Đang tải... (xem toàn văn)
BÀI 1. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME αAMYLASE CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT I.MỤC ĐÍCH YÊU CẦU Hiểu được cơ chế hoạt động của enzyme αamylase trong phản ứng thủy phân tinh bột. Khảo sát khả năng ức chế enzyme amylase của cao chiết thực vật. II. THỰC HÀNH 1.Chuẩn bị a. Pha dung dịch đệm phosphate natri, pH 7 Lần lượt pha hai dung dịch (a) và (b) theo công thức sau: + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000mL. + Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000mL. Lấy 39 mL dung dịch (a) cho vào bình định mức 100mL, thêm dung dịch (b) cho đến vạch. Thu được dung dịch đệm phosphate natri pH 7. b. Chuẩn bị cao chiết Cân chính xác 10 mg cao chiết cho vào eppendorf tube 1mL rồi thêm 1mL DMSO. Lắc đều cho tan hoàn toàn thu được dung dịch cao chiết có nồng độ 10.000 µgmL (xem như dung dịch gốc). Tiến hành pha loãng dung dịch gốc thành dãy nồng độ như sau :400, 800, 1600 và 3200 µgmL theo Bảng 1.1.
BÀI KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT I.MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Hiểu chế hoạt động enzyme α-amylase phản ứng thủy phân tinh bột - Khảo sát khả ức chế enzyme amylase cao chiết thực vật II THỰC HÀNH 1.Chuẩn bị a Pha dung dịch đệm phosphate natri, pH - Lần lượt pha hai dung dịch (a) (b) theo công thức sau: + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan định mức đến 1000mL + Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức đến 1000mL - Lấy 39 mL dung dịch (a) cho vào bình định mức 100mL, thêm dung dịch (b) vạch Thu dung dịch đệm phosphate natri pH b Chuẩn bị cao chiết - Cân xác 10 mg cao chiết cho vào eppendorf tube 1mL thêm 1mL DMSO - Lắc cho tan hoàn toàn thu dung dịch cao chiết có nồng độ 10.000 µg/mL (xem dung dịch gốc) - Tiến hành pha loãng dung dịch gốc thành dãy nồng độ sau :400, 800, 1600 3200 µg/mL theo Bảng 1.1 Bảng 1.1 Hướng dẫn pha loãng cao chiết Nồng độ cao chiết µg/mL Thể tích dung dịch gốc (µL) Thể tích DMSO 10%( µL) 400 20 480 800 40 460 1600 80 420 3200 160 340 Ghi : Nên sử dụng dung dịch có nồng độ lớn để pha lỗng thành dung dịch có nồng độ thấp để giảm sai số c Pha dung dịch tinh bột - Cân xác 20 mg tinh bột cho vào cốc thủy tinh ,thêm 10 mL nước cất , khuấy - Đun lò vi sóng tinh bột tan hồn tồn - Dung dịch tinh bột thu có nồng đồ 2mg/mL, dung dịch cần để nguội hoàn toàn trước sử dụng d Pha enzyme α-amylase - Cân xác 2mg enzyme α-amylase cho vào eppendorf thêm vào 2mL dung dịch đệm phosphate natri pH - Dung dịch enzyme thu có nồng độ 1mg/mL tương đương 30 U/mL (U) Sau rút 100 µL enzyme α-amylase 30 U vào eppendorf tube 1mL rút thêm 900 µL dung dịch đệm phosphate pH=7 vào đánh lên thu dung dịch enzyme α-amylase nồng độ U dùng cho thí nghiệm Xác định khả ức chế enzyme amylase cao chiết - Đánh số ống eppendorf từ đến - Lần lượt thực cho vào ống eppendorf thực bước thí nghiệm trình bày Bảng 1.2 Bảng 1.2 Các bước thử nghiệm ức chế enzyme α-amylase cao chiết thực vật Hóa chất Ống Ống Ống Ống Ống Ống Đệm phosphate Cao chiết DMSO 10% Đệm phosphate Enzyme αamylase (3U) Đệm phosphate 