BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bùi Thị Liên LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus chinensis) Hà Nội – 2021 Vietnam Academy of Science and Technology BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bùi Thị Liên NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus chinensis) Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 842 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Phí Quyết Tiến Hà Nội – 2021 Vietnam Academy of Science and Technology i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh gây độc tế bào vi nấm nội sinh thông đỏ (Taxus chinensis)” trực tiếp thực hướng dẫn PGS TS Phí Quyết Tiến Số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn xác, trung thực Mọi thơng tin nội dung tham khảo báo cáo trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Bùi Thị Liên Vietnam Academy of Science and Technology ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Phí Quyết Tiến – Phó Viện Trưởng Viện Công nghệ sinh học; Giám đốc Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên cứu, tận tình bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Vũ Thị Hạnh Nguyên, TS Quách Ngọc Tùng cán Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật tận tình hướng dẫn, bảo em thực thí nghiệm phạm vi luận án đồng thời truyền đạt nhiều kinh nghiệm thực tiễn quý giá hoạt động nghiên cứu khoa học lĩnh vực vi sinh vật học Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học Hợp tác quốc tế Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức trình học tập Học viện Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân động viên, hậu phương vững giúp em có động lực học tập Luận văn thực nhờ hỗ trợ kinh phí Đề tài: “Nghiên cứu khai thác nấm nội sinh dược liệu địa nhằm thu nhận số hợp chất (paclitaxel số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/2022 Vietnam Academy of Science and Technology iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ A-549 Ung thư phổi người (human lung carcinoma) bapt baccatin III:3-amino-3 phenylpropanoyltransferase BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair CMV Virus cytomegalo dbat taxane 10b-hydroxylase DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic Acid FDA Cục Quản lý Thực phẩm Dược Phẩm Mỹ HGT Horizontal gene transfer – Chuyển gen ngang IC50 Nồng độ ức chế 50% ITS Internal transcribed spacer kDa kiloDalton MCF7 Ung thư vú người (human breast carcinoma) MIC Minimun inhibitory concentrations – Nồng độ ức chế tối thiểu NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density – Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction SRB Sulforhodamine B TCA Trichloracetic acid TLTK Tài liệu tham khảo ts taxadiene synthase VSV Vi sinh vật Vietnam Academy of Science and Technology iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm chủng vi nấm nội sinh thực vật Bảng 2.1 Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen dbat, bapt ts 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen dbat, bapt ts 24 Bảng 3.1 Khả gây độc tế bào ung thư chủng vi nấm nội sinh thông đỏ Bắc 30 Bảng 3.2 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TQF6 với chủng tham chiếu 41 Bảng 3.3 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TQF25 với chủng tham chiếu 42 Bảng 3.4 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TDF6 với chủng tham chiếu 43 Bảng 3.5 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TDF7 với chủng tham chiếu 44 Vietnam Academy of Science and Technology v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ vi vật nội sinh chủ Hình 1.2 Một số chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh Hình 1.3 Cấu trúc số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh 10 Hình 1.4 Cây thơng đỏ bắc (Taxus chinensis) 12 Hình 1.5 Con đường sinh tổng hợp paclitaxel 16 Hình 3.1 Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) MRSE ATCC 35984 (B) số chủng vi nấm nội sinh 27 Hình 3.2 Tỉ lệ ức chế chủng vi nấm