Luận văn thạc sỹ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bùi Văn Thiện NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ VÚ (MCF-7) CỦA CAO CHIẾT CÂY NGẢI TRẮNG (Curcuma aromatica Salisb) LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2021 Luận văn thạc sỹ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bùi Văn Thiện NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ VÚ (MCF-7) CỦA CAO CHIẾT CÂY NGẢI TRẮNG (Curcuma aromatica Salisb) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Bùi Đình Thạch Thành phố Hồ Chí Minh – 2021 Luận văn thạc sỹ Sinh học i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu khả ức chế tế bào ung thư vú (MCF-7) cao chiết ngải trắng (Curcuma aromatica Salisb)” thực dƣới hƣớng dẫn TS Bùi Đình Thạch Các kết nghiên cứu, số liệu, thông tin luận văn đƣợc thu thập, xử lý xây dựng cách trung thực, khơng chép, đạo văn Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm thơng tin, số liệu, liệu nội dung luận văn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2021 Ngƣời cam đoan Bùi Văn Thiện Luận văn thạc sỹ Sinh học ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Đình Thạch, ngƣời tận tình giúp đỡ, động viên, hƣớng dẫn định hƣớng cho tơi q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn Thạc sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới, thầy cô giảng viên Học Viện Khoa học Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, thuận lợi nhƣ dẫn tận tình giúp tơi hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn đến tất bạn bè anh chị phụ trách thuộc Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam bên cạnh động viên tơi vƣợt qua khó khăn học tập làm việc Và cuối cùng, xin dành tình cảm trân trọng thân thƣơng đến bố, mẹ, anh, chị, vợ thành viên gia đình ln bên cạnh động viên giúp giúp tơi vƣợt qua khó khăn học tập, nghiên cứu làm việc Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2020 Học viên Bùi Văn Thiện Luận văn thạc sỹ Sinh học iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT FACS : Fluorescence-activated cell sorting DMSO : Dimethyl sulfoxit DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy EtOH : Ethanol FACS : Fluorescence-activated cell sorting FBS : Fetal Bovine Serum HPLC : High Performance Liquid Chromatography Max : Giá trị cao Min : Giá trị thấp OD : Optical Density Pen/Strep : Penicillin/Streptomycin PI : Propidium iodide SE : Sai số chuẩn TB : Trung bình TLK : Trọng lƣợng khơ Luận văn thạc sỹ Sinh học iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Thành phần hố học (>5%) Curcuma aromatica (Anoop, 2015) 10 Bảng 2.2: Mồi xuôi mồi ngược sử dụng phản ứng Real time PCR 30 Bảng 3.1: Hàm lượng nước củ Ngải trắng 32 Bảng 3.2: Hàm lượng tro khoáng củ Ngải trắng 33 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ ly trích lên hàm lượng hoạt chất ly trích từ củ Ngải trắng 34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng thời gian ly trích lên hàm lượng curcumol ly trích từ củ Ngải trắng 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng dung mơi ly trích lên hàm lượng curcumol phenolic ly trích từ củ Ngải trắng 37 Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi cao chiết hàm lượng phenolic tổng số cao chiết củ Ngải trắng 39 Bảng 3.7: Hàm lượng curcumol tổng số cao chiết củ Ngải trắng 40 Bảng 3.8: Hoạt tính nhặt gốc tự DPPH cao chiết từ củ Ngải trắng ascorbic acid 42 Luận văn thạc sỹ Sinh học v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Củ phần mặt đất Curcuma aromatica (Sikta cs., 2018) Hình 1.2: Cấu trúc nguồn tự nhiên curcumol (Wei, 2019) 12 Hình 3.1: Kết HPLC mẫu cao chiết củ Ngải trắng 40 Hình 3.2: Ảnh hưởng cao chiết Ngải trắng curcumol lên tăng sinh tế bào MCF-7 phương pháp WST-1 sau 24h, 48h 72h 44 Hình 3.3: H nh ảnh tế -7 nhuộm Ho chst 33342 ưới tác động củ c o chiết gải trắng 46 Hình 3.4: Ảnh hưởng cao chiết Ngải trắng lên apoptosis tế bào MCF-7 cytometry flow 47 Hình 3.5: Tỉ lệ tế bào MCF-7 vào tr nh poptosis s u xử lý với cao chiết Ngải trắng 24h, 48h 72h a, b, c: khác biệt có ý nghĩ thống kê, p < 0,05.) 