Đang tải... (xem toàn văn)
II Bệnh đốm trắng ở tôm (White Spot Disease in shrimp) Nghề nuôi tôm tại Việt Nam hiện đang phát triển mạnh, góp phần quan trọng trong việc tạo việc làm, nâng cao thu nhập cho người dân, đảm bảo an ninh lương thực, và xuất khẩu thu được nguồn ngoại tệ lớn. Tuy nhiên ô nhiễm môi trường, dịch bệnh đã đe dọa đến sự phát triển bền vững, gây tổn hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Bệnh đốm trắng (WSD) là một trong những bệnh phổ biến trên tôm hiện nay. Đặc biệt virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), là một trong những nhóm tác nhân virus gây tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi tôm. 1 Nguyên nhân gây bệnh đốm trắng ở tôm Có ba nguyên nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm: bệnh do virus, do vi khuẩn hoặc do môi trường 3. + Do vi khuẩn: Liên quan đến một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillaceae, vi khuẩn gây hội chứng đốm trắng (Bacterial White spot syndrome BWSS). + Do môi trường: Do độ cứng của nước cao, tôm hấp thụ quá nhiều Ca2+, Mg2+ làm xuất hiện trên vỏ nhứng đốm trắng. Nước ao cứng có thể do dùng quá nhiều vôi trong khâu cải tạo ao. + Do virus: Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) thuộc họ virus mới có tên gọi Nimaviridae, chi Whispovirus 4. Virus hình trứng, hay ovan, đường kính 80120nm, dài khoảng 250380nm, có đuôi, vật chất di truyền là DNA 4. Virus ký sinh chủ yếu trên mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu và cơ bụng của tôm 4. Bệnh xảy ra trên các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeidae): tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P.vannamel), tôm rảo (P.merguensis) 4. Ngoài ra các loài tôm càng xanh, tôm đất, cua, ghẹ, một số loài giáp xác phù du như Artemia, Copepoda cũng có thể mang bệnh. Bệnh xảy trên cả tôm nước mặn, nước lợ, trên hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm, đặc biệt khi thời tiết biến đổi nhiều như thay đổi độ mặn, thay đổi nhiệt trong ngày quá lớn gây sốc cho tôm. Virus có thể lây lan theo chiều ngang từ cá thể khỏe sang cá thể bị nhiễm trong cùng ao hoặc do tôm có ăn thức ăn có mầm bệnh; hoặc qua các vật chủ trung gian như tôm tự nhiên, cua,ghẹ,động vật phù du mang mầm bệnh 4. 2 Biểu hiện bệnh đốm trắng ở tôm Bệnh do môi trường3: Tôm có đốm trắng ở vỏ đầu ngực, vỏ sống lưng. Tôm không có biểu hiện tấp bờ, tôm vẫn khỏe, ăn bình thường, nhưng chu kỳ lột xác dài hơn bình thường, tôm sinh trưởng chậm hơn. Bệnh do vi khuẩn3:
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Khoa Công nghệ Nông nghiệp - Trường Đại học Công nghệ TIỂU LUẬN HỌC PHẦN SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NESTED PCR Sinh viên thực hiện: Nghiêm Thị Huế MSSV: 19021558 Lớp: K64-AG Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Thị Hiên Hà Nội, tháng 10, năm 2022 Mục lục I Kỹ thuật ứng dụng II Bệnh đốm trắng tôm (White Spot Disease in shrimp) Nguyên nhân gây bệnh đốm trắng tôm Biểu bệnh đốm trắng tôm Biện pháp chẩn đoán .4 III Phương pháp Nested PCR .5 Nguyên lý kỹ thuật Nested PCR Kết Ưu điểm sử dụng Nested PCR xác định bệnh đốm trắng tôm .7 IV Tài liệu tham