Đang tải... (xem toàn văn)
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của một số yếu tố tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol, nồng độ ethanol, thời gian đến quá trình trích ly flavonoid tổng và polyphenol tổng từ lá bàng đã được tiến
Kỷ yếu Hội thảo Khoa học TỐI ƯU HOÁ QUÁ TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID VÀ POLYPHENOL TỔNG TỪ LÁ BÀNG VỚI HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải Trường Đại học Cơng nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh * Email: nguyenthithuytram27072001@gmail.com Ngày nhận bài:… ; Ngày chấp nhận đăng: … TÓM TẮT Lá bàng (Terminalia catappa L.) nguyên liệu thực vật giàu hợp chất sinh học có hoạt tính kháng oxy hố mạnh Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng số yếu tố (tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol, nồng độ ethanol, thời gian) đến trình trích ly flavonoid tổng polyphenol tổng từ bàng tiến hành với hỗ trợ sóng siêu âm Q trình tối ưu hố phương pháp bề mặt đáp ứng thu kết Kết tối ưu tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 68,687 (w/v), nồng độ 61,313%, thời gian 125,757 phút Tại điều kiện hàm lượng flavonoid tổng, polyphenol tổng tính kháng oxy hố thu 19,24 ± 0,015 mgQE/g chất khô; 192,24 ± 0,001 mgGAE/g chất khô; 353,01 ± 1,362 mg Trolox/mL Các kết thu tảng cho nghiên cứu sâu Từ khóa: Lá bàng, flavonoid, polyphenol, trích ly, tối ưu hóa MỞ ĐẦU Cây bàng (Terminalia catappa L.) loại nhiệt đới, có nguồn gốc từ Nam Á Lá to, dài khoảng 15 - 25cm rộng 10 - 14cm, có màu xanh sẫm bóng, hình thìa, đầu trịn, mặt nhẵn, mặt có lơng mịn màu nhạt Đây loại có sớm rụng mùa khơ Trước rụng chuyển thành màu đỏ ánh hồng nâu vàng [1] Ở Việt Nam, bàng sử dụng chủ yếu y học cổ truyền dùng để chữa bệnh cảm sốt, mồ hơi, tê thấp, lỵ, trị ghẻ, sâu Ngồi ra, dùng thay cho thuốc kháng sinh để trị loại vi khuẩn nấm cá cảnh [2] Tuy nhiên, công bố khoa học hoạt chất hoạt tính sinh học bàng cịn hạn chế Bên cạnh đó, kỹ thuật siêu âm đánh giá biện pháp đơn giản hiệu phương pháp thông thường để chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ phận khác số loại thực vật Q trình trích ly chất có hoạt tính sinh học saponin, polyphenol, axit amin hay flavonoid cho thấy sử dụng kỹ thuật siêu âm hiệu suất trích ly cao thời gian xử lý ngắn so với không xử lý siêu âm Chính vậy, mục tiêu nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng số thông số công nghệ tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol, nồng độ ethanol, thời gian ủ sau siêu âm đến trình thu nhận flavonoid polyphenol tổng từ bàng thông qua khảo sát đơn yếu tố tối ưu hoá phương pháp bề mặt đáp ứng Các kết tiền đề cho nghiên cứu Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị 2.1.1 Vật liệu Lá bàng (Terminalia catappa L.) thu hái từ đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ vào tháng đến tháng 10 năm 2022 Lá bàng đảm bảo độ trưởng thành thu hái, có màu xanh đậm Khi tiếp nhận mẫu tiến hành phân loại, làm sạch, để sau sấy tủ sấy đối lưu nhiệt độ 60oC giờ, độ ẩm mẫu đạt 6% Mẫu sau sấy khô đánh giá độ ẩm tiến hành xay nhỏ máy nghiền khô rây qua rây có kích thước ≤ 0,3mm Mẫu sau bảo quản túi zip PA bảo quản tủ lạnh từ 4-8oC đến sử dụng 2.1.2 Hoá chất Thuốc thử Folin-ciocalteu's phenol reagent (Merk), 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Ethanol 60% (Chemsol), Aluminum chloride 97%, Natri