nội sinh VSV kiểm định 28 Hình 3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi nấm nội sinh thông đỏ Ghi chú: E coli ATCC 11105; C albicans ATCC 10231; B cereus ATCC 11778; MRSE ATCC 35984; P aeruginosa ATCC 9027; MRSA ATCC 33591; E faecalis ATCC 29212 29 Hình 3.4 Hoạt tính loại bỏ gốc tự DPPH chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn 32 Hình 3.5 Điên di DNA tổng số chủng vi nấm tuyển chọn gel agarose 1,0% Giếng M: thang DNA chuẩn kb (Thermo scientific, Mỹ) 34 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen tham gia sinh tổng hợp paclitaxel chủng tuyển chọn gel agarose 1,0% Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: đối chứng âm 35 Hình 3.7 Khuẩn lạc môi trường Czapek-Dox sau ngày bào tử kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần chủng TQF6 (a, b, c) TQF25 (d, e, f) 38 Hình 3.8 Khuẩn lạc mơi trường Czapek-Dox sau ngày bào tử kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần chủng TDF6 (a, b, c) TDF7 (d, e, f) 38 Vietnam Academy of Science and Technology vi Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS gel agarose 1,0% Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: đối chứng âm 39 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại chủng TQF6, TQF25, TDF6 TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật tốn Kimuar với nhóm ngồi Murco bainieri (NR 103628) 45 Vietnam Academy of Science and Technology vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU 1.1.1 Giới thiệu vi nấm nội sinh 1.1.2 Sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh 1.1.2.1 Hoạt chất kháng khuẩn kháng nấm 1.1.2.2 Hoạt chất gây độc tế bào ung thư 1.1.2.3 Hoạt chất kháng virus 1.2.1 Cây thông đỏ (Taxus spp.) 11 1.2.3 Các chất kháng sinh gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh thông đỏ 15 1.2.4 Ứng dụng thị phân tử sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel dẫn xuất paclitaxel 16 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG 19 2.1.1 Chủng giống 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 20 2.2.2 Tách chiết hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh 21 Vietnam Academy of Science and Technology viii 2.2.3 Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư 21 2.2.4 Khảo sát khả loại bỏ gốc tự DPPH chủng tuyển chọn 23 2.2.5 Khảo sát khả sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng gen thị 23 2.2.6 Xác định đặc điểm hình thái bào tử chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn 24 2.2.7 Phân loại chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn giải phân tích trình tự vùng ITS 25 2.2.8 Xử lý thống kê số liệu 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ 27 3.2 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH 29 3.3 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ DỊCH CHIẾT THƠ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM 31 3.4 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM 33 3.5 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 37 3.5.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử cuống sinh bào tử chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn 37 3.5.2 Phân loại chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn giải phân tích trình tự ITS 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 56 Vietnam Academy of Science and Technology 43 Bảng 3.4 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TDF6 với chủng tham chiếu Chủng TDF6 F foetens CBS 110286 (NR_15986) F inflexum NRRL 20433 (NR_152941) F bactridioides CBS 100057 (NR_120262) F circinatum CBS 405.97 (NR_120263) F pseudocircinatum CBS 449.97 (NR_163683) TDF6 100,00 99,58 98,92 98,95 99,16 98,92 F foetens CBS 110286 (NR_159865) 99,58 100,00 95,99 95,69 95,88 95,59 F inflexum NRRL 20433 (NR_152941) 98,92 95,99 100,00 98,46 98,65 98,40 F bactridioides CBS 100057 (NR_120262) 98,95 95,69 98,46 100,00 99,82 99,60 F circinatum CBS 405.97 (NR_120263) 99,16 95,88 98,65 99,82 100,00 99,80 F pseudocircinatum