BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ ANH TÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HÔ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN HOÀI NAM Hà Nội – 2015 Luận văn thạc sỹ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HÔ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Học viên: Vũ Anh Tú Cao học: Khóa 17 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoài Nam Hà Nội – 2015 Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cảm ơn Luận văn hồn thành Viện Hố sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lịng bảo tạo điều kiện giúp đỡ thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn GS VS Châu Văn Minh, TS Nguyễn Văn Thanh, TS Nguyễn Xuân Cường tập thể cán phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo anh chị Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học thử nghiệm dược lý Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Luận văn hỗ trợ kinh phí thực khuôn khổ nội dung Nhiệm vụ nhánh Hợp tác quốc tế với L.B.Nga cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nhiệm vụ Trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, VAST.TĐ.ĐAB.02/13-15 TS Nguyễn Hoài Nam làm chủ nhiệm Tác giả luận văn Vũ Anh Tú i Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi thực hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Nam Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Vũ Anh Tú ii Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Danh mục chữ viết tắt CC Sắc ký cột (Collumn chromatography) YMC Sắc ký cột pha ngược TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatomatography) MPLC Sắc ký lỏng trung áp NMR Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) C HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single-Quantum Coherence) Mp Điểm nóng chảy (Melting point) MTT [3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] LU-1 Dịng tế bào ung thư phổi người (Lung carcinoma cell line) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú người (Human breast cancer cell line) KB Dịng tế bào ung thư biểu mơ HepG2 Dòng tế bào ung thư gan người TBUT Tế bào ung thư iii Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hơ mềm I.2 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học số lồi san hơ mềm điển hình thuộc giống Sinularia giới I.3 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống Sinularia nước 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 II.1 Đối tượng nghiên cứu 13 II.2 Phương pháp nghiên cứu 14 II.2.1 Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển 14 II.2.2 Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu tạo dịch chiết 14 II.2.3 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hợp chất 16 II.2.4 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư 17 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19 III.1 Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu 19 III.2 Phân lập hợp chất, số vật lý, liệu phổ hợp chất 20 III.3 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 25 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 28 IV.1 Kết xác định cấu trúc hợp chất 28 IV.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 52 KẾT LUẬN 53 Tài liệu tham khảo 55 Danh mục cơng trình cơng bố 58 PHỤ LỤC iv Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỞ ĐẦU Cùng với tiến hóa nhanh văn minh nhân loại phát triển vượt bậc khoa học kỹ thuật bệnh nguy hiểm gia tăng nhiều, đặc biệt thấy gia tăng ngày lớn bệnh ung thư quái ác, thuộc tứ chứng nan y y học Nó gây nỗi ám ảnh đáng sợ cho loài người Và biệt dược phục vụ công tác chữa bệnh, thực phẩm chức hỗ trợ phục hồi sức khỏe giúp người bệnh chống lại bệnh tật tốt nhà khoa học trọng nghiên cứu Các sinh vật biển có nhiều người biết đến Hải sâm, Sao biển, Cá ngựa, cầu gai, san hô, bọt biển… hay gần gũi thực phẩm giàu dinh dưỡng bữa ăn lồi ốc, sị, cá, cua, sứa biển … nghiên cứu nhiều theo hướng thực phẩm thực phẩm