48 Hình 3.6: Ảnh hưởng cao chiết Ngải trắng lên biểu Bcl-2 tế bào MCF-7 a, b, c: Khác biệt có ý nghĩ thống kê với p < 0,05 49 Hình 3.7: Ảnh hưởng cao chiết Ngải trắng lên biểu Bax tế bào MCF-7 Khơng có khác biệt có ý nghĩ thống kê với p > 0,05 50 Luận văn thạc sỹ Sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỤC LỤC TÓM TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGẢI TRẮNG 1.1.1 Phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Thành phần hoá học 1.1.4 Tác dụng dƣợc lí Ngải trắng 13 1.2 SƠ LƢỢC VỀ UNG THƢ VÚ 16 1.2.1 Dịch tễ học 16 1.2.2 Yếu tố nguy gây ung thƣ vú 17 1.2.3 Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ vú 18 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Hoàn thiện quy trình ly trích thu nhận cao chiết từ củ Ngải trắng 20 Luận văn thạc sỹ Sinh học 2.3.2 Xác định hàm lƣợng hoạt chất cao chiết: phenolic, curcumol 24 2.3.3 Xác định hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết 25 2.3.4 Xác định hoạt tính apoptosis cao chiết mơ hình tế bào ung thƣ vú 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 HỒN THIỆN QUY TRÌNH LY TRÍCH THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ CỦ CÂY NGẢI TRẮNG 32 3.1.1 Xác định hàm lƣợng nƣớc 32 3.1.2 Xác định hàm lƣợng khoáng 33 3.1.3 Khảo sát nhiệt độ ly trích 34 3.1.4 Khảo sát thời gian ly trích 35 3.1.5 Khảo sát dung môi ly trích 37 3.2 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG CAO CHIẾT 38 3.2.1 Xác định hàm lƣợng Phenolic cao chiết 38 3.2.2 Xác định hàm lƣợng Curcumol cao chiết 40 3.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HĨA CỦA CAO CHIẾT NGẢI TRẮNG 41 3.4 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH APOPTOSIS CỦA CAO CHIẾT NGẢI TRẮNG TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ 44 3.4.1 Kiểm tra độc tính tế bào 44 3.4.2 Đánh giá phân mảnh tế bào 45 3.4.3 Xác định khả ức chế tế bào ung thu vú (MCF-7) thông qua biểu gen bax bcl-2 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 KẾT LUẬN 52 Luận văn thạc sỹ Sinh học 4.2 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 69 Luận văn thạc sỹ Sinh học 63 Selected Extracts from Ribes nigrum, J Agric Food Chem, 59, 9, 4763– 4770 [79] Atul Bhargava, Sudhir Shukla, Deepak Ohri, Chenopodium quinoa—An Indian perspective, Industrial Crops and Products Volume 23, Issue 1, January 2006, Pages 73-87 [80] Rigane G, Younes S Ben, Ghazghazi H, Salem R Ben, Investigation into the biological activities and chemical composition of Calendula officinalis L growing in Tunisia, International Food Research Journal; Selangor Vol 20, Iss : 3001-3007 [81] Wahyu Widowati, Teresa Liliana Wargasetia, Ervi Afifah, Tjandrawati Mozef, Hanna Sari Widya Kusuma, Hayatun Nufus, Seila Arumwardana, Annisa Amalia, Rizal Rizal, 2018, Antioxidant and antidiabetic potential of Curcuma longa and its compounds, Asian J Agri & Biol 6(2): 149-161 [82] Pitchersky E, Gang DR, 2000, Genetics and biochemistry of secondary metabolites in Plants: An evolutionary perspective, Trends Plant Sci 5: 459–445 [83] Srvidya AR, Yadev AK, Dhanbal SP, 2009, Antioxidant and antimicrobial activity of rhizome of Curcuma aromatica and Curcuma zeodaria, leaves of Abutilon indicum, Arch Pharm Sci & Res 1(1): 14-19 [84] Shyamlal BRK, Yadav L, Tiwari MK, Mathur M, Prikhodko JI, Mashevskaya IV, Yadav DK, Chaudhary S, 2020, Shyamlal BRK , Synthesis, Bioevaluation, Structure-Activity Relationship and Docking Studies of Natural Product Inspired (Z)-3-benzylideneisobenzofuran1(3H)-ones as Highly Potent agents Scientific Reports: 1-10 antioxidants and Antiplatelet Luận văn thạc sỹ Sinh học 64 [85] Maizura M., Aminah A., Wan Aida W.M, 2011, Total phenolic content and