hydroxit 96%, Sodium nitrat, Quercetin - Sigma 98%, nước cất lần, hoá chất sử dụng đạt chuẩn phân tích 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát q trình trích ly đơn yếu tố với hỗ trợ siêu âm Cân xác 1,00g bột bàng nghiền cho vào bình tam giác sau bổ sung ethanol với tỷ lệ nồng độ cố định Kế đến trình xử lý siêu âm tiến hành thiết bị siêu âm Elma S300H (Đức) với thông số nhiệt độ mẫu 50 oC, tiến hành siêu âm với công suất 300W với tần số 37kHz 10 phút Sau đó, mẫu sau siêu âm cho vào bể ổn nhiệt 50oC (Memmert Đức), ủ 60 phút, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút để thu dịch Phần dịch xác định hàm lượng flavonoid polyphenol tổng Một số thông số khảo sát tiến hành sau: - Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol: mẫu thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol là: 1,00/20; 1,00/40; 1,00/60; 1,00/80; 1,00/100 (w/v), cố định thông số nồng độ cồn 60%, thời gian trích ly 60 phút - Ảnh hưởng nồng độ ethanol: mẫu thay đổi nồng độ ethanol là: 0% ,10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99,5%, thông số tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol chọn từ khảo sát trên, cố định thời gian trích ly 60 phút - Ảnh hưởng thời gian trích ly: mẫu thay đổi thời gian trích ly là: 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 (phút), thông số tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol nồng độ ethanol chọn từ khảo sát Trong nghiên cứu này, yếu tố khảo sát phương pháp đơn yếu tố Cụ thể, yếu tố khảo sát độc lập Khi yếu tố khảo sát yếu tố cịn lại cố định mức lựa chọn Chỉ tiêu đánh giá hàm lượng flavonoid polyphenol tổng có dịch trích Các yếu tố khảo sát là: Các yếu tố thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol (1,00/20; 1,00/40; 1,00/60; 1,00/80; 1,00/100), nồng độ ethanol theo tỷ lệ (0% ,10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99,5%) thông số thời gian với biến (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 phút) Kết thí nghiệm trước điều kiện sử dụng cho thí nghiệm Các thí nghiệm lặp lại lần 2.2.2 Tối ưu hoá q trình trích ly phương pháp bề mặt đáp ứng Q trình tối ưu hóa ba yếu tố phương pháp bề mặt đáp ứng Response Surface Design (RSD) theo mơ hình trực giao cấp có tâm xoay với 17 thí nghiệm có thí nghiệm tâm, quy hoạch theo mơ hình Central Composite Face (CCF) tiến hành với hỗ trợ phần mềm Modde 5.0 Các mức thí nghiệm thể qua bảng mã hóa (Bảng 1) với hàm mục tiêu hàm lượng flavonoid polyphenol tổng dịch trích ly (Y) Mơ hình dạng tồn phương bậc hai theo hàm lượng flavonoid polyphenol tổng xác định hồi quy đa biến, có dạng: Y (%) = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X12 + b22X22 + b33X32 + b12(X1X2) + b13(X1X3) + b23(X2X3) Trong đó: b0, b1, b2, b3, b11, b22, b33, b12, b13, b23 hệ số biến X1, X2, X3, X11, X22, X33, X1X2, X1X3, X2X3 tương ứng 2.2.3 Chuẩn bị chế phẩm cao bàng Dịch bàng xử lý điều kiện tối ưu tiến hành cô quay chân không nhiệt độ 50oC áp suất 150mmHg thiết bị Eyela (Nhật Bản) Quá trình thực hệ số cô đặc đạt 50 lần Lúc này, chế phẩm tạo thành xác định hàm lượng flavonoid polyphenol tổng với khả kháng oxy hóa theo DPPH 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Xác định hàm lượng flavonoid: Xác định hàm lượng flavonoid (TFC) phản ứng tạo phức màu với AlCl3 môi trường kiềm theo mô tả (của Marinova et al (2005))[3] Hàm lượng flavonoid xác định phương pháp quang phổ với bước sóng 510 nm tạo phức với AlCl3 (A Pekal and K Pyrzynska (2014)[4] Hàm lượng biểu thị miligam quercetin tương đương 1,00g chất khô nguyên liệu (mgQE/chất khô) 2.