CBS 449.97 (NR_163683) 98,92 95,59 98,40 99,60 99,80 100,00 Vietnam Academy of Science and Technology 44 Bảng 3.5 Ma trận độ tương đồng trình tự ITS chủng TDF7 với chủng tham chiếu Chủng TDF7 F foetens CBS 110286 (NR_15985) F inflexum NRRL 20433 (NR_152941) F pseudoanthophilum CBS 414.97 (NR_163682) F circinatum CBS 405.97 (NR_120263) F bactridioides CBS 100057 (NR_120262) TDF7 100,00 92,95 89,92 88,91 87,96 87,80 F foetens CBS 110286 (NR_159865) 92,95 100,00 95,99 95,50 95,88 95,69 F inflexum NRRL 20433 (NR_152941) 89,92 95,99 100,00 98,27 98,65 98,46 F pseudoanthophilum CBS 414.97 (NR_163682) 88,91 95,50 98,27 100,00 99,63 99,45 F circinatum CBS 405.97 (NR_120263) 87,96 95,88 98,65 99,63 100,00 99,82 F bactridioides CBS 100057 (NR_120262) 87,80 95,69 98,46 99,45 99,82 100,00 Vietnam Academy of Science and Technology 45 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại chủng TQF6, TQF25, TDF6 TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar với nhóm ngồi Murco bainieri (NR 103628) Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS từ chủng TDF6 TDF7 cho băng điện di sắc nét có kích thước khoảng 550 bp (Hình 3.9) So sánh trình tự gen ITS chủng TDF6 với gen tham chiếu sở liệu GenBank (NCBI) cho thấy, chủng TDF6 thể độ tương đồng cao với chủng nấm Fusarium foetens CBS 110286 (99,58%), F pseudoanthophilum CBS 414.97 (99,36%) F circinatum CBS 405.97 (98,74%) (Bảng 3.4) Tương tự, chủng TDF7 có độ tương đồng cao với chủng nấm Fusarium foetens CBS 110286 (99,59%), F pseudoanthophilum CBS 414.97 (98,00%) F circinatum CBS 405.97 (98,37%) (Bảng 3.5) Cây phát sinh loài khẳng định Vietnam Academy of Science and Technology 46 chủng TDF6 TDF7 thuộc nhóm (Hình 3.10) Kết hợp đặc điểm hình thái so với với cơng bố trước trình tự ITS, chủng nấm TDF6, TDF7 phân loại thuộc loài Fusarium foetens Năm 2016, Vasundhara báo cáo hoạt tính chống oxy hóa ức chế sư phát triển tế bào chủng F tricinctum T6 phân lập từ thông đỏ (T tabaca L subsp wallichiana (Zucc.) Pilger) Ấn Độ Chủng F tricinctum T6 cho thấy ức chế phát triển dòng tế bào ung thư MCF-7 HeLa với giá trị IC 50 dịch chiết nấm 225 ± 26 220 ± 18 μg/L dòng tế bào MCF-7 HeLa Hơn nữa, F tricinctum thể hoạt tính chống oxy hóa với giá trị IC 50 482 ± μg/mL [52] Năm 2015, Zaiyou cộng phân lập 435 chủng vi nấm nội sinh từ T wallichiana var mairei Trong đó, có chủng thuộc chi Fusarium có khả sản xuất paclitaxel Năng suất paclitaxel toàn môi trường nuôi cấy PDB môi trường nuôi cấy qua sử dụng từ chủng 0,0153 mg/L 0,0119 mg/L Hàm lượng paclitaxel sợi nấm khô 0,27 mg/kg Các kết cho thấy tiềm sản xuất paclitaxel từ chủng Fusarium nói chung chủng Fusarium foetens TDF7 nói riêng lớn [73] Fusarium foetens biết đến loài nấm gây bệnh héo hải đường (Begonia hiemalis) phát Begonia Canada, Mỹ, Nhật Bản, Hà Lan, Đức Na Uy F foetens chưa báo cáo nhiều khả sinh hợp chất kháng khuẩn gây độc tế bào ung thư, nhiên chất có hoạt chất sinh học phân lập từ loài khác thuộc chi Fusarium nhiều Vietnam Academy of Science and Technology 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN  Từ 25 chủng vi nấm nội sinh thông đỏ (T chinesis) thu thập Hà Giang, sàng lọc 12/25 (chiếm 48%) chủng có khả kháng VSV kiểm định Tuyển chọn chủng nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 có khả kháng chủng VSV kiểm định  Chủng TDF7 ức chế mạnh với tế bào ung thư phổi A549 MCF7 với tỷ lệ ức chế tế bào đạt 93,91 ± 2,18% 89,22 ± 4,09 Tỷ lệ ức chế tế bào tế bào ung thư phổi A-549 ung thư vú MCF-7 chủng TDF6 đạt 92,65 ± 1,4% 77,15 ± 1,98%  Cả chủng TQF6, TQF25, TDF6 TDF7 có hoạt tính chống oxy hóa cao Tại nồng độ 400 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH TQF6, TQF25, TDF6 TDF7 93,78; 93,49; 89,15 60,71%  Đánh giá khả sinh paclitaxel chủng TQF6, TQF25, TDF6 TDF7 thị phân tử cho thấy chủng TQF25 mang hai gen dbat bapt, chủng TQF6 TDF6 mang gen dbat; gen dbat, bapt ts không khuếch đại chủng TDF7  Kết hợp đặc điểm hình thái, bào tử phân tích trình tự