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL, Nồng độ 400 µg/mL 100 µL Nồng độ 800 µg/mL 100 µL Nồng độ 1600 µg/mL 100 µL Nồng độ 3200 µg/mL 100 µL - - - 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL - Ống 100 µL 100 µL - - - 100 µL - 100 µL 50 µL 50 µL - - o Ủ hỗn hợp phản ứng 37 C phút Tinh bột 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL Hỗn hợp phản ứng tiếp tục ủ 37oC 15 phút HCl đậm đặc 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL Thuốc thử iod 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL Đo OD bước sóng 660 nm 100 µL 200 µL 300 µL Ghi chú: “-” khơng thêm vào Khả ức chế enzyme α-amylase cao chiết nồng đồ xác định biểu diễn thông qua hiệu suất phản ứng thủy phân tinh bột dựa vào lượng tinh bột thừa sau ngừng phản ứng thủy phân Lượng tinh bột thừa kiểm tra thông qua phản ứng màu với iod Hiệu suất phản ứng tính theo cơng thức: Hiệu suất phản ứng (%) = Ac - As Ac x100 Trong đó: Acontrol hay Ac giá trị mật độ quang dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu) (Ống 7) Asample hay As giá trị mật độ quang dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột lại sau phản ứng) Ac lớn As Hiệu suất ức chế lượng enzyme bị ức chế phản ứng Hiệu suất ức chế (%) = 100% - hiệu suất phản ứng (%) Do cao chiết có màu nên ảnh hưởng đến kết khảo sát , cần đo quang phổ cao chiết: Ta thực sau: chuẩn bị ống 2’, 3’, 4’ , 5’ thay dung dịch (enzyme, tinh bột, HCl đậm đặc, thuốc thử Iod) đệm phosphate (Bảng 1.3) Độ hấp thu quang phổ thực bằng: Ống 2-2’ ; Ống 3-3’ ; Ống 4-4’ ; Ống 5-5’ Bảng 1.3 Các bước thử nghiệm ảnh hưởng cao chiết đến giá trị Abs Hóa chất Ống 2’ Ống 3’ Ống 4’ Đệm phosphate 750 µL 750 µL 750 µL 100 µL, nồng 100 µL, nồng 100 µL, nồng Cao chiết độ 400 µg/mL độ 800 µg/mL độ 1600 µg/mL Đo OD bước sóng 660 nm III BÁO CÁO KẾT QUẢ Biểu diễn kết Hình 1.1 Đo OD bước sóng 660 nm Ống 5’ 750 µL 100 µL, nồng độ 3200 µg/mL - Bảng biểu thị mật độ quang phần trăm ức chế dung dịch cao chiết thực vật Nồng độ Cao chiết Ống eppendorf Abs % ức chế µg/mL 0.257 400 0.338 34.77 800 0.453 46.60 1600 0.623 64.09 3200 0.698 71.81 0.886 0.972 - Dựa vào bảng số liệu ta vẽ đồ thị sau : Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế theo nồng độ cao chiết Tính giá trị IC50: Từ phương trình đường chuẩn “y= 0,0125x + 35,529” suy giá trị IC50 cao chiết 50 – 35,529 IC50 = = 1157.7 ( mg/ml) 0,0125 Nhận xét khả ức chế emzyme cao chiết: - Khả ức chế enzyme α-amylase cao chiết xác định dựa vào lượng tinh bột lại sau phản ứng thủy phân để đánh giá mức độ thủy phân enzyme α-amylase - Sau phản ứng lượng tinh bột cịn lại nhiều khả ức chế α-amylase cao chiết cao, kết từ ống đến ống nồng độ cao chiết tăng dần mẫu dung dịch từ không màu (ống đối chứng ) chuyển dần sang xanh tím ống 2,3,4,5) => chứng tỏ lượng lượng tinh bột thừa sau phản ứng tăng dần ( tinh bột kết hợp với iod-tinh bột có màu xanh) => giá trị Abs tăng dần - Phần trăm ức chế tăng dần nồng độ cao chiết tăng dần suy hiệu ức chế α-amylase tăng nồng độ cao chiết tăng Do cao chiết có khả ức chế enzyme α-amylase làm cho enzyme khả thủy phân tinh bột - Ảnh