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng: Hàm lượng polyphenol tổng (TPC) xác định theo mô tả Yadav Agarwala (2011)[5] Đo quang phổ bước sóng 765 nm với chất chuẩn Folin-ciocalteu's phenol reagent (Merk) Hàm lượng biểu thị miligam acid gallic tương đương 1,00g chất khô nguyên liệu (mgGAE/chất khô) 2.3.3 Xác định khả kháng oxy hóa: Khả kháng oxy hóa theo DPPH chế phẩm xác định theo phương pháp Termin Payum cộng (2015) với số cải tiến [6] Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1mL dịch cô đặc nồng độ khác kết hợp với 2,9 mL dung dịch DPPH Sau đó, hỗn hợp lắc ủ tránh ánh sáng, nhiệt độ phòng 30 phút Cuối cùng, hỗn hợp sau phản ứng đo độ hấp thu bước sóng λ = 517 nm Khả kháng oxy hóa chế Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải phẩm quy tương đương với lượng Trolox có đơn vị thể tích (mg Trolox/ml) 2.3.4 Xác định số thành phần hóa học dịch trích phương pháp GC – MS Dịch chiết phân tích thành phần hóa học phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC – MS) theo nghiên cứu Mohd F A Bakar cộng với số hiệu chỉnh [7] Dịch trích bàng ethanol sau làm khô Na2SO4 bơm vào hệ thống sắc kí Agilent 7890A ghép với khối phổ (cơng nghệ Agilent) Q trình phân tách mẫu diễn cột DB-5MS (30ml.x0,25 mm i.d., bề dày 0,25m) Điều kiện hoạt động hệ thống GC – MS theo trình tự sau: nhiệt độ tăng từ 50 – 260oC với tốc độ 10oC/phút, sau giữ đẳng nhiệt 10 phút Mẫu bơm vào thiết bị với thể tích L, khí Heli khí mang, tốc độ 1ml/phút Phổ sắc ký vận hành 70 eV, tổng thời gian thực cho trình sắc ký 35 phút Những hợp chất định danh GC – MS so sánh với hợp chất nằm liệu ngân hàng NIST 2.4 Phương pháp phân tích số liệu Trong nghiên cứu này, thí nghiệm tiến hành lặp lại lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Phân tích phương sai nhân tố kiểm định LSD để đánh giá khác biệt nghiệm thức với mức ý nghĩa 5% tiến hành với hỗ trợ phần mềm Minitab 19 Bố trí thí nghiệm xử lý số liệu tối ưu hoá thực với phần mềm Modde 5.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol: Tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol có ảnh hưởng đến q trình trích ly TFC TPC từ ngun liệu bàng (hình hình 2) Khi tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol tăng từ 1/20 đến 1/60 (w/v), hàm lượng TFC TPC tăng xấp xỉ 1,4 lần 1,5 lần mẫu siêu âm mẫu không siêu âm Tuy nhiên, tỷ lệ tiếp tục tăng đến 1/80 hàm lượng TFC TPC khơng tăng đáng kể có xu hướng tiệm cận ngang Quy luật tìm thấy nghiên cứu đối tượng táo mèo (Docynia indica) tác giả Nguyễn Thị Thu Phương cộng [8] Lý kết chênh lệch gradient nồng độ cấu tử trích ly nguyên liệu dung môi Khi tăng lượng dung mơi chênh lệch gradient nồng độ lớn làm cho cấu tử trích ly bên nguyên liệu tiếp xúc với dung môi nhiều dẫn đến khả khuếch tán tăng cao Tuy nhiên, khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định nên tăng lượng dung mơi đến ngưỡng hàm lượng chất chiết khơng cịn tuyến tính với lượng dung môi thêm vào Điều tương tự ghi nhận nghiên cứu Xiao cộng [9] Hình cho thấy trình siêu âm hỗ trợ cho q trình trích ly hợp chất sinh học TFC TPC từ bàng Đối với mẫu siêu âm hàm lượng chất thu nhiều so với mẫu không siêu âm cụ thể tỷ lệ 1/60, ta thấy hàm lượng TFC TPC cao 19,419 ± 0,305 (mgQE/g); 224,667 ± 2,250 (mgGAE/g) cao xấp xỉ 1,08 lần hàm lượng TFC 1,362 lần mẫu không siêu âm Lý giải cho chênh lệch tượng vỡ bóng khí dịch lỏng, bóng khí lớn dần lên đạt đến thể tích mà chúng khơng thể nhận lượng chúng vỡ cách đột ngột, tạo nhiệt độ áp suất cao vị trí gây nứt vỡ thành tế bào chất chiết làm cho cấu tử giải phóng vào dung mơi dễ dàng Từ phân tích trên, tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/60 chọn cho q trình trích ly để thu hiệu cao Hình Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol đến hàm lượng flavonoid tổng Hình Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol Trong thí nghiệm này, dung mơi ethanol sử dụng với nồng độ khác nhau: từ 0%, đến 99,5% (v/v) Tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/60 (w/v), nhiệt độ chiết 50oC thời gian chiết 60 phút Kết phân tích hàm lượng flavonoid polyphenol tổng số trình bày hình hình Hàm lượng flavonoid tổng (TFC) polyphenol (TPC) tăng dần đạt giá trị cao nồng độ ethanol 60% (19,12 ± 0,144 mgQE/g 225,7 ± 4,170 mgGAE/g) Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 70%, TFC 17,41 ± 0,083 (mg QE/g) TPC 189,85 ± 2,590 (mg GAE/g) hàm lượng có xu hướng giảm xuống, (Lưu Hồng Sơn tối ưu hoá q trình trích ly flavonoid từ chè Cao Bằng)[10] Nhận thấy hàm lượng flavonoid cao nồng độ ethanol 60%, điều liên quan mật thiết đến số điện mơi, nước dung mơi có số điện môi giá trị liên kết hydro cao ethanol Vì vậy, trộn nước với ethanol làm tính phân cực dung môi giảm xuống ngược lại tỷ lệ phối trộn ethanol cao hỗn hợp dung mơi có tính phân cực cao hiệu suất trích ly tỷ lệ thuận với độ phân cực hợp chất chống oxy hoá ethanol tác nhân làm tăng độ hòa tan chất chống oxy hoá mẫu Nếu nồng độ đồng dung môi tăng nhiều làm giảm hiệu trích ly tăng nồng Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải độ dung mơi làm tăng lưu lượng dịng chảy dung mơi qua mẫu nhanh làm cho tốc độ trích ly chất tan từ nguyên liệu gia tăng lưu lượng dịng dung mơi q nhiều chất tan dung môi chưa kịp liên kết với Do đó, hiệu trích ly bị giảm xuống theo nghiên cứu Mauricio A Rostagno and Juliana M Prado (2013) [11] Hình Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng flavonoid (mg/g) Hình Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol (mg/g) 3.3 Ảnh hưởng thời gian trích ly Thời gian trích ly yếu tố khơng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly mà cịn ảnh hưởng đến chi phí đặc biệt chất lượng dịch chiết Chúng tiến hành chiết xuất flavonoid polyphenol thời gian sau: từ đến 240 phút Nồng độ ethanol 60%, nhiệt độ chiết 50oC tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/60 (w/v) Qua phân tích hàm lượng flavonoid polyphenol tổng số trình bày Hình hình Xác định thời gian q trình trích ly cần thiết để lấy hầu hết hợp chất sinh học mong muốn Thường, thời điểm cân bên bên tế bào thiết lập Nếu thời gian trích ly ngắn, lượng hoạt chất sinh học khơng trích ly hồn tồn, thời gian q dài hoạt chất bị oxy hóa, chất lượng số lượng hoạt chất giảm Kết khảo sát cho thấy, hàm lượng TPC hàm lượng TFC đạt cao 225,09 ± 3,748 mgGAE/g 20,94 ± 0,944 mgQE/g thời gian chiết xuất 120 phút Tuy nhiên, lượng TPC giảm nhiều khoảng từ 30 tới 45 phút chiết xuất nên ta chọn thời gian tối ưu cho nghiên cứu 120 phút Kích thước nguyên liệu yếu tố quan trọng đánh giá hiệu suất trích ly với nguyên liệu nhỏ diện tích tiếp xúc cao, kết tương tự với Wenjuan