BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN Phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta Ngành học : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Sinh viên thực : Nhóm – DH21SHC Niên khóa : 2021 – 2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN Phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN THIÊN ÂN LÊ THỊ KIỀU GIANG PHAN TẤN PHÁT CAO NGUYỄN BẢO ÂN TP Thủ Đức, 10/2023 MỤC LỤC Trang CHƯƠNG MỞ ĐẦU .5 1.1 Đặt vấn đề 1.1 Mục tiêu báo cáo 1.2 Nội dung thực CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cà phê Robusta 2.1.1 Khái quát chung 2.2.1 Vị trí phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái cà phê Robusta 2.1.4 Thành phần cà phê Robusta 2.2 Giới thiệu số hợp chất quan trọng cà phê Robusta 2.2.1 Các Axit hữu .9 2.2.2 Lipid – dầu cà phê 2.2.3 Các Alcaloit (Caffein Trigonelline) 10 2.2.4 Chất khoáng 10 2.2.5 Protein cà phê 10 2.2.6 Chất thơm cà phê 11 2.3 Phân bố đặc điểm thực vật học cà phê Robusta .11 2.3.1 Phân bố 11 2.3.2 Đặc điểm thực vật học 11 2.2.1 Sự đa dạng sinh học .12 2.2.2 Đa dạng di truyền 12 2.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 12 2.3.1 Phương pháp sử dụng dấu hiệu hình thái 12 2.3.2 Phương pháp sử dụng chất đánh dấu isozyme 12 2.3.3 Phương pháp sử dụng marker phân tử .13 2.4 Tổng quan điểm đánh dấu SCoT 13 2.4.1 Khái niệm điểm đánh dấu SCoT .13 2.4.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCoT 13 2.5 Kỹ thuật tách chiết DNA thực vật .14 2.5.1 phương pháp tách chiết DNA .14 2.5.2 Phương pháp DNA định tính định lượng .14 2.6 Phân tích phát sinh lồi 14 2.7 Tổng quan điểm đánh dấu SCAR 15 2.7.1 Khái niệm điểm đánh dấu SCAR 15 2.7.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCAR 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .16 3.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .17 4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 17 4.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 17 4.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước nông nghiệp đà phát triển với nhiều loại hình sản xuất Ngồi lúa, cao su, điều… Việt Nam cịn nước trọng việc nuôi trồng sản xuất cà phê Cây cà phê đóng vai trị vơ quan trọng sản xuất nông nghiệp nước ta Cà phê thức uống phổ biến ngày phát triển giới Lượng tiêu thụ gần 9.012.540 năm Việt Nam nước sản xuất Robusta lớn giới Theo báo cáo trước đây, diện tích trồng cà phê Việt Nam 695.600 sản lượng 1,76 triệu vào năm 2020, khu vực Tây Nguyên chiếm khoảng 73% diện tích trồng sản lượng Vì vậy, vùng mệnh danh thủ đô trồng sản xuất cà phê Việt Nam Cây cà phê Robusta cần từ đến tuổi bắt đầu thu hoạch Tuổi thọ kéo dài từ 20 đến 30 năm Cà phê Robusta, biết đến với tên gọi khác cà phê Canephora Ở Việt Nam Robusta cịn có tên gọi cà phê Vối Đây loại cà phê bán phổ biến ưa chuộng thị trường Việt Nam Cây cà phê Robusta lần phát Congo năm 1800 Sau đó, giống tự nhiên hóa nhiều quốc gia Borneo, Polynesia, Costa Rica, Nicaragua, Jamaica,… Cây cà phê Robusta du nhập đến Đông Nam Á vào năm 1900 nhân giống, trồng trọt rộng rãi Robusta dần du nhập trồng phổ biến Việt Nam Các tỉnh trồng cà phê Robusta phổ biến gồm có Đăklăk, Đăk Nơng, Lâm đồng, Gia Lai với diện tích lên đến 90% tổng diện tích canh tác cà phê Những tỉnh nói Việt Nam sở hữu diện tích lớn đất đỏ bazan trù phú Loại đất có độ tơi xốp cao, khả giữ nước tốt Điều kiện khí hậu, nhiệt độ, ánh sáng thuận lợi góp phần giúp hấp thu dinh dưỡng tốt Hằng năm, người ta lại thu hoạch sản lượng lớn hạt cà phê Robusta từ phân phối đến tỉnh thành khác Việt Nam giới Chính thế, loại phát triển tốt cho suất cao năm Sản