khảo I Kỹ thuật ứng dụng - Kỹ thuật: Nested PCR (Polymerase chain reaction) - Đối tượng ứng dụng: Tôm - Lĩnh vực: Chẩn đốn bệnh đốm trắng tơm II Bệnh đốm trắng tôm (White Spot Disease in shrimp) Nghề nuôi tôm Việt Nam phát triển mạnh, góp phần quan trọng việc tạo việc làm, nâng cao thu nhập cho người dân, đảm bảo an ninh lương thực, xuất thu nguồn ngoại tệ lớn Tuy nhiên ô nhiễm môi trường, dịch bệnh đe dọa đến phát triển bền vững, gây tổn hại nghiêm trọng mặt kinh tế Bệnh đốm trắng (WSD) bệnh phổ biến tôm Đặc biệt virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), nhóm tác nhân virus gây tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi tôm Nguyên nhân gây bệnh đốm trắng tơm Có ba ngun nhân gây bệnh đốm trắng tôm: bệnh virus, vi khuẩn môi trường [3] + Do vi khuẩn: Liên quan đến số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillaceae, vi khuẩn gây hội chứng đốm trắng (Bacterial White spot syndrome - BWSS) + Do môi trường: Do độ cứng nước cao, tôm hấp thụ nhiều Ca 2+, Mg2+ làm xuất vỏ nhứng đốm trắng Nước ao cứng dùng nhiều vôi khâu cải tạo ao + Do virus: Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) thuộc họ virus có tên gọi Nimaviridae, chi Whispovirus [4] Virus hình trứng, hay ovan, đường kính 80-120nm, dài khoảng 250-380nm, có đi, vật chất di truyền DNA [4] Virus ký sinh chủ yếu mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu bụng tôm [4] Bệnh xảy lồi tơm thuộc họ tơm he (Penaeidae): tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P.vannamel), tơm rảo (P.merguensis) [4] Ngồi lồi tơm xanh, tơm đất, cua, ghẹ, số lồi giáp xác phù du Artemia, Copepoda mang bệnh Bệnh xảy tôm nước mặn, nước lợ, hầu hết giai đoạn phát triển tôm, đặc biệt thời tiết biến đổi nhiều thay đổi độ mặn, thay đổi nhiệt ngày lớn gây sốc cho tơm Virus lây lan theo chiều ngang từ cá thể khỏe sang cá thể bị nhiễm ao tơm có ăn thức ăn có mầm bệnh; qua vật chủ trung gian tôm tự nhiên, cua,ghẹ,động vật phù du mang mầm bệnh [4] Biểu bệnh đốm trắng tơm - Bệnh mơi trường[3]: Tơm có đốm trắng vỏ đầu ngực, vỏ sống lưng Tôm biểu tấp bờ, tơm khỏe, ăn bình thường, chu kỳ lột xác dài bình thường, tôm sinh trưởng chậm - Bệnh vi khuẩn[3]: Tôm lột vỏ chậm, chậm lớn, chết rải rác, hầu hết tơm bị đóng rong, mang đen Tơm bệnh có đốm trắng mờ đục khắp thể, đốm trắng lột vỏ Soi kính hiển vi thấy có đốm trắng dạng lan tỏa tương tự hình địa y bạc màu rỗng Các đốm trắng vỏ tôm, không ảnh hưởng đến thịt tôm phận bên - Bệnh virus[4]: Tôm bệnh giảm ăn rõ rệt, tơm tăng cường bắt mồi bình thường, sau vài ngày bỏ ăn; tơm dạt bờ, lờ đờ Tơm bệnh xuất đốm trắng trịn đường kính 0.5-2mm lớp vỏ kitin đặc biệt vùng đầu ngực đốt bụng cuối cùng, đốm nằm vỏ, loại bỏ việc chà xát Trong trường hợp cấp tính, tơm bệnh chuyển sang màu hồng đỏ Tôm bệnh chết nhanh, tỷ lệ chết lên đến 90-100% 3-7 ngày Hình 2.1: Vỏ giáp đầu ngực tôm bị đốm trắng nguồn công ty cổ phần UV[5] Biện pháp chẩn đoán Ở Việt Nam bệnh đốm trắng bùng phát mạnh, lây lan nhanh, vùng nuôi tôm trọng điểm chưa có phương pháp đặc trị hữu hiệu Do tỷ lệ chết tôm đạt tỷ lệ chết cao sau thời gian ngắn bắt đầu nhiễm, nên việc kiểm tra phát sớm bệnh để