BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VŨ THỊ TRINH Vũ Thị Trinh SINH HỌC THỰC NGHIỆM PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM 2023 Hà Nội - 2023 Vietnam Academy of Science and Technology BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Vũ Thị Trinh PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Lê Thị Thu Hiền Hà Nội - 2023 Vietnam Academy of Science and Technology LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai hoàn chịu trách nhiệm trước pháp luật Tác giả luận văn Vũ Thị Trinh Vietnam Academy of Science and Technology LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến tồn Q Thầy Cô Học viện Khoa học Công nghệ truyền tải kiến thức quý báu, kinh nghiệm thực tế cho em Em xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Đào tạo, phòng chức Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập Với tất trân trọng quý mến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Thu Hiền, ngƣời tận tình giúp đỡ, định hƣớng cách tƣ làm việc khoa học Cảm ơn cô tận tình bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp Đó trợ giúp quý báu, không q trình thực luận văn mà cịn hành trang tiếp bƣớc cho em trình học tập nghiên cứu sau Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thành viên Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đặc biệt cảm ơn TS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS Hà Hồng Hạnh, TS Vũ Tuấn Nam, ThS Lƣu Hàn Ly, ThS Nguyễn Nhật Linh, ThS Đào Quang Hà, CN Nguyễn Vân Giang CN Nguyễn Thị Bích Ngọc, hỗ trợ em nhiều trình nghiên cứu học hỏi, để em hồn thiện luận văn Nghiên cứu đƣợc thực với hỗ trợ từ đề tài “Giải trình tự phân tích hệ phiên mã (transcriptome) sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Cuối cùng, em vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên ln bên em q trình hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Vietnam Academy of Science and Technology MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHI NHÂN SÂM VÀ SÂM NGỌC LINH 1.1.1 Chi Nhân sâm 1.1.2 Sâm Ngọc Linh 1.2 NGHIÊN CỨU GIẢI TRÌNH TỰ HỆ GEN Ở CÁC LỒI THUỘC CHI PANAX 1.3 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN CHỨC NĂNG Ở CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX 11 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 13 2.1.1 Các mẫu sâm nghiên cứu 13 2.1.2 Các cặp mồi sử dụng 13 2.1.3 Hóa chất, thiết bị 15 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Thu mẫu 15 2.2.2 Tách chiết kiểm tra chất lƣợng RNA tổng số 16 2.2.3 Tổng hợp cDNA 17 2.2.4 Xây dựng liệu gen liên quan đến đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside 17 2.2.5 Thiết kế cặp mồi 18 2.2.6 Nhân gen quan tâm sử dụng phƣơng pháp reverse transcription PCR 18 2.2.7 Xác định trình tự gen quan tâm sử dụng phƣơng pháp Sanger 18 2.2.8 Nghiên cứu biểu số gen chức realtime PCR 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH, KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG, ĐỊNH LƢỢNG RNA TỔNG SỐ TỪ MÔ LÁ, THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH 21 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE GIẢ ĐỊNH Ở SÂM NGỌC LINH 22 3.2.1 Thống kê sơ số lƣợng unigene gắn với gen 22 3.2.2 Thống kê liệu unigene cụ thể 25 Vietnam Academy of Science and Technology 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở MẪU LÁ SÂM NGỌC LINH VÀ NĂM TUỔI 32 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở MẪU THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH VÀ NĂM TUỔI 36 3.5 KẾT QUẢ SO SÁNH MỨC BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP GINSENOSIDE GIỮA MÔ LÁ VÀ THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH Ở HAI ĐỘ TUỔI 38 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 48 Phụ lục 3.1 Ma trận so sánh cDNA số gen liên quan đến đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside phân lập từ sâm Ngọc Linh với trình tự tham chiếu trình tự trích xuất từ liệu transcriptome 49 Vietnam Academy of Science and Technology i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tên đầy đủ (tiếng Việt) Bp Base pair Cặp base cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic dNTPs Đtg Deoxyribonucleotide triphosphates et al Deoxyribonucleotide triphosphates Đồng tác giả ESTs Expressed sequence tags Các trình tự biểu IUCN International Union for Liên minh Quốc tế Bảo tồn thiên Conservation of Nature and nhiên Tài nguyên thiên nhiên Natural Resources Kb Kilo base Kilo base (1.000 bp) LSC Large single-copy region Vùng đơn lớn NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Tin sinh học Quốc gia ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR qPCR RNA Polymerase chain reaction Quantitative polymerase chain reaction Ribonucleic Acid Phản ứng chuỗi polymerase Phản ứng chuỗi polymerase định lƣợng Acid ribonucleic SSR UTR Simple sequence repeat Untranslated region Trình tự lặp lại đơn giản Vùng không dịch mã Vietnam Academy of Science and Technology ii DANH MỤC BẢNG Bảng Các cặp mồi phục vụ nhân gen quan tâm sử dụng RT-PCR 13 Bảng 2 Các cặp mồi phục vụ nghiên cứu biểu gen sử dụng realtime PCR .14 Bảng Nồng độ độ (A260/A280) số mẫu RNA sâm Ngọc Linh sau tách chiết tinh .22 Bảng Thống kê số lƣợng mức độ biểu tƣơng đối unigene tham gia vào đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside từ kết giải trình tự hệ gen phiên mã sâm Ngọc Linh 23 Bảng 3.3 Dữ liệu unigene số gen liên quan đến đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside 25 Bảng 3.4 So sánh mức độ biểu số gen liên quan đến đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh năm tuổi năm tuổi .34 Vietnam Academy of Science and Technology iii DANH MỤC HÌNH Hình 1 Các lồi tự nhiên thuộc chi Panax Việt Nam .5 Hình Sơ đồ giản lƣợc trình sinh tổng hợp ginsenoside thực vật .8 Hình Giải trình tự DNA phƣơng pháp Sanger .19 Hình Kiểm tra kết tách chiết tinh RNA tổng số gel agarose từ mẫu (A) thân rễ sâm Ngọc Linh (B) 21 Hình Tổng quan đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside giả định loài sâm Ngọc Linh 24 Hình 3 Kết khuếch đại số gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside sâm Ngọc Linh 29 Hình Tối ƣu hóa mồi khuếch đại gen EF, AACT, IDI, SS, SE 34 Hình Biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô sâm Ngọc Linh 36 Hình Biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh 38 Hình So sánh mức biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh năm tuổi 39 Vietnam Academy of Science and Technology MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh loài dƣợc liệu quý thuộc chi Nhân sâm (Panax L.) có hàm lƣợng saponin khung dammaran cao (khoảng 12-15%) hàm lƣợng triterpene nhiều so với loài khác thuộc chi Panax giới Sâm Ngọc Linh có đến 52 loại saponin, 18 amino acid, 20 chất khoáng vi lƣợng, 0,1% tinh dầu Sâm Ngọc Linh có nhiều cơng dụng đặc biệt nhƣ chống stress, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxy hóa, kích thích hệ miễn dịch, tăng khả hồi phục máu, tăng khả vận động, chống suy nhƣợc thể [1-2] Từ năm 1985 đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố hóa học, hoạt tính sinh học cấu trúc hóa học hợp chất tiêu biểu phân lập từ sâm Ngọc Linh [3-7] Những kết nghiên cứu kh ng định giá trị quý sâm Ngọc Linh so với loại nhân sâm khác thị trƣờng Từ năm 1990, sâm Ngọc Linh tự nhiên hầu nhƣ bị khai thác cạn kiệt có nguy tuyệt chủng, trở thành lồi thực vật có tên sách đỏ Việt Nam [5] Theo tiêu chuẩn phân hạng Danh lục Đỏ IUCN (1994 2001), sâm Ngọc Linh tình trạng “Cực kỳ nguy cấp” Trƣớc tình hình đó, Việt Nam có chủ trƣơng, sách đắn nhằm khôi phục, bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh Nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm điều tra, phân loại, xác định vùng phân bố, nghiên cứu thành phần hóa học dƣợc tính, đánh giá đa dạng di truyền, tìm kiếm mã vạch DNA, xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại, bảo tồn, nhân giống, sản xuất giá thể, kỹ thuật canh tác, gieo trồng, bảo vệ thực vật, chế biến, bảo quản sâm Ngọc Linh đƣợc thực So với loài khác chi Nhân sâm, nghiên cứu mức độ phân tử in silico liên quan đến hệ gen phiên mã nhƣ gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside cịn Trong nghiên cứu liệu hệ gen phiên mã sâm Ngọc Linh đƣợc phân tích sở thông tin thu đƣợc, phƣơng pháp real time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ biểu gen quan tâm có liên quan đến q trình sinh tổng hợp ginsenoside thân rễ sâm Ngọc Linh Kết góp phần cung cấp sở khoa học đánh giá vai trò yếu tố di truyền đến sinh tổng hợp ginsenoside sâm Ngọc Linh Nghiên cứu “Phân tích biểu số gen liên quan đến đƣờng sinh Vietnam Academy of Science and Technology 39 biểu ngƣợc lại, cao so với thân rễ Các gen đƣợc phát nguồn tài nguyên quý giá để nghiên cứu chế phân tử q trình sinh tổng hợp ginsenoside Nhƣ vậy, thấy mức độ biểu gen mô mơ thân rễ có điểm khác biệt độ tuổi (1 năm tuổi), tƣơng ứng với thay đổi thành phần ginsenoside loại mô độ tuổi A B Hình So sánh mức biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh năm tuổi A: So sánh mức biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh năm tuổi; B: So sánh mức biểu gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside mô thân rễ sâm Ngọc Linh năm tuổi Dấu khác biệt có ý nghĩa thống kê (p