lượng Robusta khoảng 30% sản lượng cafe giới, trải khắp Tây Trung Phi, Đông Nam Á, vùng Nam Mỹ Nền kinh tế sản xuất cà phê thay đổi năm gần đây, với giá thị trường quốc tế giảm chi phí đầu vào tăng Đồng thời, nhu cầu cà phê đặc sản mức cao thời đại Để sản xuất cà phê bền vững, cần ý cải thiện chất lượng cà phê cách tham gia vào biện pháp canh tác bền vững, thân thiện với môi trường, cuối thu lợi nhuận rịng cao Sản xuất kiểu gen có thuộc tính chất lượng cà phê cải thiện mục tiêu chương trình cải tiến di truyền cà phê Những tiến gen cung cấp công cụ để phân tích chất lượng cà phê cấp độ phân tử Gần báo cáo trình tự gen cà phê Robusta, Coffea canephora, nghiên cứu quan trọng phát triển nghiên cứu cà phê Với tiến công nghệ gen giải trình tự, khả thi để hiểu gen cà phê chế di truyền phân tử chất lượng cà phê, từ giúp nâng cao hiệu chương trình nhân giống Đánh giá thảo luận kiến thức di truyền hóa sinh hợp chất coi yếu tố định chất lượng, sử dụng làm tảng cho nâng cao chất lượng cà phê cách nhân giống Nguồn gen sẵn có cho việc nghiên cứu di truyền hợp chất sinh hóa có khả đóng vai trị hương vị cà phê thảo luận Ngoài ra, giá trị tiềm việc nghiên cứu di truyền cà phê chất lượng cách sử dụng trình tự hệ phân tích di truyền liên kết cải thiện xem xét Những hạn chế hóa học hình thái, phương pháp xác thực kính hiển vi tạo nhu cầu phương pháp việc kiểm sốt chất lượng cơng thức thuốc thảo dược SCAR, điểm đánh dấu dựa PCR, đại diện cho locus xác định mặt di truyền xác định cách khuếch đại DNA gen với cặp mồi oligonucleotide cụ thể Các điểm đánh dấu SCAR chứa số lượng cao trình tự gen cạn kiệt vùng khuếch đại Do đó, chúng có giá trị ứng dụng quy mô lớn dành riêng cho địa phương sàng lọc hỗ trợ điểm đánh dấu nhân gen dựa đồ Điểm đánh dấu SCAR, tạo từ vùng đa hình có kích thước khác lồi, cho phép xác thực mẫu dựa thay đổi kích thước SCAR Các dấu hiệu dựa DNA khác viz AFLP, SSR, ISSR RAPD sử dụng để tạo điểm đánh dấu Tuy nhiên, độ tin cậy cao dấu SCAR dẫn đến dịch chuyển AFLP dấu hiệu dựa DNA khác, tốn kém, thời gian tẻ nhạt sử dụng số vật liệu phóng xạ bước phát Ngồi ra, độ nhạy phát cao khả điện di tránh làm cho trở thành cơng cụ phân tử kinh tế Như vậy, SCAR marker dường công nghệ phù hợp để xác thực dược liệu cổ truyền Đặc tính phân tử dấu hiệu SCAR cho phép xác định phân biệt loại thảo mộc cách hiệu đáng tin cậy với loại tạp chất xác định loại thực phẩm cao cấp Các loài thực vật có hình thái tương tự phân biệt cách sử dụng dấu hiệu phân tử Khi điểm đánh dấu SCAR phát triển cho lồi cụ thể, sử dụng để phát công thức giống không đồng sử dụng hệ thống thuốc truyền thống để xác thực loại thuốc thảo dược truyền thống 1.1 Mục tiêu báo cáo Tìm hiểu vật liệu phương pháp phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta 1.2 Nội dung thực CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cà phê Robusta 2.1.1 Khái quát chung Cà phê Robusta (Coffea canephora) có tiếng dịng cà phê có hương vị mạnh, nồng đặc trưng Điều làm cho vị cafe robusta khác biệt hàm lượng caffeine có hạt, hàm lượng cao chiếm từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc Hạt cà phê Robusta cịn ngun có mùi giống hạt đậu phộng tươi, rang lên thơm nồng có vị đắng đặc trưng khiến người uống thấy sảng khoái, tinh thần phấn chấn Cà phê Robusta phù hợp để trồng điều kiện khí hậu nhiệt đới Cây thường trồng độ cao 1000m so với mực nước biển Nhiệt độ lý tưởng dao động từ 24 đến 29 độ C Cây cà phê Robusta loại ưa nước với yêu cầu lượng mưa hàng năm trung bình 1000mm Đặc biệt, so với cà phê thông thường, cà phê Robusta phải trồng điều kiện ánh sáng thuận