hưởng DMSO: Ta nhận thấy độ hấp thu quang phổ ống ( khảo sát DMSO có ảnh hưởng hoạt động enzyme ) ống (đối chứng ) nên % ức chế = 0% => Vì DMSO khơng làm giảm hiệu suất phản ứng thủy phân tinh bột BÀI - CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH A CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY I MỤC ĐÍCH U CẦU: - Biết cách chuẩn bị mơi trường nuôi cấy vi khuẩn khảo sát khả kháng khuẩn - Biết cách khử trùng môi trường chuẩn bị môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn.1 II THỰC HÀNH Pha chế môi trường - Môi trường LB Broth powder (có sẵn): cân 25 g mơi trường LB, sau thêm vào1000 mL nước cất điều chỉnh pH 7,2 - Môi trường pha từ hóa chất Thành phần mơi trường (chuẩn bị 1000 mL môi trường) gồm: NaCl 10g Tryptone/ Peptone 10g Cao nấm men (Yeast Extract) 5g Agar 15g - Các hóa chất cân cho cốc thủy tinh, sau cho nước vào đếnvạch 1000 mL - Cốc hóa chất đặt máy khuấy từ khuấy hóa chấthịa tan hồn tồn - Điều chỉnh pH mơi trường pH 7,2 Khử trùng môi trường chuẩn bị môi trường đặc đĩa petri - Môi trường sau pha xong chuyển vào chai chịu nhiệt, đĩa petri cho vào túi nylon kiếng (hoặc gói giấy dầu) - Môi trường đĩa petri cho vào nồi khử trùng nhiệt ướt khử trùng nhiệt độ121°C 30 phút - Sau khử trùng xong, chai chứa môi trường đĩa petri cho vào tủ cấy vôtrùng - Các đĩa đặt chồng lên (khoảng - đĩa) - Môi trường chia vào đĩa petri, thao tác thực sau: + Tay phải cầm chai chứa môi trường khử trùng hơ nhẹ miệng chai đèn cồn,tay trái mở nắp chai hơ miệng chai lửa đèn cồn lần thứ + Tay trái cầm mở nắp đĩa petri cuối cùng, tay phải nghiêng chai mơi trường rót mơi trường vào đĩa petri (lớp môi trường dày khoảng – mm), đậy nắp đĩa lại mởnắp đĩa petri thứ thực tương tự cho đĩa thứ - Sau rót xong, cho mơi trường vào tất đĩa cần mở đĩa để nước không đọng lại nắp đĩa, để yên cho môi trường nguội đặc lại - Sau môi trường đĩa petri nguội, đĩa môi trường cho vào túi nylon buộc kín lại để đảm bảo vơ trùng (các đĩa petri đặt úp lại, đáy đĩa petri nằm phía trên), ghi tên mơi trường ngày tháng năm Các đĩa mơi trườngcó thể sử dụng để cấy vi khuẩn trữ tủ lạnh để sử dụng thí nghiệm Chuẩn bị mơi trường đặc đĩa petri thử hoạt tính kháng khuẩn - Khi khử hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán thạch, độ dày môi trường đĩa petri cần đồng đều, nên việc chuẩn bị môi trường tiến hành tương tự cần chia môi trường vào ống nghiệm trước khửtrùng - Chia 10 mL (hoặc 15 mL tùy theo kích thước đĩa) mơi trường sau phối trộn vào ống nghiệm - Dùng nút gòn ống nghiệm lại, sau cho ống nghiệm vào túi nylon kiếng, cộtmiệng túi cho vào nồi khử trùng nhiệt ướt khử trùng 30 phút 121°C - Sau khử trùng xong, môi trường ống nghiệm cho vào dĩa petri - Các thao tác lại tương tự mục Chú ý: - Thao tác rót mơi trường phải nhanh nhẹ để hạn chế bọt khí nhiễm khuẩn - Mặt agar phải phẳng, khơng gợn sóng - Sau 1-2 ngày cần kiểm tra lại xem mơi trường có bị nhiễm khuẩn không sử dụngđể cấy hay phân lập III BÁO CÁO KẾT QUẢ Chuẩn bị đĩa môi trường cách không bị nhiễm B KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Pha chế nồng độ kháng sinh cao chiết - Thực