gen ITS, chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 định danh Neofusicoccum italicum TQF6, Hypoxylon sp TQF25, Fusarium foetens TDF6 Fusarium foetens TDF7 KIẾN NGHỊ  Tiếp tục nghiên cứu tối ưu môi trường điều kiện lên men nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng sinh ức chế tế bào ung thư từ chủng vi nấm TQF6, TQF25, TDF6 TDF7  Tách chiết phân tích cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học từ dịch lên men chủng vi nấm Vietnam Academy of Science and Technology 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bano, N., I.F Rizvi, N Sharma, M.H Siddiqui, M Kalim, A Khan, and S Akhtar, 2016, Production of bioactive secondary metabolites from endophytic fungi, International Research Journal of Engineering and Technology, 3(6), pp 11-21 Daisy, B.H., G.A Strobel, U Castillo, D Ezra, J Sears, D.K Weaver, and J.B Runyon, 2002, Naphthalene, an insect repellent, is produced by Muscodor vitigenus, a novel endophytic fungus, Microbiology, 148(11), pp 3737-3741 Schulz, B and C Boyle, 2005, The endophytic continuum, Mycological Research, 109(6), pp 661-686 Arnold, A.E., L.C Mejía, D Kyllo, E.I Rojas, Z Maynard, N Robbins, and E.A Herre, 2003, Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree, Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(26), pp 15649-15654 Howitz, K.T and D.A Sinclair, 2008, Xenohormesis: sensing the chemical cues of other species, Cell, 133(3), pp 387-391 Wu, Y.-Y., T.-Y Zhang, M.-Y Zhang, J Cheng, and Y.-X Zhang, 2018, An endophytic Fungi of Ginkgo biloba L produces antimicrobial metabolites as potential inhibitors of FtsZ of Staphylococcus aureus, Fitoterapia, 128(pp 265-271 Hawksworth, D.L., 2001, The magnitude of fungal diversity: the 1· million species estimate revisited, Mycological Research, 105(12), pp 1422-1432 Schulz, B., C Boyle, S Draeger, A.-K Römmert, and K Krohn, 2002, Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites, Mycological Research, 106(9), pp 996-1004 Huang, W., Y Cai, K Hyde, H Corke, and M Sun, 2008, Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants, Fungal diversity, pp 11-19 10 Dreyfuss, M and I.H Chapela, Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight pharmaceuticals, in Discovery of Novel Natural Products with Therapeutic Potential 1994 p 49-80 Vietnam Academy of Science and Technology 49 11 Aly, A.H., R Edrada-Ebel, I.D Indriani, V Wray, W.E Müller, F Totzke, U Zirrgiebel, C Schächtele, M.H Kubbutat, and W Lin, 2008, Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte Alternaria sp and their subsequent detection in its host plant Polygonum senegalense, Journal of Natural Products, 71(6), pp 972-980 12 Ibrahim, S.R., H.M Abdallah, E.S Elkhayat, N.M Al Musayeib, H.Z Asfour, M.F Zayed, and G.A Mohamed, 2018, Fusaripeptide A: new antifungal and anti-malarial cyclodepsipeptide from the endophytic fungus Fusarium sp, Journal of Asian Natural Products Research, 20(1), pp 75-85 13 Strobel, G and B Daisy, 2003, Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), pp 491-502 14 Li, J.Y and G.A Strobel, 2001, Jesterone and hydroxy-jesterone antioomycete cyclohexenone epoxides from the endophytic fungus Pestalotiopsis jesteri, Phytochemistry, 57(2), pp 261-265 15 Lugtenberg, B.J., J.R Caradus, and L.J Johnson, 2016, Fungal endophytes for sustainable crop production, FEMS Microbiology Ecology, 92(12), pp 88-94 16 Demain, A.L., 2000, Microbial natural products: a past with a future, Special publication-royal society of chemistry, 257(pp 3-16 17 Berardo, C., I.M Bulai, E Venturino, P Baptista, and T Gomes, 2018, Modeling the endophytic fungus Epicoccum nigrum action to fight the “olive knot” disease caused by Pseudomonas savastanoi pv savastanoi (Psv) bacteria in Olea europaea L Trees, Trends in Biomathematics: Modeling, Optimization Computational Problems, pp 189-207 18 Tayung, K., B Barik, D Jha, and D Deka, 2011, Identification and characterization of antimicrobial