lợi So với giống cà phê khác, Robusta có khả chống loại sâu bệnh tốt, suất cao, dễ chăm sóc Tuy nhiên, Robusta có đặc điểm chịu hẹn, chịu lạnh kém, sản lượng khơng ổn định 2.2.1 Vị trí phân loại Cà phê Robusta lồi thực vật có hoa họ Thiến thảo Lồi dược Pierre ex A.Froehner mơ tả khoa học năm 1897  Giới: Plantae  Ngành Angeosperma  Lớp: Asteridae  Bộ: Gentianales  Họ: Rubiaceae  Chi: Coffea  Lồi: C Canephora Hình 2.1 Hạt cà phê Robusta 2.1.3 Đặc điểm hình thái cà phê Robusta Đặc điểm loại cà phê có hình trịn, hạt cà phê Robusta thường nhỏ loại cà phê khác, có hình bầu dục tròn với phần rãnh thường đường thẳng, nhân nhỏ cà chè cà mít Thường có nhân Hàm lượng caffein 2-4% thơm, uống có vị chát đắng gắt Cây Robusta dạng bụi kích thước lớn, phát triển tốt độ cao khoảng – 800m so với mặt nước biển Do đó, loại phù hợp với điều kiện địa hình khí hậu Việt Nam Lá cà phê Robusta thường to, phát triển nhanh, tán rộng, Mật độ trồng thưa (2,5 – 3,5m) Cây trưởng thành hoang dã cao đến 8m, canh tác thường để từ 2-2,5m Cây thân gỗ dạng bụi, cành nhánh phát triển mạnh Những lâu năm thường có nu, chu vi gốc lên đến 80100cm Lá hình van dài từ 15-22cm, rộng 10-14cm, mép thường gợn sóng, phiến xanh đậm bóng 2.1.4 Thành phần cà phê Robusta Về mặt hóa học, cà phê phức tạp thành phần xác phụ thuộc vào nhiều yếu tố giống, điều kiện rang, xay ủ Sự biến đổi cà phê nhấn mạnh n ghiên cứu gần phân tích thành phần hóa học hạt cà phê bao gồm: Hàm lượng lớn hàm lượng carbohydrate khơng hịa tan chiếm 34-44% (trong bao gồm Hemicelluloses chiếm 3-4% Xenluloza, β (1-4) mannan chiếm 32-40%) Kế tiếp Lipid với hàm lượng 8-12% (trong bao gồm sáp chiếm 0.2 – 0.3% dầu chiếm 8-11.7%) Hàm lượng Cảbonhydrate hòa tan chiếm tỉ lệ không nhỏ 6-11.5% (hỗn hợp bao gồm Monosaccharid 0.2-0.5%, Oligosaccharides 3-7% Polysaccharid 3-4%) Bên cạnh đó, cà phê Robusta thành phần Axit Phenol, hỗn hợp bao gồm Axit không bay chiếm 1.3-2.2% Axit Chlorogenic chiếm 7.1-12.1% Cung hợp chất chưa nitơ bao gồm Axit amin tự 0.2-0.8%, protein 7.5-9.5%, Caffeine 1.7-4%, Trigonelline 0.3-0.9% khoáng chất 3.0-5.4% Cà phê Robusta thường chứa lượng caffeine cao, hàm lượng cao chiếm từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc 2.2 Giới thiệu số hợp chất quan trọng cà phê Robusta 2.2.1 Các Axit hữu Thành phần axit cà phê bao gồm tập hơp khoảng 30 loại axit hữu khác nhau, với số loại axit quan trọng như: Axit Acetic, axit Citric, axit Chlorogenic, axit Phosphoric Các axit hữu góp phần tạo nên đặc tính Acidity (độ chua) cà phê Thành phần, hàm lượng axit cà phê phụ thuộc vào giống cà phê đồng thời thay đổi liên tục trình chế biến, mà phần lớn trình lên men, rang cà phê số loại axit đáng kể, số loại khác lại sinh 2.2.2 Lipid – dầu cà phê Lipid hay gọi đơn giản chất béo, đóng vai trị quan trọng chất lượng tách cà phê bạn, chủ yếu bao gồm triacylglycerol, sterol tocopherols (vitamin E) Hàm lượng lipid cà phê khác tùy thuộc vào giống lồi Thơng thường Arabica chứa nhiều lipit so với người anh em Robusta, trung bình 15-17% 10-11,5% 2.2.3 Các Alcaloit (Caffein Trigonelline) Hạt cà phê có chứa số loại alkaloids (một hợp chất hữu có chứa ngun tử nitơ) bao gồm, Caffeine, Putrescine, Theophylline, Trigonelline Trong số này, Caffeine có cà phê trà, Trigonelline có cà phê hai alkaloids biết đến chất kích thích người làm nên yêu thích cà phê Caffeine (cịn gọi trimethylxanthine), alkaloid lý khiến bạn thích uống cà phê Ancaloit có tác dụng kích thích thần kinh trung ương làm tăng tỉnh táo, chúng có hương vị đắng dạng tinh khiết Caffeine góp phần tạo nên sức mạnh tổng thể vị đắng đặc trưng cà