Thiết kế cấu trúc biểu gen u Một cấu trúc biểu gen cần: u Đầy đủ các yếu tố để đảm bảo sự biểu gen u promoter phù hợp u Chọn các trình tự tham gia điều hòa biểu gen thích hợp u Gen đích phải về trình tự (tạo protein trình tự đúng) u Để tạo cấu trúc biểu cần sử dụng các kỹ thuật: nhân DNA, cắt, ghép nối, biến nạp gen, tinh sạch….thực plasmid trung gian vật chủ trung gian u Cấu trúc biểu thường giữ các plasmid trung gian để có thể nhân lên số lượng lớn Thiết kế cấu trúc biểu gen u Promoter: phổ biến là: 35S (CaMV) từ virus gây bệnh khảm súp lơ (sử dụng 80% biến đổi gen nay) u Terminator: phổ biến là 3’nos: trình tự kết thúc từ gen tổng hợp nopaline synthesase Agrobacterium tumafeciens (80% trồng CNSH sử dụng) Promoter Vùng mã hóa protein Terminator Đưa lên “phương tiện” chuyển gen u Gen chuyển vào vật chủ có thể nằm plasmid độc lập với hệ gen vật chủ (vật chủ là sinh vật nhân sơ), gắn lên hệ gen của vật chủ (vật chủ là sinh vật nhân chuẩn) u Phương tiện chuyển sử dụng phụ thuộc vào phương pháp chuyển gen: u Plasmid chuyển gen: Ti-plasmid với phương pháp dùng Agrobacterium tumafaciens u u Hạt nano vàng/wolfram: phương pháp bắn gen Với phương tiện là plasmid, để đưa cấu trúc biểu plasmid cần sử dụng các kỹ thuật: nhân gen, cắt và ghép nối… Các phương pháp biến nạp gen vào vật chủ Yêu cầu phương pháp chuyển gen vào tế bào u Ổn định hệ gen vật chủ u Đoạn gen chuyển đảm bảo không bị xếp lại để đảm bảo gen hoạt đông tạo sản phẩm tính trạng mong muốn u Đơn giản, dễ kiểm sốt u Khơng ảnh hưởng tới q trình trao đổi chất thông thường vật chủ Ở thực vật u Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens u Súng bắn gen u Dung hợp tế bào trần Chuyển gen Agrobacterium tumafaciens u Vi khuẩn gây khối u thực vật u Có thể chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật, tạo khối u để làm nơi cư trú vi khuẩn u tạo opine nopalin và octopin chất dinh dưỡng cho chúng khối u u Khả tạo khối u vi khuẩn nhờ gen plasmid có tế bào vi khuẩn, gọi Ti plasmid – (Tumor inducing plasmid) u Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương thực vật, nhanh chóng chuyển đoạn DNA chứa gene tổng hợp opine gen tạo u vào hệ gen thực vật, gây u tạo opine cho chúng phát triển Chuyển gen Agrobacterium tumafaciens u u u Các gen tạo phytohormone sinh tổng hợp nopaline Đoạn DNA chuyển nằm trình tự đặc trưng 25 bp, gọi Bờ phải (Left border) bờ trái (right Border) LB Đoạn DNA gắn vào hệ gen tế bào thực vật vị trí Các gen tạo phytohormone làm tế bào thực vật kiểm soát, tạo thành khối u Phân giải nopaline Vùng độc tính Vùng khởi động tái Hệ thống plasmid dùng để chuyển gen vào thực vật Đoạn gen cần chuyển Chuyển gen Agrobacterium tumafaciens Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật u Tế bào vi sinh vật thường dễ thực vật động vật u Các phương pháp u u Sốc điện (electroporation) u Sốc nhiệt (heat shock) u Dung hợp tế bào trần Yêu cầu tế bào phải sử lý thành tế bào “khả biến” (dễ dàng cho biến nạp, chuyển DNA vào tế bào) Chuyển gen vào vi sinh vật u Phương pháp sốc điện Trước sốc điện Trong trình sốc Màng tế bào Gen đưa vào Điện trường tạo ngồi màng tế bào Sau q trình Màng tế bào phục hồi Chuyển gen vào vi sinh vật u Phương pháp sốc nhiệt u Tế bào vi sinh vật xử lý