Qu, Zhongli Pan, Haile Ma hàm lượng phenolic tăng đáng kể với việc giảm kích thước ngun liệu q trình chiết xuất chất chống oxy hoá từ bã nho [12] Landbo Meyer cho kết tương tự [13], dùng để đánh giá cao chiết thu Kết cho thấy kéo dài thời gian chiết không lớn, tăng lượng flavonoid tổng số dịch chiết mà cịn giảm xuống tác động nhiệt độ thời gian dài làm phần flavonoid tổng số có dịch trích bị phá hủy [14] Kết giải thích định luật thứ hai Fick khuếch tán dự đoán trạng thái cân cuối nồng độ chất tan ma trận chất rắn dung mơi đạt sau thời gian định Hình Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng Flavonoid (mg/g) Hình Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng Polyphenol (mg/g) 3.4 Tối ưu hố thơng số q trình trích ly Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách, nhận thấy nồng độ ethanol, thời gian chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận hợp chất sinh học từ bàng Dựa vào bảng mã hoá yếu tố cố định từ thí nghiệm trên, sau chạy phần mềm thiết kế Minitab 19 với phương pháp bề mặt đáp ứng RSD theo mơ hình Box Behnken đầy đủ thu bảng ma trận với 17 thực nghiệm để xác định hàm kì vọng Mỗi thí nghiệm có ba lần lặp lại hàm mục tiêu tương ứng flavonoid tổng số Kết thu trình bày bảng Kết phân tích ANOVA thể bảng Từ bảng kết quả, nhận thấy: Đối với hàm lượng flavonoid tổng, giá trị p-value mơ hình < 0,001 chứng tỏ mơ hình có ý nghĩa Hệ số hồi quy R2 = 0,9486 Hệ số hồi quy R2 gần mơ hình có ý nghĩa Kết cho thấy có 94,86% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đốn mơ hình Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol, thời gian, tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol đến hàm lượng polyphenol flavonoid tổng bàng thực nghiệm mơ hình dự đốn trình bày Bảng Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải Bảng 1: Bảng ma trận quy hoạch thực nghiệm kết Biến mã hóa STT X1 X2 Biến thực X3 Y1 Y2 Tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol (w/v) Nồng độ Ethanol Thời gian xử lý (phút) Hàm lượng Flavonoid (mgQE/g) Hàm lượng Polyphenol tổng (mgGAE/g) -1 -1 40 70 90 16,01±0,050 191,09±2,265 -1 -1 -1 40 50 90 15,28±0,012 185,81±4,145 0 -1 60 60 90 18,02±0,032 209,09±2,216 1 -1 80 70 90 16,99±0,264 199,54±8,256 -1 -1 80 50 90 15,97±0,021 188,22±3,125 -1 0 40 60 120 18,44±0,036 213,73±4,215 70 120 17,86±0,214 207,39±2,134 60 0 60 60 120 19,98±0,411 234±3,215 0 60 60 120 19,98±0,321 234±3,216 10 -1 60 50 120 17,48±0,064 205,69±5,254 11 0 60 60 120 19,98±0,084 234±1,634 12 0 80 60 120 19,17±0,064 216,15±5,216 13 -1 1 40 70 150 16,26±0,843 197,13±3,141 50 150 15,79±0,074 187,69±5,215 14 -1 -1 40 15 0 60 60 150 19,22±0,354 220,41±4,136 16 -1 80 50 150 16,12±0,554 194,26±3,254 17 1 80 70 150 17,06±0,354 201,05±3,55 Bảng Kết phân tích ANOVA flavonoid polyphenol Analysis of Variance Flavonoid Source DF F-Value P-Value Model 35.3866 3.93185 34.9 3291.69 365.743 14.35 0.001 Linear 1.8277 0.60923 5.41 0.031 211.69 70.562 2.77 0.121 X1 1.5716 1.57158 13.95 0.007 184.56 184.56 7.24 0.031 X2 0.1058 0.10576 0.94 0.365 19.46 19.456 0.76 0.411 X3 0.244 0.244 2.17 0.185 18.56 18.564 0.73 0.422 Square 29.7068 9.90228 87.9 2822.29 940.763 36.91 X1*X1 1.0922 1.09225 9.7 0.017 148.97 148.965 5.84 0.046 X2*X2 9.5207 9.52066 84.51 814.43 814.428 31.95 0.001 2.2108 2.2108 19.63 0.003 218.22 218.216 8.56 0.022 0.1517 0.05057 0.45 0.726 4.86 1.62 0.06 0.977 X1*X2 0.0322 