phê Tùy thuộc vào loài giống, caffeine chiếm từ 0,6 đến 4% khối lượng hạt Đồng thời, trái với niềm tin chung, q trình rang khơng làm giảm hàm lượng caffeine hạt Trong cà phê, Caffeine có vai trị chất chống trùng, Hàm lượng Caffeine trung bình Cà phê Robusta cao so với cà phê Arabcia nên khả chống chịu sâu bệnh tốt Mặc dù nhiều nghiên cứu cơng nhận lành tính, khơng tác động xấu đến sức khỏe, Song liều lượng sử dụng Caffeine khác với người tùy thuộc vào địa, mức độ mẫn cảm Trigonelline alkaloid khác tìm thấy hạt cà phê nồng độ thấp chút so với caffeine Nó bắt đầu bị phân hủy 60°C nên q trình rang (nóng 200°C), nửa lượng trigonelline bị biến chất tạo số hợp chất, bao gồm axit nicotinic, hay gọi vitamin B3, phần lại trigonelline vào chiết xuất tạo mùi thơm ngọt, caramel mùi đất 2.2.4 Chất khoáng Không thể không kể đến lượng nhỏ chất khống có cà phê, gồm khoảng 3-5% chủ yếu Kali, Nito , Magie , Photpho, Clo Ngoài cịn có chất nhơm, sắt, đồng, lưu huỳnh, tồn dạng vêt Những chất ảnh hưởng không tốt đến mùi hương cà phê Chất lượng cà phê cao khống chất thấp ngược lại 2.2.5 Protein cà phê Hàm lượng protein cà phê khơng cao đóng vai trị quan trọng giúp hình thành hương vị cà phê trình rang qua phản ứng Maillard với loại đường có cà phê Bằng phương pháp định tính người ta nhận thấy thành phần protein có axit amin như: cystein, alanie ,phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine Các axit amin thấy dạng tự do, chúng giải phóng tác dụng với tác dụng với chất tạo mùi vị cho cà phê rang.Trong chất axit amin kể đáng ý axit amin có chứa lưu huỳnh cystein , methionine proline… chúng góp phần tạo hương đặc trưng cà phê sau rang Đặc biệt , methionine proline có tác dụng làm giảm oxy hóa chất thơm, làm cho cà phê rang giữ mùi vị bảo quản 2.2.6 Chất thơm cà phê Các thành phần phần khơng có chung đặc tính hóa học, đặc tính vật lý dễ bay Đây nguyên nhân tạo phần lớn hương thơm cà phê thường đến từ phản ứng q trình rang, việc bảo quản ảnh hưởng đến chúng Việc nghiên cứu tất hợp chất công việc phức tạp tiến hành, có 1000 hợp chất dễ bay tìm thấy tách cà phê điển hình Chúng dễ bay theo tên gọi chất – chúng có xu hướng bay trước có thời gian để đo lường chúng Trong cà phê hàm lượng chất thơm nhỏ, hình thành tích lũy hạt Sự tích lũy chịu nhiều yếu tố đất đai, khí hậu chủng loại cà phê Sự tích lũy chất thơm hạt nói riêng cấu trúc hương vị cà phê chịu ảnh hưởng lớn độ cao, loại cà phê trồng cao, phẩm chất hạt tốt 10 2.3 Phân bố đặc điểm thực vật học cà phê Robusta 2.3.1 Phân bố Hoạt động canh tác Robusta bắt đầu vào đầu kỷ 19 – nêu – thiệt hại đáng kể CLR gây đồn điền C rabica châu Á Theo tài liệu đáng tin (Charrier and Eskes, 1997), cà phê Robusta mang đến Java, Indonesia vào năm 1901 Cộng hòa Dân chủ Congo (Cộng hòa Congo) Những Robusta nhanh chóng có mặt Châu Phi người nông dân châu Phi chấp nhận nhờ sức sống, suất khả chống lại CLR Đồng thời, số loài haong dã khác Robusta Kouillou, Maclaudi & Game, Niaouli Coffea ugandae triển khai quốc gia khác Bờ biển Ngà, Guinea, Togo Uganda, tương ứng Từ sau năm 1960, đặc dòng nhân giống vơ tính Robusta phát triển Uganda, Congo, sau Bờ Biển Ngà Tuy nhiên, khơng có nhiều thay đổi tính so với ban đầu Ngày nay, có số quốc gia tiếp tục với chương trình tuyển chọn cho thương mại, với số cải thiện Điển hình Bờ Biển Ngà – Nơi suất tăng từ 30% đến 110% kích cỡ hạt tăng 50% Một số giống phát triển Brazil nơi gọi Conillon 2.3.2 Đặc điểm thực vật học Ngay số cà phê tìm thấy nơi cách mực nước biển lên đến 2300m, hầu hết lồi (67%) thích nghi với phạm vi giới hạn độ cao 1000m Và Robusta điển hình nhóm “dễ thích nghi” đó, nên chúng trồng khu vực thấp Arabica (chỉ tầm – 800m) Bù lại Robussta yêu cầu lượng mưa lớn (từ 1200 – 2500mm) đó, hầu hết lồi có phân bố rộng lục địa châu Phi (tức C canephora, C eugenioides) thường tìm thấy mơi trường ẩm ướt Cà phê Robusta có số ưu điểm trội so với cà phê Arabica khả chống bệnh gỉ sắt (Coffee Leaf Rust), sâu đục thân, bệnh tuyến trùng, cho suất cao cà phê Arabica nhiều Vì lý này, chi phí trồng Robusta tương đối thấp so với giống Arabica Mặt khác, khơng có khả chịu đựng điều kiện hạn hán kéo dài, chịu lạnh (nhiệt độ tối thích khoảng (18 – 36oC), sản lượng khơng ổn định so với Arabica, số thuộc tính tiêu cực cà phê Robusta 2.2.1 Sự đa dạng sinh học Thuật ngữ "đa dạng sinh học" dùng để đa dạng phong phú dạng sống Trái đất Quỹ Động vật Hoang dã Thế giới (WWF) (2022), tổ chức chuyên bảo tồn động vật hoang dã, định nghĩa đa dạng sinh học sau: “Đa dạng sinh học tất dạng sống khác mà bạn tìm thấy khu vực - đa dạng động vật, thực vật, nấm , chí vi sinh vật vi khuẩn tạo nên giới tự nhiên Mỗi loài sinh vật phối hợp với hệ sinh thái, giống mạng lưới phức tạp, để trì cân hỗ trợ sống” Tổng hợp gen, loài hệ sinh thái gọi đa dạng sinh học Khi loài khác biến mất, lồi xuất mơi trường sinh thái thay đổi tiến hóa diễn 2.2.2 Đa dạng di truyền Mỗi người có gen riêng đa dạng gen kết đa dạng Sự thay đổi nhỏ alen gen gây khác biệt sinh lý đồng tử Các giống trồng vật nuôi lai từ gen 11 chọn tạo giống vật ni có suất cao có khả kháng sâu bệnh Sự tái tổ hợp xảy q trình sinh sản hữu tính dẫn đến gia tăng kiểu gen cá thể quần xã Các kiểu gen dị hợp tử xuất quần thể kết gen đa hình Các cá thể quần thể có kiểu gen khác làm cho quần thể có khả thích ứng tốt với thay đổi mơi trường ( Vedantu ) Mỗi lồi cần có đa dạng di truyền để đảm bảo khả sinh sản, khả chống chịu bệnh tật khả thích ứng với điều kiện mơi trường ln thay đổi Việc bảo tồn nguồn gen cần thiết khơng để tránh tuyệt chủng lồi mà ngăn ngừa mát gen, phức hợp gen kiểu gen, chí tránh tuyệt chủng giống địa phương Tiềm di truyền loài bị suy giảm đáng kể tình khắc nghiệt, lồi bị tuyệt chủng nguồn gen chúng bị suy giảm nghiêm trọng đến mức số gen số phức hợp gen bị 2.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.3.1 Phương pháp sử dụng dấu hiệu hình thái Bằng cách sử dụng biểu hình thái, người ta xác định đa dạng di truyền Gen biểu tính di truyền liên quan đến đặc điểm hình thái phát được; đó, gọi gen đánh dấu Tuy nhiên, số lượng tiêu hình thái xuất tự nhiên hạn chế, chưa đáp ứng nhu cầu nhiều chương trình nhân giống tồn giai đoạn phát triển cụ thể cá thể quy mơ hình thái Các dấu hiệu hình thái mong muốn việc cải thiện giống biểu chúng bị kiểm sốt yếu tố mơi trường 2.3.2 Phương pháp sử dụng chất đánh dấu isozyme Isozyme protein trải qua phản ứng enzyme giống có điện di khác Bằng cách sử dụng điện trường đồng khoảng thời gian cụ thể, điện di sử dụng để đánh giá độ linh động protein Điện di sử dụng để phân biệt protein đột biến có điện tích khác chúng di chuyển theo nhiều cách khác Kích thước biến đổi cấu trúc phân tử protein thể rõ khác biệt Do đột biến từ alen sang alen khác, thường liên quan đến việc thay axit amin phân tử protein Mặc dù việc sử dụng thị isozyme cải thiện việc nghiên cứu đa dạng di truyền số lượng thị isozyme chưa đủ chưa đạt yêu cầu để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu 2.3.3 Phương pháp sử dụng marker phân tử Cho chúng có số lượng nhiều nhiều so với dấu hiệu isozyme dấu hiệu hình thái, dấu hiệu phân tử chứng minh có ý nghĩa lâu dài (Tanksley cộng sự, 1980) Về bản, điểm đánh dấu phân tử chuỗi mã hóa DNA