metabolite from an endophytic fungus, Fusarium solani isolated from bark of Himalayan yew, Mycosphere, Journal of Fungal Biology, 2(3), pp 203-213 19 Rao, H.Y and S Satish, 2015, Genomic and chromatographic approach for the discovery of polyketide antimicrobial metabolites from an endophytic Phomopsis liquidambaris CBR-18, Frontiers in Life Science, 8(2), pp 200-207 Vietnam Academy of Science and Technology 50 20 Tawfik, N., R Abdo, G Abbott, U.R Abdelmohsen, R Edrada-Ebel, and E Haggag, 2017, Metabolomics and Bioactivity Guided Isolation of Secondary Metabolites from the Endophytic Fungus Chaetomium sp, Journal of Advanced Pharmacy Research, 1(1), pp 66-74 21 Ma, Y.-m., K Qiao, Y Kong, M.-y Li, L.-x Guo, Z Miao, and C Fan, 2017, A new isoquinolone alkaloid from an endophytic fungus R22 of Nerium indicum, Natural Product Research, 31(8), pp 951-958 22 Lai, D., A Wang, Y Cao, K Zhou, Z Mao, X Dong, J Tian, D Xu, J Dai, and Y Peng, 2016, Bioactive dibenzo-α-pyrone derivatives from the endophytic fungus Rhizopycnis vagum Nitaf22, Journal of Natural Products, 79(8), pp 2022-2031 23 Wu, L.-S., M Jia, L Chen, B Zhu, H.-X Dong, J.-P Si, W Peng, and T Han, 2016, Cytotoxic and antifungal constituents isolated from the metabolites of endophytic fungus DO14 from Dendrobium officinale, Molecules, 21(1), pp 14-21 24 Xie, S and J Zhou, 2017, Harnessing plant biodiversity for the discovery of novel anticancer drugs targeting microtubules, Frontiers in plant science, 8(pp 720-727 25 Stierle, A., G Strobel, and D Stierle, 1993, Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew, Science, 260(5105), pp 214-216 26 Puri, S.C., A Nazir, R Chawla, R Arora, S Riyaz-ul-Hasan, T Amna, B Ahmed, V Verma, S Singh, and R Sagar, 2006, The endophytic fungus Trametes hirsuta as a novel alternative source of podophyllotoxin and related aryl tetralin lignans, Journal of Biotechnology, 122(4), pp 494-510 27 Jiao, R.H., S Xu, J.Y Liu, H.M Ge, H Ding, C Xu, H.L Zhu, and R.X Tan, 2006, Chaetominine, a cytotoxic alkaloid produced by endophytic Chaetomium sp IFB-E015, Organic Letters, 8(25), pp 5709-5712 28 Guo, B., J.-R Dai, S Ng, Y Huang, C Leong, W Ong, and B.K Carté, 2000, Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species, Journal of Natural Products, 63(5), pp 602-604 Vietnam Academy of Science and Technology 51 29 Kumar, G., P Chandra, and M Choudhary, 2017, Endophytic fungi: A potential source of bioactive compounds, Chemical Science Review and Letters, 6(pp 2373-2381 30 Raekiansyah, M., M Mori, K Nonaka, M Agoh, K Shiomi, A Matsumoto, and K Morita, 2017, Identification of novel antiviral of fungus-derived brefeldin A against dengue viruses, Tropical medicine health, 45(1), pp 1-7 31 Khiralla, A., R Spina, S Saliba, and D Laurain-Mattar, 2019, Diversity of natural products of the genera Curvularia and Bipolaris, Fungal Biology Reviews, 33(2), pp 101-122 32 Toghueo, R.M.K., 2020, Bioprospecting endophytic fungi from a genus as sources of bioactive metabolites, Mycology, 11(1), pp 1-21 33 Kouipou Toghueo, R.M and F.F Boyom, 2019, Endophytic fungi from Terminalia species: a comprehensive review, Journal of Fungi, 5(2), pp 43-52 34 Govindappa, M., 2015, A review on role of plant (s) extracts and its phytochemicals for the management of diabetes, Journal of Diabetes & Metabolism, 6(7), pp 1-38 35 Gupta, S., P Chaturvedi, M.G Kulkarni, and J Van Staden, 2020, A critical review on exploiting the pharmaceutical potential of plant endophytic fungi, Biotechnology Advances, 39(pp 107462-107471 36 Aharwal, R.P., S Kumar, and S.S Sandhu, 2016, Endophytic mycoflora as a source of biotherapeutic compounds for disease treatment, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 6(10), pp 242254 37 Wang, L.-W., J.-L Wang, J Chen, J.-J Chen, J.-W Shen, X.-X Feng, C.P Kubicek, F.-C Lin, C.-L Zhang, and F.