thí nghiệm thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn II THỰC HÀNH Chuẩn bị kháng sinh cao chiết loài thực vật a Chuẩn bị kháng sinh cao chiết thực vật nồng độ 1280 µg/mL - Cân xác 1,28 mg kháng sinh cao chiết cho vào eppendorf - Dùng micropipet lấy mL DMSO 1% cho vào eppendorf - Vortex cho mẫu hịa tan hồn tồn kháng sinh gốc , nồng độ 1280 µg/mL Giải thích: Dùng DMSO 10% để dễ hòa tan thuốc kháng sinh dung dịch hơn, DMSO có tính kháng khuẩn nên dùng nồng độ cao (trên 10%) làm cho kết thí nghiệm bị sai lệch Do nồng độ DMSO tăng lên đến 10% để dễ hịa tan thuốc cao chiết khơng làm ảnh hưởng đến kết mức độ kháng sinh thuốc cao chiết b Chuẩn bị cao chiết kháng sinh thử nghiệm - Đánh số ống nghiệm từ đến tương ứng với nồng độ 8(µg/mL), 16(µg/mL), 32(µg/mL), 64(µg/mL), 128(µg/mL) - Dùng micropipet pipet lấy 4,5 mL DMSO 1% cho vào ống nghiệm 2,5 mL ống nghiệm 1,2,3,4 -Lấy 0,5 mL kháng sinh gốc cho vào ống nghiệm , sau vortex để trộn mẫu - Tiếp tục lấy 2,5 mL dung dịch từ ống nghiệm chuyển sang ống nghiệm 4, vortex trộn mẫu nồng độ 128 (µg/mL) - Lấy 2,5 mL dung dịch ống nghiệm chuyển sang ống nghiệm vortex trộn mẫu nồng độ 64(µg/mL) - Tiến hành tương tự ống nghiệm lại 2.Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm - Vi khuẩn nuôi nhân mật số môi trường LB lỏng (được lắc máy lắc ngang 24 giờ) - Dịch vi khuẩn pha lỗng 106 với nước cất (vơ trùng) dung dịch NaCl 0,9% (vô trùng) Tiến hành thí nghiệm - Chuẩn bị đĩa mơi trường LB đặc ghi số thứ tự từ – (tương ứng nồng độ kháng sinh cao chiết) -100 µl dung dịch khuẩn nhỏ bề mặt môi trường , để khoảng – 10 phút cho bề mặt môi trường khô - Dùng đục lỗ có đường kính 7mm, khử trùng ấn mạnh lên bề mặt môi trường trãi vi khuẩn E coli Mỗi đĩa petri đụt lỗ - Mỗi lỗ cho 50 µl kháng sinh nồng độ khảo sát vào - Sau chờ cho kháng sinh chất thử nghiệm (cao chiết) khuếch tán hoàn toàn agar, đậy nắp đĩa petri ghi nhận ngày, tháng, năm thực thí nghiệm nồng độ kháng sinh thực - Các đĩa petri thực đặt tủ ủ 32oC 24 Quan sát ghi nhận kết thí nghiệm cách đo đường kính vùng ức chế ( dùng thước đo với đơn vị mm) bao gồm đường kính khoanh giấy vùng vi khuẩn không phát triển (trong) Để quan sát rõ cần đặt đĩa petri đen Ranh giới vùng ức chế xác định vùng khơng có khuẩn lạc phát triển - Đọc kết từ đĩa petri có nồng độ kháng sinh thấp Nồng độ MIC xác định đĩa mơi trường mà vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn 1-3 khuẩn lạc mọc Ở nồng độ thấp nhất, khơng có vi khuẩn mọc kết ghi nhận là: nhỏ nồng độ Trong trường hợp đến nồng độ cao mà thấy vi khuẩn mọc kết ghi nhận lớn nồng độ III BÁO CÁO KẾT QUẢ Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn E.coli kháng sinh Tetracycline nồng độ ((µg/mL) , 16(µg/mL), 32(µg/mL), 64(µg/mL) 128(µg/mL) Hình 3.1 Hoạt tính kháng vi khuẩn kháng sinh Tetracycline nồng độ Thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn E.coli cao chiết nồng độ ((µg/mL) ,16(µg/mL), 32(µg/mL), 64(µg/mL) 128(µg/mL) Hình 3.