giúp phân biệt hai cá thể, họ lớp riêng biệt Chỉ thị dựa kỹ thuật lai DNA (DNA – DNA hydridizationbased ) thị dựa kỹ thuật PCR bao gồm hai nhóm thị phân tử Các dấu hiệu phân tử có số ưu điểm so với dấu hiệu hình thái isozyme, bao gồm khả đo trực tiếp vật liệu di truyền, diện nhiều số quần thể thực tế phép đo không bị ảnh hưởng yếu tố môi trường giai đoạn phát triển 12 2.4 Tổng quan điểm đánh dấu SCoT 2.4.1 Khái niệm điểm đánh dấu SCoT nhắm mục tiêu mã khởi đầu ( SCoT ) điểm đánh dấu trội tái tạo, có tảng từ vùng bảo tồn ngắn gen thực vật bao quanh codon khởi đầu (hoặc khởi đầu) dịch mã ATG có mồi 18 mer phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Phương pháp mô tả phù hợp với số lượng đáng kể phịng thí nghiệm nghiên cứu thực vật với thiết bị thông thường cho phép hiển thị dấu hiệu cách sử dụng điện di nhuộm gel agarose Khả sử dụng trực tiếp dấu SCoT chương trình nhân giống hỗ trợ dấu hiệu trở nên khả thi nhờ tỷ lệ tái tổ hợp dấu SCoT gen/tính trạng thấp so với dấu ngẫu nhiên RAPD, ISSR SSR (David J Mackill & Bertrand CY Collard, 2008) 2.4.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCoT Một số loài thực vật lúa, tritordeums , mía, nho, khoai tây, xồi, myrica rubra, đậu phộng garbanzo đạt lợi từ việc ứng dụng thị SCoT để đánh giá đa dạng cấu trúc di truyền, xác định giống trồng, lập đồ tính trạng định lượng loci (QTL) dấu vân tay DNA Atika Agarwal đồng nghiệp cô phát nhiều loại giống hoa hồng Ấn Độ vào năm 2017 màu sắc, hình dạng kích thước giống trải qua trình nhân giống khác Hơn nữa, phân bố địa lý tính đa bội khiến việc nghiên cứu chọn lọc giống hoa hồng trở nên khó khăn Để mơ tả xác định khác biệt di truyền 29 giống hoa này, họ tiến hành nghiên cứu sử dụng thị SCOT 29 giống hoa Điều dẫn đến kết luận số SCOT có mức độ cao hiệu việc hỗ trợ cải tiến giống hoa hồng thơng qua phân tích đa hình, giúp nâng cao hiệu kinh tế Ứng dụng thị phân tử SCOT (Start Codon Targeted) để đánh giá đa dạng di truyền giống xoài (Mangifera) trồng Duyên hải Nam Trung Bộ Nam Bộ trọng tâm nghiên cứu Lê Thị Thanh Nga năm 2019 Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trường đại học Ứng dụng thị phân tử SCOT (Start Codon Targeted) để đánh giá đa dạng di truyền giống xoài (Mangifera) sản xuất vùng duyên hải Nam Trung Bộ Nam Bộ trọng tâm Lê Thị Nghiên cứu Thanh Nga năm 2019 Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành Kết DNA từ 30 giống xoài khác chiết xuất 22 mồi SCOT đa hình chọn khuếch đại Đánh giá di truyền 30 loài xoài Cây phát sinh chủng loại lồi xây dựng phân thành hai nhóm: giống xồi địa phương giống có tiềm xuất (Mai, 2020) 2.5 Kỹ thuật tách chiết DNA thực vật 2.5.1 phương pháp tách chiết DNA Bước nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử đạt độ tinh khiết lượng axit nucleic thích hợp cho xét nghiệm Mục tiêu phương pháp chiết xuất axit nucleic thu phân tử dạng nguyên vẹn mà khơng cần tạo tác nhân học để phá vỡ chúng Có ba bước liên quan đến trình tách DNA từ tế bào thực vật: Bước 1: Vỡ màng tế bào Trong hầu hết trường hợp, đệm chiết trộn với nghiền tế bào mô Màng tế bào nhân bị hỗn hợp làm 13 sập , đồng thời phân hủy protein gắn DNA giải phóng DNA mơi trường xung quanh Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn, chủ yếu protein Protein polysacarit tạo phức dung dịch CTAB/NaCl trước kết tủa Protein bị biến tính phenol cloroform Cloroform hỗ trợ thêm việc tách pha hữu nước Trong trình chiết xuất, rượu isoamyl ngăn ngừa tạo bọt Sau ly tâm, protein bị biến tính, khơng hịa tan pha nước có chứa axit nucleic, tạo thành lớp pha nước pha hữu Bước 3: Kết tủa DNA Có hai cách