diện mẫu chỉ thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh khác thực phẩm Các nhà nghiên cứu cho số lượng Coliform thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cũng lớn Coliforms phát triển tốt nhiều loại mơi trường, nhiều loại thực phẩm Có nghiên cứu cho thấy chúng phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2 ℃ cao đến 50℃ Trong thực phẩm chúng phát triển yếu chậm ở 5℃ cũng có tài liệu ghi nhận phát triển chúng ở 3-6 ℃ Việc định lượng vi khuẩn Coliform cần thiết Phương pháp màng lọc vẫn không ngừng cải tiến theo nhiều chiều hướng khác tùy theo yêu cầu sử dụng Mợt ví dụ điển hình cho hướng cải tiến phương pháp lọc qua màng lưới kỵ nước Về thực chất phương pháp màng lọc kết hợp hai phương pháp vốn sử dụng rộng rãi công tác kiểm nghiệm vi sinh vật Vì với để tài “ Định lượng Coliform phương pháp màng lọc” sẽ giúp nghiên cứu hiểu rõ phương pháp cũng vấn đề PHẦN NỘI DUNG 1.Tổng quan Coliform 1.1.Giới thiệu Coliform Coliform thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, mợt nhóm trực kh̉n gram âm, khơng tạo bào tử, hiếu khí kị khí khơng bắt ḅc, có khả lên men đường lactoza, sinh vịng 48 ở nhiệt đợ ni cấy thích hợp, thường giống Escherichia, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter Coliform phát triển tốt nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm Có nghiên cứu cho thấy chúng phát triển ở nhiệt đợ thấp đến -2 oC cao đến 50oC Trong thực phẩm chúng phát triển yếu chậm ở 5oC cũng có tài liệu ghi lại phát triển chúng ở 3-6oC Ngưỡng pH để Coliform phát triển 4,4-9 E.Coli phát triển mơi trường tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon hữu (chẳng hạn glucose) một nguồn nito (NH4)2SO4 cùng với vài loại khoáng khác Coliform ưa nhiệt (còn gọi coliform phân): Lên men đường lactoza ở nhiệt đợ 44oC, E.Coli tḥc nhóm Coliform ưa nhiệt loại Coliform bền với phenol 0,085% sinh indol ở nhiệt độ 42 – 44oC 1.2 Phương pháp màng lọc Dùng để đánh giá mức an toàn vi sinh thực phẩm Bản chất phương pháp tập trung số vi sinh vật mợt mẫu nước có khối lượng lớn màng lọc khuẩn định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm sau đặt màng lọc lên một mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Dựa mẫu nước ban đầu quy ước coi khuẩn lạc hình thành từ mợt vi kh̉n người ta quy số lượng vi sinh vật có mợt đơn vị thể tích nước Định lượng Coliform phương pháp màng lọc 2.1 Phạm vi áp dụng: - Được quy định theo TCVN 6187-1:2019 (ISO 9308-1:2014) - Tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng Escherichia coli (E coli) vi khuẩn coliform Phương pháp sử dụng kỹ thuật lọc màng, sau ni cấy mơi trường thạch coliform sinh màu tính tốn số lượng vi sinh vật đích có mẫu thử Vì mơi trường thạch phân biệt có đợ chọn lọc thấp nên hệ vi sinh vật phát triển gây nhiễm cho số đếm E coli vi khuẩn coliform, ví dụ: phương pháp khơng thích hợp để áp dụng với mẫu nước bề mặt nước giếng nơng Tiêu ch̉n đặc biệt thích hợp cho loại nước có số lượng tổng vi khuẩn 100 khuẩn lạc môi trường thạch coliform sinh màu (CCA) bao gồm nước uống đóng chai, nước bể bơi khử khuẩn nước qua xử lý làm nước uống Mợt vài chủng E coli âm tính với -D-glucuronidase, Escherichia coli O157, sẽ không phát E coli Vì chúng có enzym -D-galactosidase dương tính nên sẽ giống vi khuẩn coliform 2.2 Thiết bị dụng cụ - Thiết bị hấp tiệt trùng - Tủ ấm - Máy pH - Thiết bị lọc màng - Màng lọc - Kẹp gắp 2.3 Mơi trường, hóa chất Vai trị thành phần 2.3.1 Mơi trường hóa chất Mơi trường hóa chất Vai trị Ni cấy Coliform Môi trường Lactose TTC Agar Thạch TSA Khẳng định Coliform Thuốc thử oxidase HCl 10% NaOH 10% Điều chỉnh độ Ph 2.3.2 Thành phần - Môi trường Lactose TTC Agar Thành phần hóa chất Hàm lượng hóa chất (g) Lactose 20 Agar 15 Peptone 10 Cao men Canh thịt Sodium heptadecyl sulphate 0.1 Bromothymol xanh 0.05 2.3.3 Vai trò thành phần Peptone, Canh thịt cao nấm mem nhằm cung cấp thành phần dinh dưỡng như: nitơ, hợp chất cacbon, vitamin axit amin Sodium heptadecyl sulfat (Tergitol 7) giúp ức chế hầu