0.03222 0.29 0.609 0.003 0.992 X1*X3 0.0433 0.04329 0.38 0.555 1.14 1.142 0.04 0.838 X2*X3 0.0425 0.04251 0.38 0.558 3.97 3.969 0.16 0.705 X3*X3 2-Way Interaction Adj SS Adj MS Analysis of Variance Polyphenol Adj SS Adj MS F-Value P-Value Error 0.7886 0.11265 Lack-of-Fit 0.4978 0.09957 Pure Error 0.2907 0.14536 16 36.1752 Total 0.68 0.683 178.42 25.489 125.66 25.133 52.76 26.379 0.95 0.584 3470.11 Mơ hình dạng tồn phương có dạng: Y1 = − 71,86 + 0,2008.X1 − 0,00119.X12− 0,01778.X22− 0,000705.X32 Y1 = − 650 + 21,01X2 − 0,01841.X12− 0,1701.X22− 0,00979.X32 Từ phương trình hồi quy cho thấy yếu tố nồng độ dung mơi có ảnh hưởng tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid tổng thu nhận Hàm lượng flavonoid polyphenol tổng dịch chiết khơng có ảnh hưởng tương tác yếu tố phân tích ANOVA cho thấy (2-Way Interaction > 0,05) khơng có ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu Nhìn chung, yếu tố ảnh hưởng đến việc thu flavonoid trình chiết xuất hệ số hồi quy X2 có giá trị dương lớn nhất, cho thấy X2 có tác động tích cực đến hàm lượng flavonoid tổng polyphenol tổng thu Dựa phương trình hồi quy mơ hình, sử dụng cơng cụ tối ưu hóa phần mềm Modde 5,0 cho phép xác định giá trị hàm lượng flavonoid chiết mong muốn giá trị tương ứng yếu tố liên quan Theo Gabrielsson cộng (2002)[17], giá trị R2 khoảng 0,8 - 0,9, giá trị Q2 lớn 0,5 giá trị tốt Kết thực nghiệm có giá trị Q2 = 0,887 R2 = 0,980 mơ hình flavonoid Kết thực nghiệm có giá trị Q2 = 0,748 R2 = 0,953 cho thấy mơ hình hồi quy phù hợp đáng tin cậy Phương trình hồi quy biểu diễn trục tọa độ không gian ba chiều hai chiều hình hình Hình Đồ thị đáp ứng bề mặt đáp ứng (a,b,c) đường đồng mức (d,e,f) thể ảnh hưởng yếu tố lên hàm lượng Flavonoid thu ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol nồng độ ethanol (a d); ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol thời gian trích ly sau siêu âm (b, e); ảnh hưởng nồng độ ethanol thời gian trích ly sau siêu âm (c f) Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải Hình Đồ thị đáp ứng bề mặt đáp ứng (a,b,c) đường đồng mức (d,e,f) thể ảnh hưởng yếu tố lên hàm lượng Polyphenol thu ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol nồng độ ethanol (a d); ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol thời gian trích ly sau siêu âm (b, e); ảnh hưởng nồng độ ethanol thời gian trích ly sau siêu âm (c f) Hình hình thể tương hỗ cặp yếu tố dựa vào phương trình Y1 xác định điều kiện tối ưu yếu tố ảnh hưởng làm cho hàm đáp ứng đạt giá trị cực đại Cụ thể, hàm lượng flavonoid polyphenol đạt giá trị cực đại 20,26 ± 0,042 (mgQE/g); 234,21 ± 3,16 (mgGAE/g) trích ly điều kiện công suất siêu âm 20KHz, thời gian siêu âm 10 phút điều kiện tối ưu flavonoid có thời gian trích ly 122,72 phút, nồng độ ethanol 60,91%, tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/65,45 (w/v) với mẫu polyphenol thời gian trích ly sau siêu âm 123,33 phút với dung môi ethanol 69,9%, tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/62,63 (w/v) Để kiểm chứng, thí nghiệm điều kiện tối ưu hóa tiến hành (lặp lại lần), Kết thực nghiệm thu hàm lượng flavonoid 19,41 ± 0,251 Hơn nữa, so với kết thí nghiệm tối ưu hóa dự đốn có chênh lệch khoảng 1,02% (19,41 so với 19,86) Như vậy, trình quy hoạch thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu giúp làm tăng hiệu việc trích ly flavonoid Ngồi ra, việc xử lý siêu âm điều