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn cao chiết - Bảng biểu diễn đường kính trung bình vịng kháng khuẩn theo nồng độ kháng sinh Tetracycline cao chiết Đường kính trung bình vịng Đường kính trung bình vịng Nồng độ (µg/mL) kháng khuẩn đĩa petri kháng khuẩn đĩa petri chứa cao chiết (mm) chứa kháng sinh (mm) 19 20 16 20 23 32 22 24 64 23 26 128 26 28 - Dựa vào bảng số liệu ta vẽ đồ thị sau : Hình 3.3 Đường biểu diễn đường kính trung bình vịng kháng khuẩn theo dãy nồng độ - Từ đồ thị biểu diễn đường kính vịng kháng khuẩn ta có nhận xét: - Từ biểu đồ ta nhận thấy hoạt tính kháng khuẩn E.coli tăng dần theo dãy nồng độ từ thấp đến cao (từ µg/mL – 128 µg/mL) - Đối với kháng sinh cao chiết có nồng độ tăng dần đường kính vịng kháng khuẩn tăng dần, cịn DMSO 10% khơng xuất vịng kháng khuẩn - Khả kháng khuẩn kháng sinh Tetracycline ln cao cao chiết nồng độ khảo sát - Nồng độ ức chế tối thiểu MIC có khả kháng khuẩn kháng sinh Tetracycline cao chiết µg/mL 10 BÀI - PHƯƠNG PHÁP GIẢI PHẨU CHUỘT NHẮT TRẮNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT TRÊN CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO CARBONTETRACHLORIDE A PHƯƠNG PHÁP GIẢI PHẨU CHUỘT NHẮT TRẮNG I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Quan sát hình dạng ngồi chuột nhắt trắng - Biết cách lấy máu tĩnh mạch đuôi máu tim chuột nhắt trắng - Biết cách giải phẫu gan/thận chuột nhắt trắng II THỰC HÀNH Quan sát hình thái bên chuột Giới: Animalia Ngành: Vertebrata Lớp: Mammalia Bộ: Rodentia Họ: Muridae Bộ: Mus Loài: Mus musculus Linnaeus Chuột nhắt có thể nhỏ, long trắng chia thành phần chính: đầu, mình, tứ chi Tai rộng, thân bao phủ long mao màu trắng (trừ phần mõm), tai lơng Chuột có răng: hai rang dưới, nhọn bén Mắt chuột màu hồng Chuột đực phân biệt chuột trưởng thành dựa vào phận sing dục Phương pháp cân lấy áu tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng - Chuột nhắt trắng cân cách cho vào ống falcon 15ml (đã trừ trọng lượng ống falcon) cân cách phân tích - Máu tĩnh mạch lấy cách dùng lưỡi lam rạch vết đuôi chuột khoảng 0.2 mm, vuốt nhẹ đuôi để lấy máu chảy Giọt máu cho vào Eppendorf cho thí nghiệm khác, cho lên que thử để đo glucose huyết chuột Chuột cầm máu cách giữ chặt vị trí cắt bơng gịn tẩm cồn khoảng phút Phương pháp giải phẫu chuột nhắt trắng Quá trình giải phẫu chuột gồm bước sau: - Bước 1: Gây mê Dùng bơng gịn thấm diethyl ether cho vào lọ thủy tin có nắp đậy Sau đó, cho chuột vào đậy nắp lại khoảng phút Quan sát chuột khơng cịn thở - Bước 2: Giải phẫu chuột Cố định chuột: Đặt chuột nằm ngửa, dùng kim ghim cố định chi chi vào khay mổ (kim ghim nghiêng phía ngồi góc 450 11 Cắt da: Dùng kéo cắt vị trí * (cách hậu mơn khoảng 0,5 cm) lỗ thủng Tiếp đến cắt phía chi chuột, tiếp tục cắt phía chi chuột Sau đó, kéo da phía dùng kim ghim cố định vào khay mổ Cắt cơ: Dùng kẹp nâng bụng lên, cắt đường dọc mẫu hình kiếm xương ức Lưu ý: Khi cắt cơ, mũi kéo hướng chếch lên để tránh đứt nội quan - Bước 3: Mở lộ tim lấy máu tim Dùng kéo cắt bỏ phần xương sườn mở lộ tim tiến hành lấy máu tim Dùng kim tiêm (đã bơm bỏ khí ống) đâm nhẹ vào đỉnh tâm thất trái, kéo nhẹ kim tiêm để máu đẩy vào ống tiêm lấy thể tích máu từ khoảng 0,7-1 ml Sau máu đưa vào ống đông lắc nhẹ - Bước 4: Giải phẫu lấy