chức Nghiên cứu nguồn hợp chất thiên nhiên biển năm 50 kỷ trước ngày nhận quan tâm nhà khoa học giới Những nghiên cứu nguồn dược liệu biển thời gian gần tăng chất lượng số lượng đạt thành đáng ý Đã có nhiều hợp chất có nguồn gốc biển trở thành loại thuốc quan trọng lĩnh vực sống loài người Các sinh vật biển trở thành tâm điểm cho nhiều cơng trình nghiên cứu có ý nghĩa to lớn cho sức khỏe đời sống Các nguồn dược liệu từ sinh vật biển bổ sung, hỗ trợ cịn điều trị bệnh nguy hiểm ngày gia tăng xã hội phát triển Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi san hơ góp phần chuyển sinh vật khơng có giá trị mặt hải sản trở thành sinh vật biển có giá trị nghiên cứu y dược Chính vậy, có nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm hợp chất từ san hơ mềm nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất phát Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hô mềm San hô loài sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa, lớp Anthozoa chia thành hai phân lớp tùy theo số xúc tu, đường đối xứng loạt phận tương ứng với kiểu xương bao gồm phân lớp san hơ có tám xúc tu gọi san hô tám ngăn Octocorallia, phân lớp san hơ có số xúc tu lớn tám bội số sáu gọi san hô sáu ngăn Hexacorallia Các san hô mềm, san hô sừng bút chì biển thuộc phân lớp san hơ Octocorallia, san hô cứng nằm phân lớp Hexacorallia Theo thống kê giới, phân lớp Octocorallia có khoảng 2000 lồi chia làm 310 giống 45 họ San hơ sinh vật đơn giản, chúng tồn khắp vùng biển, nông sâu cá thể hình trụ nhỏ có hàng xúc tu đỉnh, sử dụng để bắt mồi môi trường nước Mặc dù trông giống cây, san hô thực động vật cấu tạo tương tự sứa hải quì, chúng thuộc vào nhóm động vật biển có trâm gây ngứa (thích ty bào) Có đến hàng trăm kiểu san hô khác tất cá thể nhỏ bé, gọi polyp tạo nên Các cá thể tiết canxi cacbonat để tạo xương cứng, xây nên rạn san hô vùng biển nhiệt đới Trên giới, rạn san hô ngầm ước tính bao phủ 284.300 km2, chủ yếu vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%) Các rạn san hô mềm phân bố rộng rãi đại dương giới có vai trị quan trọng hệ sinh thái rạn san hô, chúng tạo nguồn vật chất hữu cơ, habitat, tham gia tạo rạn Cuộc sống cộng sinh san hô mềm với loài tảo biển tạo nên đặc điểm sinh học vô thú vị san hô mềm Rất nhiều hợp chất thứ cấp ditecpen dạng cembranoid, steroids … từ san hơ mềm sinh từ mối tương tác với môi trường sinh thái [1] Tuy đầu san hô trông thể sống, thực đầu nhiều cá thể giống hoàn toàn di truyền, polip Các polip sinh vật đa bào với nguồn thức ăn nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù du tới loài cá nhỏ Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Polip thường có đường kính vài milimet, cấu tạo lớp biểu mơ bên ngồi lớp mơ bên giống sứa gọi ngoại chất Polip có hình dạng đối xứng trục với xúc tu mọc quanh miệng - cửa tới xoang vị (hay dày), thức ăn bã thải qua miệng Dạ dày đóng kín đáy polip, nơi biểu mơ tạo xương gọi đĩa Bộ xương hình thành vành hình khuyên chứa canxi ngày dày thêm Các cấu trúc phát triển theo chiều thẳng đứng thành dạng ống từ đáy polip, cho phép co vào xương cần trú ẩn Polip mọc cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc, chia thành vách ngăn để tạo đĩa cao Qua nhiều hệ, kiểu phát triển tạo nên cấu trúc san hô lớn chứa canxi, lâu dài tạo thành rạn san hơ Sự hình thành xương ngồi chứa canxi kết việc polip kết lắng aragonit khoáng từ ion canxi thu từ nước biển Tuy khác tùy theo lồi điều kiện mơi trường, tốc độ kết lắng đạt mức 10 g/m² polip/ngày Điều phụ thuộc mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp 90% so với trưa Các xúc tu polip bẫy mồi cách sử dụng tế bào châm gọi nematocyst Đây tế bào chuyên bắt làm tê liệt mồi sinh vật phù du, có tiếp xúc, phản ứng nhanh cách tiêm chất độc vào mồi Các chất độc thường yếu, san hơ lửa, đủ mạnh để gây tổn thương cho người Các loài sứa hải quỳ có nematocyst Chất độc mà nematocyst tiêm vào mồi có tác dụng làm tê liệt