hết vi khuẩn gram dương Bromothymol xanh một chỉ thị thể hiển độ pH tạo màu Thạc Agar dùng tạo khn 2.4 Đặc tính hiệu Bảng 2: Đặc tính hiệu CCA E.coli Vi khuẩn coliform Độ nhạy 94% 91% Độ đặc hiệu 97% 94% Tỉ lệ dương tính giả 6% 5% Tỉ lệ âm tính giả 3% 11% Hiệu suất 96% 92% Độ chọn lọc -0,78 -0,32 Dải định lượng (khuẩn lạc màng 47mm) 10-100 10-100 Độ thu hồi >80% >70% Độ lặp lại 0,046 0,035 Độ tải lập 0,127 0,114 Thời gian ủ bắt buộc Phải tăng thời gian ủ khuẩn lạc giả đinh Số mẫu = 220 Độ không đảm bảo đo số đếm (RSD) khoảng từ 18-24h 2.5 Qui trình định lượng Coliform - B1: Chuẩn bị mẫu - B2: Lọc - B3: Ủ phân biệt - B4: Đếm vi khuẩn Coliform giả định - B5: Dùng phép thử oxidase để khẳng định vi khuẩn Coliform - B6: Đếm kh̉n lạc - B7: Tính tốn kết luận 2.6 Mục đích bước Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu lọc cấy môi trường phân lập, theo hướng dẫn TCVN 9716 (ISO 8199) Mẫu thử phải vận chuyển bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3) °C theo hướng dẫn TCVN 8880 (ISO 19458) Trường hợp đặc biệt mẫu bảo quản ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước kiểm tra.Trong trường hợp này, thời gian bảo quản mẫu phải nêu báo cáo kết Bước 2: Lọc Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích khác, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai) qua màng lọc (5.5) Thể tích lọc tối thiểu 10 ml mẫu ban đầu mẫu pha loãng để đảm bảo cho phân bố đồng vi khuẩn màng lọc Bước 3: Ủ phân biệt Sau lọc (8.2), đặt màng lọc địa thạch coliform sinh màu (CCA) (B.1), đảm bảo không tạo bọt phía màng, lật ngược đĩa, ủ ở (36 ± 2) °C (21 ±3) h Kiểm tra màng lọc đếm tất khuẩn lạc dương tính B-D-galactosidase (màu hồng đến đỏ) vi khuẩn coliform giả định, E coli Bước 4: Đếm khuẩn lạc Coliform giả định Đểm tất khuẩn lạc dương tính B-D-galactosidase B-D-glucuronidase (màu xanh đậm đến màu tim) E coli Bước 5: Dùng phép thử oxidase để khẳng định vi khuẩn Coliform Để khẳng định vi khuẩn coliform giả định E coli, sử dụng phép thử oxidase Thử tất khuẩn lạc đặc trưng thu được, 10 khuẩn lạc màu hồng đến đỏ chọn theo TCVN 9716 (ISO 8199) Đối với phép thử khẳng định này, sử dụng test thử oxidase thương mại phù hợp Nếu không sử dụng que thử oxidase thương mại, phép thử oxidase thực cách nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxidase chuẩn bị (B.2) lên giấy lọc đặt đĩa petri Dùng que cấy vịng nhựa platin chuyển mợt phần khuẩn lạc lên giấy lọc chuẩn bị Màu xanh đậm xuất vòng 30 s phản ứng dương tính Vi kh̉n coliform âm tính oxidase nên khơng xuất màu xanh đậm Nếu có nhiều khuẩn lạc phát triển màng lọc khuẩn lạc giả định nằm sát khuẩn lạc khác, cấy truyền tiếp để chắn phép thử oxidase thực với chủng cấy Nếu khuẩn lạc giả định nhỏ cũng cần cấy truyền để thực phép thử oxidase Việc cấy truyền tiến hành thạch khơng chọn lọc (ví dụ B.3) ở (36 ± 2) °C (21 ± 3) h Bước 6: Tính tốn kết Kết 3.1 Cơng thức tính kết quả, biểu thị kết 3.1.1 Trường hợp khái quát Đối với phương pháp màng lọc đọc kết chọn đĩa có số đếm tổng khuẩn lạc khoảng 10-200 lựa chọn đĩa có số đếm kh̉n lạc điển hình khoảng 10-100 Tổng số khuẩn lạc màng lọc một đơn vị thể tích mẫu lọc sẽ tính thức cơng thức: Trường hợp chung Cs = ZxVs V tot Trong đó: Cs : số kh̉n lạc có thể tích mẫu Vs Z : số khuẩn lạc màng ở đợ pha lỗng d1, d2,… di Vs : thể tích chọn để biểu diễn kết Vtot : tổng thể tích tính từ mẫu ban đầu màng tổng phần riêng biệt từ mẫu thử , tính theo cơng thức Vtot = n1 ×V ×d +n2 ×V ×d +… ni ×V i ×d i Trong đó: n1, n2, ni : số màng ở đợ pha lỗng d1, d2,… di V1, V2, Vi : thể tích sử dụng ở đợ pha lỗng d1, d2,… di d1, d2, di : đợ pha lỗng ở thể tích V1, V2, Vi (d = khơng pha lỗng, d = 0.1 mẫu pha loãng 10 lần…) Trường hợp khuẩn lạc sau xác nhận lại khẳng định Số kh̉n lạc màng ở đợ pha lỗng tính theo cơng thức sau: Z= ka n Trong đó: Z : Số khuẩn lạc màng k : Số khuẩn lạc cho kết dương tính n : Số khuẩn lạc chọn để khẳng định a: Tổng số khuẩn lạc nghi ngờ Nếu sau khẳng định, ở nồng độ ban đầu (100), số khuẩn lạc Coliform/ E.coli