gan thận Tách gan: Gan nội tạng lớn thể nằm sát khoang ngực, gan có thùy Cắt rời gan khỏi thể tĩnh mạch cửa động mạch gan Tách thận: Thận màu nâu đỏ hình hạt đậu nằm sát cột sống, xoang bụng Tuyến thượng thận tròn màu trắng nằm thận Thận cắt rời khỏi thể vị trí động mạch thận, tĩnh mạch thận cắt ngang niệu quản để thận rời bang quang Sau cắt thể, gan thận làm dung dịch muối sinh lý trữ tạm thời khay chứa nước đá II BÁO CÁO KẾT QUẢ Kết mẫu giải phẫu Hình 4.2 Gan thận Hình 4.1 Chuột giải phẫu 12 Kết mẫu gan chuột Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Hình 4.3 Các mẫu gan chuột B KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT TRÊN CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO CARBOTETRACHLORIDE I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM - Nắm nguyên tắc thao tác thử nghiệm in vivo chuột - Hiểu chế gây tổn thương gan carbon tetrachloride (CCl4) tổn thương gan chuột nhiễm độc CCl4 II THỰC HÀNH Chuẩn bị thí nghiệm - Chia ngẫu nhiên 15 chuột vào chuồng đánh dấu thứ tự chuồng - Dùng viết đánh dấu chuột chuồng cách vạch vào đuôi chuột 1,2,3 vạch Cân ghi nhận trọng lượng chuột 13 - Nồng độ CCl4 cho uống 0,2 ml pha dầu olive với tỷ lệ 1:4 (Pha dầu olive CCl4 dễ bay dầu olive tá dược để chuột dễ hấp thụ) - Nồng độ cao chiết cho uống 200 mg/kg trọng lượng chuột - Nồng độ Silymarin cho uống 100mg/kg trọng lượng chuột Lập bảng trọng lượng chuột liều lượng thuốc/hóa chất cho bước thí nghiệm bảng sau: Bảng 5.1: Trọng lượng chuột liều lượng thuốc/hóa chất cho thí nghiệm Trọng Trọng Ký lượng chuột lượng chuột Ký hiệu hiệu trước sau chuồng chuột uống hóa uống hóa chất (g) chất (g) 25.63 34.64 Chuồng 31.55 36.80 35.14 35.90 31.70 34.46 Chuồng 36.20 42.14 35.34 42.40 31.52 32.12 27.50 28.64 Chuồng 3 30.00 33.83 22.03 31.72 32.62 Chuồng 35.16 31.00 31.12 32.28 30.16 Chuồng 30.46 31.76 30.03 Trọng lượng gan chuột sau uống hóa chất (g) 1.58 1.92 2.14 2.58 2.42 3.11 2.23 2.8 2.48 2.51 2.52 1.92 Cân nặng chuột x 100 (mg) 1000 - Lượng Cao chiết cho chuột chuồng uống: 14 Khối lượng cao chiết/ Silymarin (mg) 0 0.2 0.2 2.52 - Lượng Silymarin cho chuột chuồng uống: Lượng Silymarin = Thể tích CCl4 (ml) 0.2 2.20 mg Silymarin 3.17 mg Silymarin 3.52 mg Silymarin 3.10 mg Silymarin 6.46 mg Cao chiết 6.03 mg Cao chiết 6.09 mg Cao chiết 6.01 mg Cao chiết Lượng Cao chiết = Cân nặng chuột x 200 (mg) 1000 Bố trí thí nghiệm Dựa vào bảng bố trí thí nghiệm sau: - Nghiệm thức 1: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml nước cất - Nghiệm thức 2: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml dầu olive, sau uống thêm 0,2 ml DMSO 1% - Nghiệm thức 3: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive, sau uống thêm 0,2 ml DMSO 1% - Nghiệm thức 4: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive, sau uống thêm 0,2 ml Silymarin (nồng độ 100mg/kg trọng lượng chuột) pha DMSO 1% - Nghiệm thức 5: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive, sau uống thêm 0,2 ml cao chiết thực vật (nồng độ 200mg/kg trọng lượng chuột) pha DMSO 1% Chuột thực gây tổn thương gan điều trị 10 ngày, ngày thí nghiệm thực vào