điển hình để xảy tượng mưa Ethanol tuyệt đối lạnh sử dụng để kết tủa DNA trọng lượng phân tử thấp loại bỏ cách kết tủa isopropanol chúng không kết tủa Kết tủa phải rửa etanol 70° để loại bỏ muối lại, cặn isopropanol vết 2.5.2 Phương pháp DNA định tính định lượng Một số kỹ thuật, bao gồm đo mật độ quang học quang phổ kế, sử dụng để phân tích DNA thu thập mặt định tính định lượng Định lượng dựa máy đo quang phổ: Kỹ thuật cho phép ước tính nồng độ tương đối axit nucleic mẫu sau chiết Dựa mối tương quan, mật độ quang học mẫu bước sóng 260 nm cho phép ước tính nồng độ axit nucleic mẫu: Đối với dung dịch chứa DNA RNA chuỗi đơn, nồng độ 40 ng/l, dung dịch chứa DNA chuỗi kép 50ng/l Một giá trị bổ sung OD280 nm đo để xác định độ tinh khiết dung dịch DNA tinh khiết có tỷ lệ OD260/OD280 1,8, RNA tinh khiết có tỷ lệ OD260/OD280 Máy quang phổ UVS-99 cho phép kiểm tra xác mẫu cực nhỏ đo DNA Cả hai phép đo UV VIS thực máy quang phổ UVS-99 Thể phạm vi đo quang phổ rộng 2.6 Phân tích phát sinh loài Tất kỹ thuật nghiên cứu đa dạng quần thể dẫn đến liệu phân tử bảng điện di phức tạp Theo phương trình Nei, thơng số đa dạng kiểu gen, đa dạng kiểu hình khoảng cách gen quần thể xác định Trước tiên, cần hiểu số thuật ngữ liên quan đến phát sinh gen để cung cấp thông tin cần thiết để hiểu giải thích phát sinh gen trước tìm hiểu cách chọn phương pháp phần mềm thích hợp Các thuật ngữ có ý nghĩa sau: điểm (để biểu thị cá nhân, gọi OTU), điểm (để phân loại biểu thị tổ tiên cá nhân), nhánh (để biểu thị cách cá nhân có liên hệ với tổ tiên họ), độ dài nhánh (để thể thời gian tiến hóa lồi) rễ (để thể tổ tiên chung tất cá thể có phát sinh lồi) Có nhiều cách để vẽ phát sinh gen Có thể vẽ phát sinh chủng loại với thời gian tiến hóa hiển thị bên cạnh cành có chiều dài nhánh tương ứng với thời gian tiến hóa Có thể vẽ phát sinh chủng loại có khơng có rễ Hiện nay, UPGMA Neighbor-joining hai phương pháp sử dụng thường xuyên Cả hai phương pháp sử dụng ma trận khoảng cách gen độ tương tự gen quần thể để tạo tiến hóa Hiện nay, UPGMA Neighborjoining hai phương pháp sử dụng thường xuyên Cả hai phương pháp sử dụng ma trận khoảng cách gen độ tương tự gen quần thể để tạo tiến hóa UPGMA: Sử dụng ma trận cung cấp, thuật toán ghép nối hai đơn vị tiến hóa với khoảng cách gần khoảng cách 14 hai OTU Sau đó, cặp đơn vị tiến hóa coi OTU Cuối cùng, UPGMA tạo tiến hóa có rễ Nguyên tắc đằng sau cách tiếp cận rút ngắn tiến hóa thơng qua việc tìm kiếm lân cận hợp lý 2.7 Tổng quan điểm đánh dấu SCAR 2.7.1 Khái niệm điểm đánh dấu SCAR Các vùng khuếch đại đặc trưng trình tự (SCAR) phát triển dạng dấu hiệu di truyền dựa PCR Khi đoạn DNA gen locus xác định mặt di truyền khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi oligonucleotide định, kết gọi SCAR Bằng cách nhân giải trình tự hai đầu sản phẩm khuếch đại dấu phân tử cụ thể , SCAR tạo Khi sử dụng nhiệt độ ủ cao, trình tự sử dụng để tạo cặp mồi oligonucleotide 24 mer dẫn đến khuếch đại có khả tái tạo locus đơn lẻ SCAR có số ưu điểm so với dấu hiệu chính, bao gồm khả chuyển đổi thành dấu hiệu đồng trội, khả phát locus khả khuếch đại nhạy với trường hợp phản ứngv I Paran * RW Michelmore 1992 2.7.