kịp thời có biện pháp nhằm giảm thiệt hại cho người nuôi tôm Dựa vào biểu bệnh nêu phần 2, mắt thường dễ dàng nhận biết bệnh môi trường, nhiên bệnh đốm trắng virus vi khuẩn lại có biểu giống Đốm trắng virus dễ nhận tơm sống, vi khuẩn khó nhận biết hơn, quan sát tôm lột Vấn đề đặt phải có cách để phát tác nhân bệnh thời gian ngắn Hiện kỹ thuật phịng thí nghiệm kỹ thuật mô học, phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) biện pháp hữu hiệu, đáng tin cậy giúp phát mầm bệnh giai đoạn sớm Trong phương pháp Nested PCR xác định xác bệnh đốm trắng tôm thời gian ngắn III Phương pháp Nested PCR Phương pháp Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp chẩn đốn nhanh, xác bệnh đốm trắng tôm virus thời gian ngắn Nguyên lý chung kỹ thuật PCR dựa việc sử dụng khả enzyme Taq DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN từ chuỗi ADN ban đầu cung cấp Phản ứng PCR thực chu kỳ nhiệt gồm bước: - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ đưa lên 94-96oC, liên kết hydro bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ hạ xuống 50 - 60 oC, đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào đầu trình tự mục tiêu - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ đưa lên 72 oC, Taq polymerase sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' mồi tạo mạch bổ sung Chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 35 lần, DNA Polimerase tổng hợp với tốc độ 1000Nu/p Nguyên lý kỹ thuật Nested PCR Kỹ thuật dựa nguyên lý chung cuả kỹ thuật PCR hồn thiện hoạt tính enzyme sử dụng thiết kế cặp đoạn mồi đặc hiệu hơn[2] Phương pháp Nested PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 146F2/146R2 để phát virus đốm trắng [4] Đặc biệt PCR nested PCR bao gồm liên tiếp phản ứng PCR, sử dụng cặp đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng liên tiếp [4] Giai đoạn thực phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 để khuếch đại vùng DNA, có chứa DNA mong muốn, tăng số lượng DNA chứa trình tự đích [4] Giai đoạn thực phản ứng Nested sử dụng cặp mồi 146F2/146R2, sản phẩm giai đoạn dùng cho phản ứng PCR với cặp đoạn mồi thứ hai đặc hiệu cho đoạn DNA mong muốn, để phát trình tự đích [4] Kỹ thuật ưu tiên sử dụng trình tự đích có độ nhạy Lưu ý trước chạy phản ứng Nested PCR cần chuẩn bị mẫu phân tích, tách chiết DNA Lượng mẫu cần chuẩn bị khoảng 30mg, mẫu tôm giống, ấu trùng sử dụng nguyên con, mẫu tơm bố mẹ, tơm thịt lấy phần mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu, bụng nghiền nhuyễn với tỷ lệ thẻ tích mẫu thể tích dung dịch muối đệm[4] Sau tiến hành phản ứng Nested PCR cho chạy điện di hiệu điện 100V, thời gian không 25 phút, sau đọc kết [4] Kết Sau điện di, ta đọc kết máy đọc gel: - Kết mẫu thử dương tính với WSSV thang mẫu thử xuất vạch sáng có kích thước 941bp, thang chuẩn DNA phân vạch rõ ràng[4] Nếu kết dương tính với MSSV, tơm mắc bệnh đốm trắng virus Hiện chưa có thuốc điều trị bệnh virus gây Với ao tôm bệnh, vớt tôm chết khỏi ao nuôi, đem tiêu hủy, dùng Chlorin 30ppm (30kg/1000m 3) phun xuống toàn ao, giữ nước ao 7-10 ngày xả nước [1] Khi phát tôm bệnh virus tốt nên thu hoạch Biện pháp phòng bệnh