-Y Chen, 2017, A novel derivative of (-) mycousnine produced by the endophytic fungus Mycosphaerella nawae, exhibits high and selective immunosuppressive activity on T cells, Frontiers in Microbiology, 8(pp 1251-1259 38 Wani, M.C., H.L Taylor, M.E Wall, P Coggon, and A.T McPhail, 1971, Plant antitumor agents VI Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, Journal of the American Chemical Society, 93(9), pp 2325-2327 Vietnam Academy of Science and Technology 52 39 Yamawaki, C., Y Yamaguchi, A Ogita, T Tanaka, and K.-i Fujita, 2018, Dehydrozingerone exhibits synergistic antifungal activities in combination with dodecanol against budding yeast via the restriction of multidrug resistance, Planta Medica International Open, 5(02), pp 6167 40 Kim, H., Y Seok, and M Rhee, 2020, Synergistic staphylocidal interaction of benzoic acid derivatives (benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid and β-resorcylic acid) and capric acid: mechanism and verification study using artificial skin, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 75(3), pp 571-575 41 O Elansary, H., A Szopa, M Klimek-Szczykutowicz, H Ekiert, A.A Barakat, and F A Al-Mana, 2020, Antiproliferative, antimicrobial, and antifungal activities of polyphenol extracts from Ferocactus species, Processes, 8(2), pp 138-145 42 Hronská, H., S Tokošová, A Pilniková, Ľ Krištofíková, and M Rosenberg, 2015, Bioconversion of fumaric acid to L-malic acid by the bacteria of the genus Nocardia, Applied biochemistry biotechnology, 175(1), pp 266-273 43 Ni, H., S.F Zhang, Q.F Gao, Y Hu, Z.D Jiang, and F Chen, 2015, Development and evaluation of simultaneous quantification of naringin, prunin, naringenin, and limonin in citrus juice, Food science biotechnology, 24(4), pp 1239-1247 44 Wang, Y.-T., H.-S Lo, and P.-H Wang, 2008, Endophytic fungi from Taxus mairei in Taiwan: first report of Colletotrichum gloeosporioides as an endophyte of Taxus mairei, Botanical Studies, 49(1), pp 39-43 45 Ashkezari, S.J and K.-B Fotouhifar, 2017, Diversity of endophytic fungi of common yew (Taxus baccata L.) in Iran, Mycological progress, 16(3), pp 247-256 46 Zhang, H.-C., Y.-M Ma, R Liu, and F Zhou, 2012, Endophytic fungus Aspergillus tamarii from Ficus carica L., a new source of indolyl diketopiperazines, Biochemical Systematics and Ecology, 45(pp 31-33 47 Garyali, S., M Reddy, and A Kumar, Diversity of taxol producing endophytic fungi from Taxus baccata and process optimization for taxol production 2014, Thapar University, Patiala Vietnam Academy of Science and Technology 53 48 Hezari, M., N.G Lewis, and R Croteau, 1995, Purification and characterization of taxa-4 (5), 11 (12)-diene synthase from Pacific yew (Taxus brevifolia) that catalyzes the first committed step of taxol biosynthesis, Archives of Biochemistry Biophysics, 322(2), pp 437444 49 Kusari, S., C Hertweck, and M Spiteller, 2012, Chemical ecology of endophytic fungi: origins of secondary metabolites, Chemistry biology, 19(7), pp 792-798 50 Đàm Sao Mai and Võ Trung Âu, 2014, Nghiên cứu phân lập xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ thông đỏ vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng, Tạp chí sinh học, 36(1se), pp 84-89 51 El-Sayed, A.S., D.M Ali, M.A Yassin, R.A Zayed, and G.S Ali, 2019, Sterol inhibitor “Fluconazole” enhance the Taxol yield and molecular expression of its encoding genes cluster from Aspergillus flavipes, Process Biochemistry, 76(pp 55-67 52 Vasundhara, M., M Baranwal, and A Kumar, 2016, Fusarium tricinctum, an endophytic fungus exhibits cell growth inhibition and antioxidant activity, Indian journal of microbiology, 56(4), pp 433438 53 Skehan, P., R Storeng, D Scudiero, A Monks, J McMahon, D Vistica, J.T Warren, H Bokesch, S Kenney, and M.R Boyd, 1990, New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, Journal of the National Cancer Institute, 82(13), pp 1107-1112 54 Hughes, J.P., S Rees, S.B Kalindjian, and K.L Philpott, 2011, Principles of early drug discovery, British Journal of Pharmacology, 162(6), pp 1239-1249 55 Rahaman, M.S., M.A Siraj, S Sultana, V Seidel, and M.A Islam, 2020, Molecular phylogenetics and biological potential of fungal endophytes from plants of the sundarbans Mangrove, Frontiers in Microbiology, 11(pp 211-223 56 Zhou, X., Z Wang, K Jiang, Y Wei, J Lin, X Sun, and K Tang, 2007, Screening of taxol-producing endophytic fungi from Taxus chinensis var mairei, Applied Biochemistry Microbiology, 43(4), pp 439-443 Vietnam Academy of Science and Technology 54 57 Zhang, P., P.