sáng Giải phẫu chuột - Sau 10 ngày kết thúc thí nghiệm, chuột giải phẫu lấy gan (phương pháp giống 4) - Tách toàn gan khỏi thể chuột, quan sát, ghi nhận chụp hình cấu trúc bên gan - Cân ghi nhận trọng lượng gan chuột nghiệm thức - Cắt lấy 250 mg gan chuột rửa nước muối sinh lý, sau trữ ống eppendorf nhiệt độ -200C cho thí nghiệm II BÁO CÁO KẾT QUẢ Giải thích chế gây độc CCl4 - CCl4 sử dụng phổ biến làm tác nhân gây tổn thương gan chất tạo gốc tự gây tượng peroxyl hóa màng tế bào gan thời gian ngắn Ngoài ra, chất cịn làm suy kiệt hệ thống chống oxi hóa thể làm giảm gốc thiol - Sau vào thể, CCl4 bị chuyển hóa phần cytochrome P - 450 tạo thành N-acetyl para-benzoquiononimin gây peroxyl hóa lipid sinh malonyl dialdehyde dẫn đến tổn thương tế bào gan Kết làm tăng hàm lượng enzyme (men gan) aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT) làm biến đổi cấu trúc gan - Khi hấp thụ vào thể, CCl4 sinh gốc tự Trichloromethyl CCl3 thông qua hệ thống enzyme cytochrome P - 450 CCl3 đánh giá tác nhân gây ngộ đọc thể - Trong hơ hấp kị khí, CCl3 tạo hàng loạt sản phẩm chất độc bao gồm hexachloroethane (Cl3CCCl3), carbon monoxide (CO), đặc biệt CHCl3 gây tổn thương gan, viêm gan -Trong q trình hơ hấp hiếu khí có mặt O2, CCl3 chuyển hóa thành trichloromethanol (Cl3COH) hay tiền thân phosgene (COCl2), sau bị thủy phân tạo thành CO2, từ gây rối 15 loạn chức ty thể Sự trương lên tế bào gan cảm ứng gen liên quan đến stress gen bảo vệ gây độc cho gan Ghi nhận màu, mô tả mức độ tổn thương gan đại thể gan chuột nhóm chuột thí nghiệm - Nghiệm thức 1: Chuột cho uống 0,2 ml nước cất (đối chứng sinh lý) * Nhận xét: Gan có màu đỏ tươi, bề mặt gan láng mịn Gan khơng có dấu hiệu tổn thương Nghiệm thức - Nghiệm thức 2: Chuột cho uống 0,2 ml dầu olive + 0,2 ml DMSO 1% * Nhận xét: Gan màu đỏ, xuất vết sần bề mặt DMSO làm tổn thương thần kinh, gây stress oxy hóa làm gan tổn thương nhẹ, ảnh hưởng đến hiệu điều trị Silymarin cao chiết Nghiệm thức - Nghiệm thức 3: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive + 0,2 ml DMSO 1% (đối chứng bệnh lý) * Nhận xét: Gan bị tổn thương nặng chuột uống CCl4 nhiều ngày liên tục, không màu đỏ tươi, màu tái nhạt, bề mặt xuất nhiều vết sần Nghiệm thức - Nghiệm thức 4: Chuột cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive + 0,2 ml Silymarin pha DMSO 1% (đối chứng dương) * Nhận xét: Gan màu đỏ tái, bề mặt phẳng vết sần nghiệm thức chuột uống CCl4 dẫn đến tổn thương gan sau uống Silymarin mức độ tổn thương gan giảm xuống Silymarin chứng minh thuốc có tác dụng tốt để điều trị viêm gan, vàng gan, xơ gan chống lại tổn thương gây hại đến gan 16 Nghiệm thức - Nghiệm thức 5: Chuột cho uống 0,2 ml CCl4 pha dầu olive 0,2 ml + cao chiết thực vật pha DMSO 1% (thử nghiệm bảo vệ gan cao chiết) * Nhận xét: Gan có màu đỏ nhạt, vết sần vét bầm bề mặt nghiệm thức 3, chuột uống CCl4 dẫn đến tổn thương gan sau uống thêm cao chiết mức độ tổn thương gan giảm xuống chứng tỏ cao chiết có hoạt tính bảo vệ gan Nghiệm thức Vẽ biểu đồ trọng lượng gan Khối lượng tương đối gan chuột tính theo cơng thức: Khối lượng tương đối gan chuột = Khối lượng