kiện tối ưu giúp tăng hiệu trích ly, tiết kiệm thời gian so với phương pháp trích ly truyền thống khơng hỗ trợ siêu âm (chỉ trích ly dung mơi ethanol) với điều kiện trích ly tối ưu tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1/65,454, nồng độ cồn 60,903%, thời gian trích ly 122,721 phút Mẫu khơng siêu âm có hàm lượng thấp 19,27% so với mẫu trích ly có hỗ trợ siêu âm Từ ta thấy phần hiệu trình siêu âm đến hàm lượng chất tan thu 3.5 Khả kháng oxy hoá Dịch chiết bàng sau trích ly điều kiện tối ưu với hỗ trợ siêu âm phương pháp trích ly tiến hành xác định hoạt tính kháng oxy hóa Kết thu 0,1 mL dịch chiết có khả kháng oxy hóa tương đương 6,32g Trolox mẫu siêu âm 2,55g Trolox mẫu không siêu âm Hơn nữa, kết phân tích GC – MS dịch chiết từ bàng với hỗ trợ siêu âm cho thấy có 10 hợp chất tìm thấy (Hình 9, Bảng 2) Trong đó, hợp chất 1,2,3Benzenetriol (9) (thời gian = 22.67 phút; diện tích peak = 12.803%) chất chiếm tỷ lệ cao Theo nghiên cứu trước đây, hợp chất 1,2,3-Benzenetriol tìm thấy từ chiết xuất Emblica officinalis có tác dụng chống tăng sinh số dòng tế bào ung thư người [15] Ngoài ra, 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one (5) cịn tìm thấy mận khơ (prunes) có khả kháng oxy hóa [16] Thêm vào đó, Anhydro-dmannosan hợp chất có Knoxia sumatrensis có đặc tính chống oxy hóa (17) Bảng Thành phần hợp chất hóa học dịch chiết bàng Peak Hợp chất Thời gian (phút) Công thức Diện tích peak (%) n-Pentanal 4.82 C5H10O 0.870 Ethyl carbonate 9.33 C5H10O3 0.435 Butyric acid, 4-chloro 11.99 C4H7ClO2 0.495 5-methyl furfural 13.43 C6H6O2 0.647 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6methyl-4H-pyran-4-one 18.06 C6H8O4 2.690 3,4-Dihydroxydihydro-2(3H)furanone 18.39 C4H6O4 1.567 2-Furancarboxaldehyde, 5(hydroxymethyl)- 19.65 C6H6O3 2.569 Benzocyclooctene, 7,8dimethyl- (CAS) 21.71 C14H14 0.718 1,2,3-Benzenetriol 22.67 C6H6O3 12.803 10 Anhydro-d-mannosan 25.09 C6H10O5 1.193 Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải Hình 9: GC - MS dịch chiết bàng KẾT LUẬN Kỹ thuật siêu âm hỗ trợ cho q trình trích ly sử dụng để nâng cao hiệu trích ly flavonoid polyphenol tổng từ bàng Kết nghiên cứu cho thấy tăng tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol (từ 1,00/20 (w/v) đến 1,00/60 (w/v)) nồng độ ethanol trích ly (từ 0% đến 60%) hàm lượng hợp chất sinh học (phenolic, flavonoid) dịch trích có xu hướng tăng Điều kiện trích ly tối ưu lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1,00/60 (w/v) nồng độ ethanol trích ly 60% dịch trích ly thu có hàm lượng hợp chất sinh học, chất màu hoạt động chống oxy hóa cao có giá trị kinh tế Tại điều kiện trích ly này, hàm lượng phenolic, flavonoid ABTS thu 129,63 mgGAE/100 g; 19,27 mgQE/g; 6,32 mg Trolox/mL Kỹ thuật siêu âm hỗ trợ hiệu cho q trình trích flavonoid polyphenol tổng từ bàng Điều kiện trích ly tối ưu tỷ lệ nguyên liệu/ ethanol 1,00/60 (w/v) nồng độ ethanol trích ly 60% dịch trích ly thu có hàm lượng hợp chất sinh học, chất màu hoạt động chống oxy hóa cao có giá trị kinh tế Tại điều kiện trích ly này, hàm lượng phenolic, flavonoid ABTS thu 129,63 mgGAE/100 g; 19,27 mgQE/g; 6,32 mg Trolox/mL TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Võ Văn Chi từ điển thuốc Việt Nam (NXB y học 2019) (Trang 45-59.) [2] Võ Thị Thanh Kiều - Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hoá học số dịch chiết nhân bàng [3] Marinova et al Total