-p Zhou, C Jiang, H Yu, and L.-j Yu, 2008, Screening of taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus, Biotechnology Letters, 30(12), pp 2119-2123 58 Fennell, D.I., The genus Talaromyces: studies on Talaromyces and related genera II 1973, JSTOR 59 Braun, U., P.W Crous, J.Z Groenewald, and C Scheuer, 2011, Pseudovirgaria, a fungicolous hyphomycete genus, IMA fungus, 2(1), pp 65-69 60 Roopa, G., M Madhusudhan, K Sunil, N Lisa, R Calvin, R Poornima, N Zeinab, K Kini, H Prakash, and N Geetha, 2015, Identification of Taxol-producing endophytic fungi isolated from Salacia oblonga through genomic mining approach, Journal of Genetic Engineering Biotechnology, 13(2), pp 119-127 61 Gauchan, D.P., H Vélëz, A Acharya, J.R Östman, K Lundén, M Elfstrand, and M.R García-Gil, 2021, Annulohypoxylon sp strain MUS1, an endophytic fungus isolated from Taxus wallichiana Zucc., produces taxol and other bioactive metabolites, Biotech, 11(3), pp 116 62 Gauchan, D.P., P Kandel, A Tuladhar, A Acharya, U Kadel, A Baral, A.B Shahi, and M.R García-Gil, 2020, Evaluation of antimicrobial, antioxidant and cytotoxic properties of bioactive compounds produced from endophytic fungi of Himalayan yew (Taxus wallichiana) in Nepal, FResearch, 9(pp 1-11 63 Quach, N.T., Q.H Nguyen, T.H.N Vu, T.T.H Le, T.T.T Ta, T.D Nguyen, T Van Doan, T.T Dang, X.C Nguyen, and H.H Chu, 2021, Plant-derived bioactive compounds produced by Streptomyces variabilis LCP18 associated with Litsea cubeba (Lour.) Pers as potential target to combat human pathogenic bacteria and human cancer cell lines, Brazilian Journal of Microbiology, pp 1-10 64 Fatima, N., T.P Kondratyuk, E.-J Park, L.E Marler, M Jadoon, M.A Qazi, H Mehboob Mirza, I Khan, N Atiq, and L.C Chang, 2016, Endophytic fungi associated with Taxus fuana (West Himalayan Yew) of Pakistan: potential bio-resources for cancer chemopreventive agents, Pharmaceutical Biology, 54(11), pp 2547-2554 Vietnam Academy of Science and Technology 55 65 Vasundhara, M., M Baranwal, N Sivaramaiah, and A Kumar, 2017, Isolation and characterization of trichalasin-producing endophytic fungus from Taxus baccata, Annals of Microbiology, 67(3), pp 255261 66 Liu, X., X Wu, Y Ma, W Zhang, L Hu, X Feng, X Li, and X Tang, 2017, Endophytic fungi from mangrove inhibit lung cancer cell growth and angiogenesis in vitro, Oncology Reports, 37(3), pp 1793-1803 67 Mane, R.S and A.B Vedamurthy, 2020, Mycochemical Analysis And Anticancer Activity Of Endophytic Aspergillus nomius Against MCF7 Human Breast Cancer Cell Line, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 11(2), pp 1-6 68 Xiong, Z.-Q., Y.-Y Yang, N Zhao, and Y Wang, 2013, Diversity of endophytic fungi and screening of fungal paclitaxel producer from Anglojap yew, Taxus x media, BMC Microbiology, 13(1), pp 1-10 69 Cadelis, M.M., S Geese, B.B Uy, D.R Mulholland, S.J van de Pas, A Grey, B.S Weir, B.R Copp, and S Wiles, 2021, Antimicrobial Metabolites against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from the Endophytic Fungus Neofusicoccum australe, Molecules, 26(4), pp 1094-2001 70 Salvatore, M.M., A Alves, and A Andolfi, 2021, Secondary Metabolites Produced by Neofusicoccum Species Associated with Plants: A Review, Agriculture, 11(2), pp 149-156 71 Sir, E.B., E Kuhnert, C Lambert, A.I Hladki, A.I Romero, and M Stadler, 2016, New species and reports of Hypoxylon from Argentina recognized by a polyphasic approach, Mycological Progress, 15(4), pp 1-8 72 Wu, Z.C., D.L Li, Y.C