antioxidant activity of kesum (Polygonum minus), ginger (Zingiber officinale) and turmeric (Curcuma longa) extract, International Food Research Journal 18: 526-531 [86] R.K.Momin, Kadam V.B, Biochemical Analysis of Leaves of some Medicinal Plants of Genus Sesbania, Journal of Ecobiotechnology, 3(2): 14-16 [87] Viviane P.Paulucci Renê O.CoutoCristiane C.C.TeixeiraLuis Alexandre P.Freitas, 2013, Optimization of the extraction of curcumin from Curcuma longa rhizomes, Revista Brasileira de Farmacognosia 23(1): 94-100 [88] Deng C, Ji J, Li N, Yu Y, Duan G, Zhang X, 2006, Fast determination of curcumol, curdione and germacrone in three species of Curcuma rhizomes by microwave-assisted extraction followed by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry, J Chromatogr A 1117(2): 115-120 [89] Anchalee, J (2012) Effects of NAA, BA and sucrose on short induction and rapid microoagation by on short induction and rapid microoagation by Eng., Mgt Appl Sci Tech 3(2): 101-109 [90] Cao Ling, Wan Rong, Wang Yu (2007) Determination of curcumol and germacrone in Zedoary Turmeric Oil Injections by RP-HPLC Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 06 [91] Choochote W., Chaiyasit D., Kanjanapothi D., Rattanachanpichai E., Jitpakdi A., Tuetun B and Pitasawat B (2005) Chemical composition and antimosquito potential of rhizome extract and volatile oil derived from Curcuma aromatica against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) J Vector Ecol 30: 302-309 Luận văn thạc sỹ Sinh học 65 [92] Giang P.M and Son P.T (2000) Isolation of sesquiterpenoids from the rhizomes of Vietnamese Curcuma aromatica Salisb J Chem 38: 96-99 [93] Huan E.H., Shuangcheng A.M., Songjiu T., Qiming Z (2010) HPLC determination of six components in zedoary turmeric oil and its related injections China journal of chinese meteria medica 35 (5): 593-597 [94] Lanyue Zhang, Zhiwen Yang, Dingkang Chen, Zebin Huang, Yongliang Li, Xinzi Lan, Ping Su, Wanyi Pan, Wei Zhou, Xi Zheng, Zhiyun Du (2017) Variation on Composition and Bioactivity of Essential Oils of Four Common Curcuma Herbs Chemistry and biodiversity 14(11): 1-21 [95] Li X, Liu H, Wang J, Qin J, Bai Z, Chi B (2018) Curcumol induces cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting IGF-1R/PI3K/Akt signaling pathway in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells Phytotherapy research : PTR 32: 2214-2225 [96] Li Y., John M.W., Qiaohong L., Xiaokun L., Robert C.G and Martin (2009) Chemoprotective effects of Curcuma aromatica on carcinogenesis Ann Surg Oncol 16: 515-523 [97] Loc N.H., Duc D.T., Kwon T.H., Yang M.S (2005), “Micropropagation of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)-a valuable medicinal plant”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81:119-122 [98] Madhu S.K., Shaukath A.K and Vijayan V.A (2010) Efficacy of bioactive compounds from Curcuma aromatica against mosquito larvae Acta Tropica 113: 7-11 [99] Neerja P., Himanshu M and Jain D.C (2013) Phytochemical investigation of ethyl acetate extract from Curcuma aromatica Salisb rhizomes Arab J Chem 6: 279–283 [100] Patle TK, Shrivas K, Kurrey R, Upadhyay S, Jangde R, Chauhan R 2020 Phytochemical screening and determination of phenolics and Luận văn thạc sỹ Sinh học 66 flavonoids in Dillenia pentagyna using UV–vis and FTIR spectroscopy Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 242(5): 1-10 [101] Peng Z, Zhou W, Zhang C, Liu H, Zhang Y (2018) Curcumol Controls Choriocarcinoma Stem-Like Cells Self-Renewal via Repression of DNA Methyltransferase (DNMT)- and Histone Deacetylase (HDAC)Mediated Epigenetic Regulation Medical science monitor : international medical journal of experimental and clinical research 24: 461-472 [102] Rajamma AG, Bai V, Nambisan B (2012) Antioxidant and antibacterial activities of oleoresins isolated from nine Curcuma species