bổ sung Ca2+, u Khi bổ sung DNA, điện tích âm, liên kết với Ca2+, gắn màng tế bào u Khi sốc nhiệt (bên nhiệt độ cao, bên nhiệt độ thấp, màng tế bào tạo lỗ hổng, phức hợp Ca2+ DNA vào bên tế bào Chuyển gen vào tế bào động vật u Vi tiêm: Lượng DNA nhỏ tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần/hoặc tế bào nguyên vẹn kính hiển vi quang học Chuyển gen vào tế bào động vật u Sử dụng virus (retrovirus): đưa DNA retrovirus mang đoạn gen cần chuyển vào tế bào vật chủ, nhờ hoạt động DNA từ virus, đoạn gen đích chuyển vào hệ gen vật chủ Chuyển gen động vật u Chuyển gen vào tế bào gốc: Tế bào giai đoạn 16-32 tế bào tế bào gốc, từ phát triển thành loại tế bào thể sinh vật Các tế bào gốc tách chiết cấy gen ngoại lai vào Đánh giá diện gen chuyển vật chủ Điều xảy DNA chuyển vào vật chủ u Không chèn vào hệ gen? u Chèn vào hệ gen u Theo dự kiến: trình tự đúng, xếp P-ORF-T (để đảm bảo biểu gen) u Không dự kiến: thay đổi xếp trình tự, thay đổi P-ORF-T…làm chức gen đưa vào, bị đội biến, bị cắt nhỏ u Gen chèn vào hệ gen có tồn ổn định theo hệ hay không? Hay bị loại bỏ sang hệ cháu sau? u Nếu cấu trúc biểu chèn vào hệ gen ổn định, liệu biểu protein nào? Phân bố phận vật chủ? (ví dụ, lá, rễ, củ, hạt…?) Phương pháp phát DNA u Bằng phương pháp PCR: •Tách DNA hệ gen từ sinh vật chủ •Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen đích •Điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen • Nếu có sản phẩm PCR: kích thước dự kiến có đoạn DNA chuyển vào DNA hệ gen vật chủ • Nếu khơng có sản phẩm khơng có đoạn DNA chuyển vào bị biến đổi dẫn tới đoạn mồi đặc hiệu không bắt cặp Phương pháp phát DNA u Lai u Southern blot: sử dụng mẫu dò (probe) đoạn DNA ngắn bắt cặp (theo nguyên tắc bổ sung) với vùng đoạn gen đưa vào vật chủ cần phát Mẫu dị thường gắn thêm để phát u Phương pháp Southern blot thiết kế để xác định sự hiện diện, kích thước, sớ lượng bản đoạn DNA hệ gen Phương pháp phát DNA u Giải trình tự đoạn DNA khu vực mang đoạn chèn để xem có sai khác trình tự hay xếp lại cấu trúc biểu hay không? u Các phương pháp giải trình tự: u Phương pháp hố học Maxam - Gibert u Phương pháp enzyme Sanger Phương pháp phát RNA Northern blot u Tương tự lai Southern blot, áp dụng cho RNA u Sử dụng mẫu dò lai (bắt cặp) đặc hiệu với đoạn RNA cần phát có tín hiệu có RNA Phương pháp xác định protein u Gen đưa vào tạo protein cần xác định protein định tính (có hay khơng) định lượng (hàm lượng bao nhiêu) u Dựa tương tác protein (coi kháng nguyên) với kháng thể kháng protein u Định tính: Western blot u Định lượng: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme Phương pháp Western blot u Có băng sản phẩm có protein cần phát u Khơng có băng sản phẩm khơng có protein cần phát (hoặc khả phát được) Chọn lọc cá thể mang gen chuyển u u Nuôi cấy điều kiện chọn lọc cho tính trạng cần đưa thêm vào chủ: u Ví dụ kháng thuốc trừ cỏ glyphosate cần ni có phun thuốc trừ cỏ glyphosate u Cần vi khuẩn kháng kháng sinh A nuôi cấy điều kiện có kháng sinh A Trong nhiều cá thể có đặc tính đưa vào, chọn cá thể có mức độ biểu cao để tiếp tục lai tạo thành hệ sau thành giống thương mại u Ví dụ: lai ngơ có tính kháng sâu với giống ngơ phát triển tốt điều kiện Việt Nam (năng suất cao, dễ canh tác…)