chủ yếu phải xét nghiệm tôm giống bố mẹ bệnh, chọn vụ ni thích hợp, hạn chế thả vào mùa lạnh, nguồn nước phải qua lắng lọc trước đưa vào ao nuôi, quản lý chặt môi trường ao ni - Kết mẫu thử âm tính giếng mẫu thử không xuất vạch sáng sản phẩm khuyếch đại, thang chuẩn DNA phân vạch rõ ràng[4] Nếu kết phân tích âm tính với MSSV tơm mắc bệnh vi khuẩn môi trường Nếu tôm mắc bệnh môi trường cần tránh bón vơi q nhiều vệ sinh ao, thay nước cuối vụ, bổ sung khoáng chất, cho ăn đủ dinh dưỡng để kích thích lột xác tránh việc tôm bị đốm trắng [1] Nếu tôm mắc bệnh vi khuẩn, cần kiểm sốt kỹ mơi trường ao nuôi, cải thiện môi trường ao nuôi, xử lý nước, chất thải, giảm tảo, tăng cường bổ sung vitamin C, khống chất, thuốc bổ gan vào thức ăn cho tơm để nâng cao sức đề kháng[4] Ưu điểm sử dụng Nested PCR xác định bệnh đốm trắng tơm Hiện có nhiều phương pháp để xác định bệnh đốm trắng tôm kit test nhanh, PCR, ELISA,… Phương pháp dùng kit test nhanh dùng tôm giống tôm thương phẩm; nhiên lượng tơm mẫu dùng kiểm tra nhỏ nên khơng đại diện tình trạng bệnh ao [2] PCR cho phép xác định mầm bệnh gây thời gian ngắn, giúp người ni đưa biện pháp can thiệp kịp thời nhằm hạn chế thấp thiệt hại bệnh gây ra, đặc biệt bệnh WSSV Tuy nhiên kỹ thuật PCR địi hỏi người làm có kỹ thuật chun mơn cao, dễ bị tạp nhiễm gây dương tính giả, độ nhạy thấp, chưa xác định mật độ cảm nhiễm mầm bệnh.Vì nhà nghiên cứu khơng ngừng cải tiến kỹ thuật, đưa quy trình hồn thiện hơn, điển Nested PCR Nested PCR kỹ thuật PCR cải tiến cho phép xác định diện mầm bệnh, dù số lượng nhỏ [2][4] Nested PCR làm giảm sai lệch kết PCR trường hợp mồi không gắn vào DNA có tạp nhiễm[2] Do kỹ thuật có hồn thiện hoạt tính enzyme; sử dụng mồi đặc hiệu hơn, mồi bắt cặp DNA tổng hợp thành mạch mới, mồi bắt cặp với mạch vừa tổng hợp (sản phẩm PCR đầu tiên) để tổng hợp mạch ý muốn[4] Nested PCR thường thành công phản ứng PCR thông thường đặc biệt trường hợp khuyếch đại DNA dài[2] IV Tài liệu tham khảo [1] “Bệnh đốm trắng gây virus, http://vienloci.org.vn/benh-dom-tranggay-ra-virus-wssv/, truy cập ngày 10/10/2022 [2] Duy Hồ, 18/11/2020, Chẩn đoán nhanh, hiệu bệnh đốm trắng phương pháp Nested PCR , Tepbac, https://tepbac.com/tin-tuc/full/chan-doannhanh-hieu-qua-benh-dom-trang-bang-phuong-phap-nested-pcr-31350.html, truy cập ngày 10/10/2022 [3] Lê Cung, ‘Tác nhân gây đốm trắng tôm nuôi, 06/07/2020, truy cập ngày 10/10/2022, https://thuysanvietnam.com.vn/tac-nhan-gay-dom-trang-tren-tomnuoi/#:~:text=Virus%20g%C3%A2y%20h%E1%BB%99i%20ch%E1%BB %A9ng%20%C4%91%E1%BB%91m,t%E1%BA%BF%20b%C3%A0o%20bi %E1%BB%83u%20m%C3%B4%20da, truy cập ngày 10/10/2022 [4] TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8710-3:2019 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đốn - Phần 3: Bệnh đốm trắng tôm, https://hethongphapluat.com/tieuchuan-quoc-gia-tcvn-8710-3-2019-ve-benh-thuy-san-quy-trinh-chan-doanphan-3-benh-dom-trang-o-tom.html, truy cập ngày 10/10/2022 [5] Trần Việt Tiên, 03/06/2019, UV-Vietnam, Phân biệt bệnh đốm trắng tôm virus, vi khuẩn môi trường, https://uv-vietnam.com.vn/vi/phan-bietdom-trang-tren-tom-do-virut-vi-khuan-va-moi-truong, truy cập ngày 10/10/2022