Phytopharmacology 2(2): 312-317 [103] Rao J.T (1976) Antifungal activity of the essential oil of C.aromatica Indian J Pharmacy 38(2): 53- 54 [104] Shi J.H., Li C.Z and Liu D.L (1981) Experimental research on the pharmacology of Curcuma aromatica volatile oil Zhongyao Tongbao 6: 36–38 [105] Singh D., Shrivastav B., Garg S.P (2000) Isolation and antimicrobial studies of curcumin from C.aromatica Current agriculture; 24(12): 101- 103 [106] Wang X., Jiang Y and Hu D (2016) Optimization and in vitro antiproliferation of Curcuma wenyujin’s active extracts by ultrasonication and response surface methodology Chemistry Central Journal 10:32 [107] Wu D.L., Larsen K (2000) Zingiberiaceae 322–377 [108] Yang L, Wei DD, Chen Z, Wanga JS, Kong LY (2011) Reversal of multidrug resistance in human breast cancer cells by Curcuma wenyujin and Chrysanthemum indicum Phytomedicine 18: 710–718 Luận văn thạc sỹ Sinh học 67 [109] Yuan Zhang, Xiao-Jun Cai, Yu-Ping Xu, Yu Pan, Xiang Zheng (2013) Simultaneous Determination of Five Compounds by HPLC and Its Application to the Suitable Harvest Time for Medicinal Plant Curcuma wenyujin Asian Journal of Chemistry 25(6): 3335-3337 [110] Zhang Y.P., Dian L.H and Zeng Z 2004, Determination of chemical constituents of Curcuma aromatica and C.longa J Jishou Univ 25: 84-85 Luận văn thạc sỹ Sinh học 68 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng kết phân tích hoạt lƣc cao chiết ngải trắng tế bào MCF-7 24h 24h Cao chiết Nồng độ Curcumol Nồng độ DMSO Nồng độ A 100 µg/ml 0,557 0,533 0,531 100 µg/ml 0,583 0,565 0,544 2,00% 0,614 0,607 0,580 B 75 µg/ml 0,528 0,549 0,552 75 µg/ml 0,583 0,522 0,605 1,00% 0,606 0,581 0,608 C 50 µg/ml 0,601 0,593 0,619 50 µg/ml 0,626 0,596 0,561 0,50% 0,624 0,638 0,661 D 25 µg/ml 0,623 0,637 0,615 25 µg/ml 0,616 0,517 0,603 blank 0,036 0,042 0,039 E 12.5 µg/ml 0,644 0,607 0,616 12.5 µg/ml 0,636 0,640 0,613 F 6.25 µg/ml 0,631 0,620 0,616 6.25 µg/ml 0,634 0,649 0,595 G 3.125 µg/ml 0,601 0,629 0,651 3.125 µg/ml 0,615 0,591 0,596 H µg/ml 0,608 0,595 0,601 µg/ml 0,603 0,611 0,606 Luận văn thạc sỹ Sinh học 69 48h Cao chiết Nồng độ Curcumol Nồng độ DMSO Nồng độ A 100 µg/ml 0,435 0,486 0,542 100 µg/ml 0,606 0,632 0,581 2,00% 0,689 0,737 0,703 B 75 µg/ml 0,503 0,578 0,512 75 µg/ml 0,587 0,672 0,634 1,00% 0,778 0,802 0,815 C 50 µg/ml 0,624 0,692 0,654 50 µg/ml 0,684 0,648 0,691 0,50% 0,703 0,726 0,731 D 25 µg/ml 0,701 0,637 0,630 25 µg/ml 0,738 0,702 0,684 blank 0,042 0,044 0,045 E 12.5 µg/ml 0,767 0,749 0,705 12.5 µg/ml 0,701 0,775 0,762 F 6.25 µg/ml 0,761 0,747 0,709 6.25 µg/ml 0,723 0,755 0,726 G 3.125 µg/ml 0,743 0,725 0,744 3.125 µg/ml 0,680 0,752 0,735 H µg/ml 0,789 0,734 0,735 µg/ml 0,749 0,727 0,784 Luận văn thạc sỹ Sinh học 70 72h Cao chiết Nồng độ Curcumol DMSO Nồng độ Nồng độ A 100 µg/ml 0,409 0,388 0,384 100 µg/ml 0,522 0,493 0,455 2,00% 0,635 0,711 0,735 B 75 µg/ml 0,428 0,479 0,383 75 µg/ml 0,526 0,479 0,489 1,00% 0,746 0,746 0,760 C 50 µg/ml 0,582 0,667 0,572 50 µg/ml 0,638 0,679 0,611 0,50% 0,877 0,815 0,851 D 25 µg/ml 0,576 0,572 0,610 25 µg/ml 0,668 0,680 0,745 blank 0,046 0,047 0,050 E 12.5 µg/ml 0,690 0,782 0,784 12.5 µg/ml 0,698 0,729 0,653 F 6.25 µg/ml 0,690 0,783 0,723 6.25 µg/ml 0,712 0,745 0,779 G 3.125 µg/ml 0,693 0,686 0,738 3.125 µg/ml 0,779 0,826 0,782 H µg/ml 0,803 0,793 0,805 µg/ml 0,779 0,776 0,805 Luận văn thạc sỹ Sinh học 71 Phụ lục 2: Đánh giá phân mảnh tế bào  Tỉ lệ tế bào MCF-7 apoptotic sau 24h xử lý cao chiết Ngải trắng One Way Analysis of Variance Wednesday, August 28, 2019, 2:07:33 PM Data source: Data in Notebook1 Normality Test: Passed (P = 0.928) Equal Variance Test: Passed (P = 0.642) Group Name N Missing Col 3.683 0.136 0.0784 Col 4.017 0.693 0.400 Col 3 4.720 0.636 0.367 Col 8.973 0.677 0.391 Source of Variation Mean DF Std Dev SS MS Between Groups 54.243 18.081 Residual 2.723 0.340 Total SEM F 53.121 P