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCAR Họ phát triển dấu hiệu SCAR dành riêng cho lồi, dựa trình tự ITS2, tạo khuếch đại 200 bp với mục đích tạo phương pháp nhanh chóng đáng tin cậy để phát di truyền Zanthoxyli đích thực Pericarpium Các dấu hiệu SCAR dành riêng cho lồi phát triển, dựa trình tự ITS2 , tạo khuếch đại 200 bp với mục đích tạo phương pháp nhanh chóng đáng tin cậy để phân loại di truyền Zanthoxyli xác Pericarpium Những dấu hiệu sử dụng để phát triển kỹ thuật xét nghiệm PCR thơng thường thời gian thực phân biệt mẫu cấp độ loài Họ xác nhận số sản phẩm thảo dược bị nhiễm Z armatum bán thị trường Hàn Quốc Trung Quốc với tên gọi Zanthoxyli Pericarpium đánh giá khả chất đánh dấu SCAR việc xác thực dầu ăn thuốc thảo dược Các dấu hiệu SCAR kỹ thuật PCR trình bày công cụ hiệu để ngăn ngừa tạp nhiễm đảm bảo chất lượng ổn định thực phẩm chế biến thuốc thảo dược 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu Phương pháp Nội dung 1: Tìm band đa hình dựa thị SCoT Ly trích DNA theo phương pháp Doyle & Doyle (1987) có hiệu chỉnh Đo OD PCR với 10 thị ScoT Điện di gel Agarose phát band khác biệt Nội dung 2: Tạo dịng đoạn DNA đa hình Thu hồi tinh đoạn khuếch đại từ Agarose gel Gel Extraction Kit Sản phẩm DNA tạo dòng vector pJET1.2/blunt biến nạp vào tế bào Escherichia coli TOP10 theo hướng dẫn nhà sản xuất Khuẩn lạc dương tính xác định PCR( dùng phương pháp biến nạp khả nạp) Nội dung 3: Xác định trình tự band đa hình Tách plasmid gửi giải trình tự đoạn đặc hiệu Nội dung 4: Thiết kế cặp primer dựa trình tự nhận Sử dụng ứng dụng sinh tin chuyên dùng thiết kế primer dựa trình tự nhận Nội dung 5: Kiểm tra xác định độ đặc hiệu cặp primer Xây dựng quy trình PCR cho SCAR primer thiết kế Kiểm tra độ đặc hiệu SCAR primer cà phê robusta 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 4.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Cùng với việc xác thực danh tính lồi, việc dự đốn nồng độ chất thực vật có hoạt tính cần thiết để kiểm soát chất lượng việc sử dụng nguyên liệu thực vật cho mục đích dược phẩm Việc phát triển dấu hiệu SCAR tương quan liệu dấu vân tay DNA với số lượng dấu hiệu hóa học thực vật chọn liên quan đến loại dược liệu cụ thể có ứng dụng rộng rãi việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu thô Những điểm đánh dấu thiết kế hoạt động cơng cụ định tính/định lượng 4.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước So với dấu hiệu phân tử thông thường, SCAR chứng minh đơn giản hơn, có khả tái tạo cao đáng tin cậy sử dụng để nhận dạng thực vật cấp độ nội và/hoặc liên lồi Ngồi ra, SCAR khơng u cầu đồng vị phóng xạ phát locus nhất, cho thấy SCAR có khả tái sản xuất cao đặc trưng cho locus áp dụng nghiên cứu lập đồ lựa chọn hỗ trợ đánh dấu cho đặc điểm kinh tế nông nghiệp di truyền tính kháng sinh học loại trồng khác Nhìn chung, điểm đánh dấu SCAR phương pháp phân biệt kết hợp hiệu mặt chi phí nhờ thủ tục chi phí thấp Overall, the SCAR marker is a cost-effective combined differentiation method due to fewer procedures and lower costs than the CAPS marker Dấu SCAR dễ sử dụng, đáng tin cậy tái tạo, có lợi dấu RAPD việc xác thực dược liệu sử dụng bào chế thuốc cổ truyền Tuy nhiên, dấu hiệu phát triển cho số loại dược liệu Đánh giá nỗ lực nhằm đánh giá nghiêm túc vai trò dấu hiệu SCAR việc xác thực dược liệu sử dụng cơng thức truyền thống Nó nhanh, đáng tin cậy, nhạy cảm với điều kiện phản ứng dễ thực phịng thí nghiệm Nó thực cách sử dụng DNA gen chưa xác định từ giai đoạn phát triển phận thể [5] Do đó, điểm đánh dấu SCAR, sau phát triển, đưa phương pháp thực tế để sàng lọc nhiều mẫu, xác lúc, làm tăng thêm hiệu chi phí thí nghiệm [6] SCAR cho phép phát triển điểm đánh dấu nhanh chóng, chúng khơng có tính đa hình cao Chúng sử dụng làm xét nghiệm mồi liên kết đặc hiệu với alen (ASAP) để phát sản phẩm, ví dụ: xác định phân loài thực vật [7] DNA gen khuếch đại cách sử dụng ASAP nhiệt độ ủ nghiêm ngặt, tạo đoạn DNA cá thể sở hữu alen thích hợp, loại bỏ nhu cầu điện di để giải khuếch đại 17