gan chuột Khối lượng chuột x 100 (%) Bảng 5.2 Khối lượng tương đối gan chuột với nghiệm thức Số thứ tự Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Nghiệm thức Khối lượng trung bình chuột (g) 32.16 34.60 29.51 31.87 30.46 Khối lượng trung bình gan chuột (g) 2.06 2.64 2.50 2.52 1.92 - Dựa vào bảng số liệu ta vẽ biểu đồ: 17 Khối lượng tương đối gan chuột (%) 6.41 7.63 8.47 7.91 6.30 BÀI KHẢO SÁT SỰ PEROXYDE HÓA LIPID Ở CHUỘT THƯỜNG GAN DO CARBONTETRACHLORIDE I MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU - Nắm nguyên tắc thao tác thử nghiệm in vivo lên chuột - Hiểu chế peroxyde hóa lipid gan chuột bị tổn thương CCl4 phương pháp xác định chất thị malondialdehyde (MDA) II THỰC HÀNH Nguyên tắc - Malonyl dialdehyde (MDA) sinh q trình peroxyde hóa lipid nên sử dụng market sinh học thử nghiệm đánh giá peroxyde hóa lipid in vivo Khi cho MDA phản ứng với acid thiobarbituric, phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric (TBA) tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bước song 532nm Phương trình phản ứng sau: Thực hành - 100 mg gan chuột ( chuẩn bị Bài ) - Dùng chày cối thủy tinh nghiền gan 400 µL dung dịch KCL 0,9% làm lạnh trước, thao tác nghiền thực bình đá lạnh - Thêm vào 200 µL dung dịch đệm phosphate ủ 37oC 30 phút - Thêm vào 200 µL acid trichloroacetic 10% - Ly tâm hỗn hợp 13000 vòng/phút 10 phút - Hút lấy 400 µL phần dịch cho vào ống Eppendorf đánh số trước - Thêm vào hỗn hợp phản ứng 200 µL acid thiobarbituric 0,8% - Sấy 100oC để nguội 30 phút - Phức tạo MDA TBA phát cách đo mật độ quang bước song 532nm 18 III BÁO CÁO KẾT QUẢ Biểu đồ dạng cột biểu diễn hiệu kháng peroxyde hóa lipid nhóm chuột theo giá trị OD đo Hình 6.1 Đo giá trị OD nghiệm thức (Kết đo OD nhóm lấy từ B5 đến F5 tương ứng với nghiệm thức) Nghiệm thức Giá trị OD Bảng 6.1 Giá trị OD bước sóng 532nm 0.246 0.292 0.283 0.196 - Dựa vào bảng số liệu ta vẽ biểu đồ: 19 0.428 Giải thích kết thí nghiệm khả kháng oxy hóa nhóm chuột bị tổn thương gan khơng điều trị - Khi cho malonyl dialdehyde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo phức màu hồng Màu hồng đậm, lượng MDA nhiều giá trị OD đo lớn Dựa vào biểu đồ biểu diễn kháng peroxyde hóa lipid nhóm chuột theo giá trị OD, ta thấy: - Nghiệm thức (đối chứng sinh lý): giá trị OD đo 0.246 Kết luận: chuột uống nước cất nên tế bào gan bình thường - Nghiệm thức (đối chứng bệnh lý): giá trị OD đo 0.292 Kết luận: DMSO làm tổn thương thần kinh, gây stress oxy hóa làm gan tổn thương nhẹ - Nghiệm thức 3: giá trị OD đo 0.283 Kết luận: CCl4 gây tổn thương gan nghiêm trọng - Nghiệm thức (đối chứng dương): giá trị OD đo 0.196 Kết luận: Silymarin có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương gan CCl4 Do đó, peroxyde hóa lipid giảm lượng MDA sinh thấp - Nghiệm thức (thử nghiệm bảo vệ gan cao chiết): giá trị OD đo 0.428 * Kết luận: Chưa thấy hiệu cao chiết, kết giá trị OD đo chưa với lý thuyết Có thể số nguyên nhân sau: - Khối lượng chuột chưa đồng đều, thể trạng, địa chuột khác nên sửdụng liều dùng gây kết khơng giống - Quá trình pha cao chiết cho uống thuốc cịn có sai số, chưa xác 20