giết chết mồi, sau xúc tu kéo mồi vào dày polip dải biểu mô co giãn gọi hầu Các polip kết nối với qua hệ thống phức tạp gồm kênh hơ hấp tiêu hóa cho phép chúng chia sẻ đáng kể chất dinh dưỡng sinh vật cộng sinh Đối với loài san hơ mềm, kênh có đường kính khoảng 50-500μm Luận văn thạc sỹ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú cho phép vận chuyển chất trình trao đổi chất thành phần tế bào Ngoài việc dùng sinh vật phù du làm thức ăn, nhiều lồi san hơ, nhóm Thích ti (Cnidaria) khác hải quỳ (ví dụ giống Aiptasia), hình thành quan hệ cộng sinh với nhóm tảo vàng đơn bào thuộc chi Symbiodinium Thơng thường, polip sống loại tảo cụ thể Thông qua quang hợp, tảo cung cấp lượng cho san hơ giúp san hơ q trình canxi hóa Tảo hưởng lợi từ mơi trường an tồn, sử dụng điơxít cacbon chất chứa nitơ mà polip thải Hình I.1a Cận cảnh polip tế bào châm ( Nguồn internet) Sinh sản Hữu tính San hơ chủ yếu sinh sản hữu tính, với 25% san hô phụ thuộc tảo (san hô đá) tạo thành quần thể đơn tính phần cịn lại lưỡng tính Khoảng 75% san hơ phụ thuộc tảo "phát tán giống" cách phóng giao tử (trứng tinh trùng) vào nước để phát tán quần thể san hô xa Các giao tử kết hợp với thụ tinh để hình thành ấu trùng nhỏ gọi planula, thường có màu hồng hình ơvan; quần thể san hơ cỡ trung bình năm tạo vài nghìn ấu trùng để vượt qua xác suất nhỏ việc ấu trùng tạo quần thể Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ HSQC 20 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ HMBC Hợp chất 21 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ 1H-NMR 22 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ 13C-NMR 23 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ DEPT 24 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ HSQC 25 Luận văn thạc sỹ Sinh học Phổ HMBC 26 Luận văn thạc sỹ Sinh học STEROLS ISOLATED FROM THE SOFT CORAL SINULARIA DISSECTA Nguyen Phuong Thao1, Vu Anh Tu1, Nguyen Van Thanh1, Nguyen Hoai Nam1*, Nguyen Xuan Cuong1, Young Ho Kim2, Phan Van Kiem1, Chau Van Minh1 Institute of Marine Biochemistry, Vietnam Academy of Science and Technology College of Pharmacy, Chungnam National University, Korea Received 23 January 2015; Accepted for Publication 15 March 2015 Abstract Using various chromatographic methods, five sterols, gorgost-4-ene-3-one (1), ergost-4-ene-3-one (2), 24methyleneergost-4-ene-3-one (3), ergost-4-ene-3,6-dione (4), and 24-methylenecholest-4-ene-3,6-dione (5), were isolated from the methanol extract of the soft coral Sinularia dissecta Their structures were elucidated by 1D and 2DNMR experiments and comparison of their NMR data with reported values These compounds were isolated from S dissecta for the first time Keywords Sinularia dissecta, Alcyoniidae, soft coral, sterol INTRODUCTION EXPERIMENTAL 2.1 General experimental procedures The 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) spectra were recorded on a Bruker AM500 FT-NMR spectrometer, TMS was used as an internal standard The electrospray ionization mass spectra (ESI-MS) were obtained on an Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS system Column chromatography (CC) was performed on silica gel (Kieselgel 60, 70– 230 mesh and 230–400 mesh, Merck) and YMC RP18 resins (30–50 μm, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Thin layer chromatography (TLC) used pre-coated silica gel 60 F254 (1.05554.0001, Merck) and RP-18 F254S plates (1.15685.0001, Merck) Compounds were visualized by spraying with aqueous 10 % H2SO4 and heating for 3–5 minutes Soft corals have been found to be storehouses of sterols, particularly in terms of unique side-chain structures and unusual functionalization [1, 2] Marine sterols of Sinularia soft corals are often found in oxygenated forms, and such sterols sometimes shows a variety of biological and pharmacological activities [3] Many novel sterols have been reported from the soft coral S dissecta [4-7] Previously, we