Nghiên cứu khoa học PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI GIỔI XƯƠNG (MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN. et GAGNEP.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ cpSSR 1 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI GIỔI XƯƠNG (MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN. et GAGNEP.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ cpSSR Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Đức Thành, Lê Thị Bích Thuỷ Viện Công nghệ Sinh học TÓM TẮT Giổi xương (Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep.) là loài cây gỗ lớn thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), có phân bố tự nhiên ở Nam Trung Quốc, Lào, Myanma và Việt Nam. Một số xuất xứ Giổi xương đã được nhập từ Trung Quốc vào khảo nghiệm ở nước ta và việc đánh giá đa dạng di truyền của các xuất xứ này là cần thiết. Nghiên cứu cho thấy các mẫu Giổi có mức độ đa dạng di truyền gen nhân cao có thể là do tác động của điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của từng vùng cụ thể trong một loài (Giổi xương) để tạo nên các xuất xứ khác biệt nhau và đặc điểm khác biệt của loài Giổi xanh (các mẫu Phú Thọ). Các xuất xứ Giổi có mối quan hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tương đồng di truyền chỉ là 30%) và chia thành 4 nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45%. Nhóm 1 gồm phần lớn các mẫu xuất xứ Puwen (I) và Jiangcheng (II) và hai xuất xứ này cũng tách riêng thành hai nhóm phụ khác hẳn nhau. Nhóm 2 gồm các mẫu xuất xứ Đà Lạt và Phú Thọ, và hai xuất xứ này cũng tách thành hai nhóm phụ riêng biệt. Nhóm 3 gồm các mẫu xuất xứ Menghai (III) và nhóm 4 gồm các mẫu xuất xứ Jinghong (IV). Cặp mồi đặc hiệu cpSSR dùng trong phân tích ADN lục lạp đã không chỉ ra được tính đa hình. Kết quả nhận được cho phép khẳng định sự bảo thủ rất cao về mặt di truyền trong hệ gen lục lạp của Giổi xương. Như vậy việc đưa các xuất xứ từ Trung Quốc vào khảo nghiệm và gây trồng ở nước ta là góp phần vào làm tăng đa dạng di truyền của loài, bổ sung nguồn gen quý cho loài Giổi xương. Từ khoá: Giổi xương, Đa dạng di truyền, RAPD, cpSSR MỞ ĐẦU Giổi xương (Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep.) là loài cây gỗ lớn thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), có phân bố tự nhiên ở nam Trung Quốc, Lào, Myanma và Việt Nam (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2008). Cây có thân thẳng đẹp, sinh trưởng khá, có tiềm năng đưa vào trồng rừng và phục hồi rừng. Gần đây, một số xuất xứ Giổi xương đã được nhập từ Trung Quốc vào khảo nghiệm ở nước ta và việc đánh giá đa dạng di truyền của các xuất xứ này là cần thiết. Trong những năm gần đây, chỉ phân tử được sử dụng một cách rộng rãi và phổ biến trong nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài, phân loại, tìm mối quan hệ di truyền giữa các loài, đánh giá mối quan hệ di truyền trong loài và xuất xứ như nghiên cứu đa dạng di truyền các xuất xứ cây Lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.) (Quách Thị Liên và cs. 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2005), nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Nguyễn Đức Thành và cs., 2005) và của 12 loài thuộc chi Dầu (Dipterocarpus)(Nguyễn Thuý Hạnh và cs., 2005), phân tích đa dạng di truyền loài Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal)(Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2006), Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.)(Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2007). Báo cáo này trình bày kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử RAPD và cpSSR đối với một loài cây rừng có tiềm năng của nước ta là loài Giổi xương từ các nguồn giống được thu tại Việt Nam và Trung Quốc, góp phần làm tăng nền tảng di truyền của loài phục vụ trồng rừng và bảo tồn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu 26 mẫu Giổi gồm 23 mẫu Giổi xương: I16, I2, I4, I15, I19 (Puwen), II3, II4, II7, II14, II16 (Jiangcheng), III 2, III3, III6, III13, III14 (Menghai), IV10, IV12, IV13, IV14, IV15 (Jinghong), DL1, DL2, DL3 (Đà Lạt) và 3 mẫu Giổi xanh: PT1, PT2, PT3 (Phú Thọ). Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPB17, OPC13, OPC9, OPC8, OPC20 (bảng 1). Cặp mồi lục lạp trn S-trnfM của hãng Operon (Mỹ) 2 (bảng 2). Enzyme sử dụng cắt sản phẩm PCR của các mồi lục lạp của hãng Fermentas (Mỹ) gồm: TagI, HinfI, HaeIII. Bảng 1. Trình tự mồi RAPD TT Tên mồi Trình tự 1 OPC1 5’- CTGCTGGGAC -3’ 2 OPC13 5’-AAGCCTCGTC-3’ 3 OPC8 5’- TGGACCGGTG -3’ 4 OPC20 5’-ACTTCGCCAC-3’ 5 OPB17 5’-AGGGAACGAG-3’ Bảng 2. Trình tự mồi lục lạp TT Tên mồi lục lạp Trình tự 1 trn S trnfM 5’-GGT TCG AAT CCC TCT CTC TC-3’ 5’-CAT AAC CTT GAG GTC ACG GG-3’ Phương pháp nghiên cứu ADN genome của các mẫu Giổi được tách từ các mẫu lá khô được bảo quản bằng silicagel theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromicle) của Saghai Maroof và cs (1994), Quách Thị Liên và cs (2004). Phản ứng PCR với các mồi RAPD PCR được tiến hành với tổng thể tích là 25 l/mẫu, gồm những thành phần sau: ADN tổng số (75 ng); mồi RAPD (20 ng); dNTP (200 M mỗi loại); MgCl 2 (1,5 mM); enzyme Taq polymeraza (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94 oC - 3 phút; 94 oC - 1 phút; 35 oC - 1phút; 72 oC - 2 phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 oC - 5 phút; giữ nhiệt độ ở 4C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím. Phản ứng PCR với các mồi lục lạp Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với tổng thể tích là 25l/mẫu gồm những thành phần sau: ADN tổng số (20ng); mồi cpADN(10 ng); dNTP (200M mỗi loại); MgCl 2 (1,5mM); enzym Taq polymeraza (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94 oC - 4phút; 94 oC - 1phút; 57 oC - 1phút; 72 oC - 2phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 oC - 7phút; giữ nhiệt độ ở 4 oC . Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát dưới đèn cực tím. Phân tích số liệu Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker). Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa vào sử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu (Rohlf, 1993). Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: Jij = a/(n-d) a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j Sau đó các mẫu nghiên cứu được sử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Giổi xương. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả phân tích với các mồi RAPD Kết quả tách chiết ADN genome Sản phẩm PCR với các mồi RAPD được điện di trên gel agarose 1% (Ký hiệu của các mẫu là I: xuất xứ Puwen, II: Jiangcheng, III: Menghai, IV: Jinghong từ Trung Quốc, DL: Đà Lạt và PT: Phú Thọ từ Việt Nam). ADN genome tách chiết được có độ tinh sạch cao (hình 1), đủ tiêu chuẩn cho các thí nghiệm tiếp theo. 3 Hình1: ADN genome của một số mẫu Giổi Kết quả phân tích với các mồi RAPD Các sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi (hình 2, 3, 4, 5 và 6) với 5 mồi RAPD đều cho đa hình, điều này cho thấy sự đa dạng ở các mẫu Giổi. Trong 5 mồi này có các mồi OPC13, OPB17 cho nhiều băng đa hình hơn. Ở mồi OPC20 các mẫu I4, II4, II7, II14, II16, DL2, DL3 được nhận biết do sự có mặt của các băng số 7. Ở mồi OPC13 mẫu IV10 được nhận biết do sự vắng mặt của băng số 6. Mồi OPB17 mẫu I15, PT3 được nhận biết do sự có mặt của băng số 4. Ở mồi C1, mẫu DL1 được nhận biết do sự có mặt ở băng số 1, vắng mặt của băng số 2, mẫu PT2 được nhận biết do sự vắng mặt của băng số 3. Hình 2. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi với mồi OPC20 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi). I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 III III12 III13 I16 . I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 III10 III12 III13 Hình 4. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi với mồi OPC13 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi) I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3 M I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3 M I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13III14 IV10 IV12IV13 IV14 IV15DL1DL2DL3PT1PT2 T3 Hình 3. Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi với mồi OPB17 4 Qua các kết quả phân tích với các mồi RAPD cho thấy có sự khác biệt khá lớn ở mức độ gen nhân, có thể là do tác động của điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của loài ở từng vùng cụ thể, làm cho các xuất xứ khác biệt nhau. Điều này còn có thể được giải thích rằng trong số các mẫu thu thập thì các mẫu mang mã hiệu PT là từ loài Giổi xanh (Michelia mediocris) thu từ Phú Thọ, một loài khác biệt hẳn với loài Giổi xương (Michelia baillonii), còn mã hiệu DL là xuất xứ Giổi xương có nguồn gốc từ Đà Lạt, cách xa các xuất xứ từ Trung Quốc hàng nghìn km. Quan hệ di truyền giữa các dòng Giổi Quan hệ di truyền giữa các mẫu Giổi được thể hiện qua cây phân loại. Qua biểu đồ quan hệ di truyền cũng thấy các mẫu Giổi có mối quan hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tương đồng di truyền chỉ là 30%). Có thể nhận thấy các mẫu Giổi chia làm 4 nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45%. Nhóm 1 gồm phần lớn các mẫu xuất xứ Puwen (I) và Jiangcheng (II) và hai xuất xứ này cũng tách riêng thành hai nhóm phụ khác hẳn nhau. Nhóm 2 gồm các mẫu xuất xứ Đà Lạt và Phú Thọ, và hai xuất xứ này cũng tách thành hai nhóm phụ riêng biệt. Nhóm 3 gồm các mẫu xuất xứ Menghai (III) và nhóm 4 gồm các mẫu xuất xứ Jinghong (IV). Tương đồng di truyền của hai mẫu I2 và I15 cũng như PT2 và PT3 là gần hơn cả, tới 94%. Hình 5 . Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi với mồi OPC8 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi) Hình 6 . Sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Giổi với mồi OPC1 ( M: Marker, tiếp theo là các mẫu Giổi) I16 M I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3 M I16 I2 I4 I15 I19 II3 II4 II7 II14 II16 II2 III3 III6 III13 III14 IV10 IV12 IV13 IV14 IV15 DL1 DL2 DL3 PT1 PT2 PT3 5 Hình 3. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Giổi từ phân tích 5 mồi RAPD Kết quả phân tích các mồi lục lạp với enzym giới hạn Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi lục lạp trnS-trnM của các mẫu Giổi cho thấy về kích thước của sản phẩm nhận được phân đoạn đặc trưng và không có đa hình. Điều này cho thấy mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các mẫu Giổi. Để nhận biết rõ hơn về sự khác nhau giữa các xuất xứ Giổi xương, sản phẩm PCR với cặp mồi lục lạp trên được tiếp tục cắt với 3 enzyme TaqI, HinfI, HaeIII với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự ADN. Sau khi cắt enzyme, xét về độ dài sản phẩm cắt enzyme của các mẫu Giổi, ở cặp mồi lục lạp trnS-trnM đều không có đa hình. Không xuất hiện đa hình ở cặp mồi lục lạp trnS-trnM với các enzyme HinfI, TaqI và HaeIII cho thấy trong các mẫu Giổi không có sự khác nhau trong trình tự gen trnS-trnM. Chứng tỏ gen lục lạp của các mẫu Giổi có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Riêng 3 mẫu Phú Thọ (loài Giổi xanh) không cắt được với enzym HaeIII, có thể là 3 mẫu này trong trình tự không có đoạn tương ứng với đầu cắt của enzym đó vì đây là loài khác biệt. Các sản phẩm PCR ADN lục lạp của các mẫu với mồi lục lạp không nhận được đa hình, chứng tỏ về mặt tiến hoá thì các mẫu Giổi xương có cùng nguồn gốc (cùng loài) vì các đoạn gen lục lạp rất bảo thủ và mang tính đặc trưng của loài. Để có thể phân tích sâu sắc và toàn diện hơn về sự khác nhau giữa các dòng Giổi, nên tiếp tục phân tích các mẫu với một số mồi lục lạp khác và tất cả các sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cần được cắt với các enzym giới hạn với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự cpADN. KẾT LUẬN Các mẫu Giổi nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền gen nhân cao có thể là do tác động của điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của từng vùng cụ thể trong một loài (Giổi xương) để tạo nên các xuất xứ khác biệt nhau và đặc điểm khác biệt của loài Giổi xanh (các mẫu Phú Thọ). Các xuất xứ Giổi có mối quan hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tương đồng di truyền chỉ là 6 30%) và chia thành 4 nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45%. Nhóm 1 gồm phần lớn các mẫu xuất xứ Puwen (I) và Jiangcheng (II) và hai xuất xứ này cũng tách riêng thành hai nhóm phụ khác hẳn nhau. Nhóm 2 gồm các mẫu xuất xứ Đà Lạt và Phú Thọ, và hai xuất xứ này cũng tách thành hai nhóm phụ riêng biệt. Nhóm 3 gồm các mẫu xuất xứ Menghai (III) và nhóm 4 gồm các mẫu xuất xứ Jinghong (IV). Tương đồng di truyền của hai mẫu I2 và I15 cũng như PT2 và PT3 là gần hơn cả, tới 94%. Như vậy việc đưa các xuất xứ từ Trung Quốc vào khảo nghiệm và gây trồng ở nước ta là góp phần vào làm tăng đa dạng di truyền của loài, bổ sung nguồn gen quý cho laòi Giổi xương. Các sản phẩm PCR ADN lục lạp của các mẫu với mồi lục lạp không nhận được đa hình, chứng tỏ về mặt tiến hoá thì các mẫu Giổi xương có cùng nguồn gốc (cùng loài) vì các đoạn gen lục lạp rất bảo thủ và mang tính đặc trưng của loài. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2008. Átlát cây rừng Việt Nam, tập 2. Nhà xuất bản Bản đồ, Hà Nội, 250 trang. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp. Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2005. 1379-1382. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Đức Thành, Trần Thùy Linh, 2007. Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz)) bằng chỉ thị phân tử RAPD. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 14/2007, 44-48. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, 2005. Kết quả bước đầu đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh bằng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 15/2005, 80-81. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Văn Tiến, Nguyễn Thúy Hạnh, Nguyễn Đức Thành, 2006. Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Sao hình lá tim (Hopea cordata Vidal) thuộc họ dầu (Dipterocarpaceae) bằng chỉ thị phân tử. Thông tin khoa học kỹ thuật Lâm nghiệp, 1:1-6. Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89-92. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2004. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh (Erythrophleum fordii Oliv.). Báo cáo khoa học, Hội nghị toán quốc 2004: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật: 464-468. Rohlf F. J., 1993. “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version 1.80. Applied Biostatitics, New York. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470. ANALYSIS OF THE GENETIC DIVERSITY OF MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN et GAGNEP. BY RAPD AND cpSSR MARKERS Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Vietnam Nguyen Đuc Thanh, Le Thi Bich Thuy Biotechnology Institute SUMMARY Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep. is a species of Magnoliaceae which has its natural distribution in south China, Laos, Myanmar and Vietnam. Some provenances of the species were introduced for trials and evaluation of genetic their diversity is necessary. Twenty-three (23) leaf 7 samples collected from different provenances (three from China and one from Vietnam) of Michelia baillonii and three samples of Michelia mediocris were genetically analyzed by RAPD and cpSSR markers. Analysis has shown clear differences between provenances within Michelia baillonii and between the two Michelia species. Genetic similarity between provenances was only 30% and they divided into four groups with a difference of 45% in genetic relationship. Group No.1 includes samples from Puwen (I) and Jiangcheng (II) and these two provenances also divided into two separate subgroups. Group No.2 includes samples from Da Lat and Phu Tho provenances but they also divided into two separate subgroups. Group No.3 includes samples from Menghai provenance (III) while Group No.4 includes samples from Jinghong provenance (IV). The cpSSR maker used in molecular analysis did not give polymorphic DNA bands. This means that the genetic content in chloroplast DNA of Michelia baillonii is highly conservative. Therefore the introduction of provenances from China into trials and planting in Vietnam can increase the genetic diversity of the species. Keywords: Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep., Genetic diversity, cpSSR, RAPD. . Nghiên cứu khoa học PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI GIỔI XƯƠNG (MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN. et GAGNEP. ) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ cpSSR 1 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI. TRUYỀN LOÀI GIỔI XƯƠNG (MICHELIA BAILLONII (PIERRE) FIN. et GAGNEP. ) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ cpSSR Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Đức Thành, Lê Thị Bích Thuỷ. Quốc vào khảo nghiệm và gây trồng ở nước ta là góp phần vào làm tăng đa dạng di truyền của loài, bổ sung nguồn gen quý cho loài Giổi xương. Từ khoá: Giổi xương, Đa dạng di truyền, RAPD, cpSSR