phenolics and flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables (2005) [4] A Pekal and K Pyrzynska “Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content Assay” (2014) [5] Yadav, R.N.S and Agarwala, M (2011) Phytochemical Analysis of Some Medicinal Plants Journal of Phytology, 3, 10-14 [6] Termin Payum, Chandantamuly, Rama Shankar and Moushumi Hazarika – Antioxidant Potential of Solanum spirale Shoot and Berry; A medicinal Food Plants Used in Arunachal Pradesh (2015) [7] Mohd Fadzelly Abu Bakar et al., - Phytochemical Composition and Biological Activities of Selected Wild Berries (Rubus moluccanus L., R.fraxinifolius Poir., and R alpestris Blume 2016 [8] Nguyễn Thị Thu Phương cộng “Nghiên cứu tối ưu hoá chiết xuất hợp chất phenolic flavonoid từ táo mèo (docynia indica) đông khơ thơng qua hỗ trợ vi sóng” (2021) [9] Xiao, W., Han, L., & Shi, B (2008) Microwaveassisted extraction of flavonoids from Radix astragali Separation and Purification Technology, 62(3), 614-618 [10] Wenjuan Qu, Zhongli Pan, and Haile Ma - Extraction modeling and activities of antioxidants from pomegranate marc, Journal of food engineering, 99 (2010) 16-23 [11] Vũ Hồng Sơn Hà Dun Tư, 2009 Nghiên cứu q trình trích ly polyphenol từ vụn chè xanh Tạp chí Khoa học Công nghệ, 47 (2): 39-46 [11] Natural product extraction principles and applications / edited by Mauricio A Rostagno and Juliana M Prado [12] Wenjuan Qu, Zhongli Pan, Haile Ma “Q trình chiết xuất chất chống oxy hố từ bã nho” [13] Landbo Meyer Antioxidant Effects of Phenolic Rye (Secale cereale L.) Extracts, Monomeric Hydroxycinnamates, and Ferulic Acid Dehydrodimers on Human Low-Density Lipoproteins [14] Đặng Thanh Long - Ảnh hưởng số yếu tố lên trình tách chiết flavonoid toàn phần từ hạt sen phương pháp siêu âm bể [15] Chih-Jen Yang, et al - Pyrogallol induces G2-M arrest in human lung cancer cells and inhibits tumor growth in an animal model [16] Cechovska, L., Cejpek, K., Konecny, M et al On the role of 2,3-dihydro-3,5dihydroxy-6-methyl-(4H)-pyran-4-one in antioxidant capacity of prunes [17] Settu Loganathan, et al - Phytochemical and Pharmacological Evaluation of Methanolic Extract of Knoxia sumatrensis Leaves ABSTRACT OPTIMIZATION OF ULTRASOUND-ASSISTED FLAVONOID ISOLATION FROM THE LEAVES OF BANG BY ETHANOL Nguyen Thị Thuy Tram, Tran Van Thanh , Ths Tran Chi Hai Ho Chi Minh City University of Food Industry Nguyễn Thị Thùy Trâm, Trần Văn Thanh, Ths Trần Chí Hải Email: nguyenthithuytram27072001@gmail.com Terminalia catappa L are a plant material rich in biological compounds with strong antioxidant activity In this study, the influence of a number of factors (material/solvent ratio, solvent concentration, time) on the extraction of total flavonoids and total polyphenols from the leaves was conducted with the support of ultrasonic waves The optimization process by response surface method has obtained results The optimal result of the material/solvent ratio is 68,687 (w/v), the concentration is 61,313%, the time is 125,757 minutes At this condition, the content of total flavonoids, total polyphenols and antioxidant properties were 19,24 ± 0,015 mgQE/g dry matter, respectively; 192,24 ± 0,001 mgGAE/g dry matter; 353,01 ± 1,362 mg Trolox/mL The obtained results form the basis for further studies Keywords: Terminalia catappa L., flavonoid, polyphenol, extraction process, optimized