Chen, and W.M Zhang, 2010, A new isofuranonaphthalenone and benzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp A4 from Aquilaria sinensis, Helvetica Chimica Acta, 93(5), pp 920-924 73 Zaiyou, J., M Li, and H Xiqiao, 2017, An endophytic fungus efficiently producing paclitaxel isolated from Taxus wallichiana var mairei, Medicine, 96(27), pp 1-9 Vietnam Academy of Science and Technology 56 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập Hà Giang STT Kí hiệu chủng Vị trí TQF3 Quản Bạ TQF4 Quản Bạ TQF5 Quản Bạ TQF6 Quản Bạ TQF11 Quản Bạ TQF12 Quản Bạ TQF17 Quản Bạ TQF18 Quản Bạ TQF19 Quản Bạ 10 TQF20 Quản Bạ 11 TQF21 Quản Bạ 12 TQF22 Quản Bạ 13 TQF23 Quản Bạ 14 TQF24 Quản Bạ 15 TQF25 Quản Bạ 16 TDF2 Đồng Văn 17 TDF4 Đồng Văn 18 TDF6 Đồng Văn 19 TDF7 Đồng Văn 20 TDF8 Đồng Văn 21 TDF9 Đồng Văn 22 TDF10 Đồng Văn 23 TDF11 Đồng Văn 24 TDF14 Đồng Văn 25 TDF18 Đồng Văn Tọa độ 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E Bộ phận Môi trường Rễ PDA Rễ PDA Rễ PDA Rễ MEA Thân PDA Thân PDA Lá PDA Lá PDA Lá PDA Lá MEA Lá MEA Lá MEA Lá MEA Lá MEA Lá PDA Rễ PDA Rễ PDA Rễ MEA Rễ MEA Rễ MEA Rễ MEA Rễ AGA Thân PDA Thân PDA Lá PDA Vietnam Academy of Science and Technology 57 Phụ lục Trình tự gen ITS chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn LOCUS 61 121 181 241 301 361 421 481 GGCTCGACTC CGCACCGGCG AGTGAACTTC TGGTTCTGGC CAGTGAATCA TGTTCGAGCG CGCGCCTTAA TTGGAGCGCA GGATCAGGTA TQF TCCCACCCAA CCCTTCGGGG GCAGTCTGAA ATCGATGAAG TCGAATCTTT TCATTTCAAC AGACCTCGGC CGGCGTCGCC GGGATACCCG 532 bp TGTGTACCTA GGCTGGCCAG AAACAAGTTA AACGCAGCGA GAACGCACAT CCTCAAGCTC GGTGGCGTCT CGCCGGACGA CTGAACTTAA CCTCTGTTGC CGCCCGCCAG ATAAACTAAA AATGCGATAA TGCGCCCCTT TGCTTGGTAT TGCCTCAAGC ACCTTTGAAT GCATATCAAT DNA linear TTTGGCGGGC AGGACCATAA ACTTTCAACA GTAATGTGAA GGTATTCCGA TGGGCCCCGT GTAGTAGAAA TATTTCTCAA AAGCCGGAGG CGCGGTCCTC AACTCCAGTC ACGGATCTCT TTGCAGAATT GGGGCATGCC CCTCCACGGA ACACCTCGCT GGTTGACCTC AA Hình Trình tự chủng TQF6 LOCUS 61 121 181 241 301 361 421 481 TCCCAACCCT GTGGACCTAA AACTTTCAAC AGTAATGTGA TAGTATTCTA GTGTTGGGAC ACTCTAGGCG ACCCCTATAT TATCAATAAG TQF25 ATGTGAACAT ACGCTAATTG AACGGATCTC ATTGCAGAAT GTGGGCATGC TCTGCGTGTT TAGTAAATAC TTCTAGTGGT CGGAGGAA 498 bp ACTATTGTTG TAACCACTGT TTGGTTCTGG TCCGTGAATC CTATTCGAGC ACAGCGCAGT CATTCTCGCT TGACCTCGGA CCTCGGCGGC ATCTCTGAAT CATCGATGAA ATCGAATCTT GTCATTTCGA TCCTGAAAGC TCTGTAGTGG TTAGGTAGGA DNA linear GCTGCGATAG GTATAACTGT GAACGCAGCG TGAACGCACA CCCTTACGCC AATTGGCGGA CTTTGGCGGC ATACCCGCTG CGGCCCGCCG AATACGTTAA AAATGCGATA TTGCGCCCAT CTGTTGCGTA GCTAGAGCCC TAGCCAGAAA AACTTAAGCA Hình Trình tự chủng TQF25 LOCUS 61 121 181 241 301 361 421 481 GTGAACATAC GCCAGAGGAC CAAAACTTTC ATAAGTAATG CGCCAGTATT GTGTTGGGAC ATAGCGTACT ACTTCTGAAT AGCGGA TDF6 CACTTGTTGC CCCTAAACTC AACAACGGAT TGAATTGCAG CTGGCGGGCA TCGCGTTAAT AGTAAAACCC GTTGACCTCG 553 bp CTCGGCGGAT TGTTTCTATA CTCTTGGTTC AATTCAGTGA TGCCTGTTCG TCGCGTTCCC TCGTTACTGG GATCAGGTAG CAGCCCGCTC TGTAACTTCT TGGCATCGAT ATCATCGAAT AGCGTCATTT CAAATTGATT TAATCGTCGC GAATACCCGC DNA linear CCGGTAAAAC GAGTAAAACC GAAGAACGCA CTTTGAACGC CAACCCTCAA GGCGGTCACG GGCCACGCCG TGAACTTAAG GGGACGGCCC ATAAATAAAT GCAAAATGCG ACATTGCGCC GCACAGCTTG TCGAGCTTCC TTAAACCCCA CATATCAATA Hình Trình tự chủng TDF6 LOCUS 61 121 181 241 301 361 361 421 541 GCTTGCTTCT CCAAACCCCT ACGGGACGGC CCATAAATAA CAGCAAAATG GCACATTGCG AAGCACAGCT CGTCGAGCTT CGTTAAACCC AGCATATCAA TDF7 CTTGAGAGCG GTGGAACATA CCGCCAGAGG ATCAAAACTT CGATAAGTAA CCCGCCAGTA TGGTGTTGGG CCATAGCGTA CAACTTCTGA TAAGCGGAGG 502 bp GCGGACGGGT CCACTTGGTT ACCCCTAAAC TCAACAACGG TGTGAATTGC TTCTGGCGGG ACTCGCGTTA GTAGTAAAAC ATGTTGACCT AA GAGTAATGCC GCCTCGGCGG TCTGTTTCTA ATCTCTTGGT AGAATTCAGT CATGCCTGTT ATTCGCGTTC CCTCGTTACT CGGATCAGGT DNA linear TAGGAATCTG ATCAGCCCGC TATGTAACTT TCTGGCATCG GAATCATCGA CGAGCGTCAT CTCAAATTGA GGTAATCGTC AGGAATACCC Hình Trình tự chủng TDF7 Vietnam Academy of Science and Technology CCTGGTAGTG TCCCGGTAAA CTGAGTAAAA ATGAAGAACG ATCTTTGAAC TTCAACCCTC TTGGCGGTCA GCGGCCACGC GCTGAACTTA