reported a new gorgosterol-type sterol from this soft coral and its anti-inflammatory activity [8] In this paper, we address the isolation and structure identification of five sterols including gorgost-4-ene-3-one (1), ergost-4-ene-3-one (2), 24-methyleneergost-4-ene3-one (3), ergost-4-ene-3,6-dione (4), and 24methylenecholest-4-ene-3,6-dione (5) from the same soft coral 2.2 Marine materials The sample of soft coral S dissecta was collected during April 2010 at Hai Van - Son Cha, Hue, Vietnam and identified by Prof Do Cong Thung (Institute of 27 Luận văn thạc sỹ Sinh học Marine Environment and Resources, VAST) A voucher specimen (SD042010_01) was deposited at the Institute of Marine Biochemistry and Institute of Marine Environment and Resources, VAST eluting with CH2Cl2MeOH (25:1), followed by Sephadex LH-20 with MeOH-acetone (70:30) to yield compound (10 mg) Gorgost-4-ene-3-one (1): White powder; 1HNMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 1; ESI-MS m/z 425 [M+H]+ (C30H48O, M = 424) 2.3 Isolation Fresh frozen samples of the soft coral S dissecta (1.5 kg) were well grinded and extracted three times with hot MeOH (at 50 °C for h each time) The obtained solutions were filtered, combined, and concentrated under reduced pressure to yield a dark brown viscous residue (9.15 g, A) This residue was suspended in water (0.5 L) and partitioned in turn with n-hexane (2×0.5 L) and CH2Cl2 (3×0.5 L) The combined dichloromethane soluble portions were evaporated under reduced pressure to afford CH2Cl2 extract (1.83 g, B) Extract B was crudely separated by silica gel CC using gradient concentrations of ethyl acetate in n-hexane from to 100 % to yield four fractions, B-1 to B-4 Fraction B1 (647 mg) was further separated on silica gel CC using nhexaneEtOAc (25:1) as eluents, to give three subfractions, B1.1 to B1.3 Subfraction B1.1 (253 mg) was then chromatographed over silica gel CC using eluent of n-hexaneacetone (14:1), and further purified by YMC RP-18 CC eluting with LH-20 CC (MeOH-acetone 1:1) Subfraction B1.3 MeOHacetoneH2O (4:2:0.2) to afford (110 mg) Compound (20 mg) was purified from subfraction B1.2 (158 mg) by silica gel CC eluting with nhexaneEtOAc (15:1) and followed by Saphadex (230 mg) afforded (52 mg), after subjecting it to silica gel CC eluting with dichloromethaneacetone (21.5:1), followed by YMC RP-18 CC with MeOHacetone (6.5:1) Ergost-4-ene-3-one (2): White powder; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 1; ESI-MS m/z 421 [M+Na]+ (C28H46O, M = 398) 24-methyleneergost-4-ene-3-one (3): White powder; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 397 [M+H]+ (C28H44O, M = 396) Ergost-4-ene-3,6-dione (4): White powder; 1HNMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 435 [M+Na]+ (C28H44O2, M = 412) 24-methylenecholest-4-ene-3,6-dione (5): White powder; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13CNMR (125 MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 433 [M+Na]+ (C28H42O2, M = 410) RESULTS AND DISCUSSION Compound was obtained as a white powder The 1H-NMR spectrum revealed signals of three tertiary methyl [H 0.65 (H-18), 1.14 (H-19), and 0.87 (H-29), each 3H, s] and three secondary methyl groups [H 0.82 (H-26), 0.92 (H-27), and 0.90 (H-28), each 3H, d, J = 7.0 Hz] A seventh methyl signal appeared as a broad singlet at H 0.96, which was overlapped with a methine multiplet of H-20, and four high-field protons at H 0.13 (1H, m, H-22), 0.20 (1H, m, H-24), 0.16 (1H, dd, J = 4.0, 6.0 Hz, H-30), and 0.46 (1H, dd, J = 4.0, 9.0 Hz, H-30), is characteristic of a gorgosterol-type side chain possessing a cyclopropane ring [14, 15] In addition, one olefinic proton was identified at H 5.76 (1H, br s, H-4) The 13C-NMR spectrum of showed 30 carbon signals, of which even methyl groups were at C 12.40 (C-18), 17.79 (C-19), 21.53 (C-21), 21.96 (C- Fraction B2 (80 mg) was separated by YMC RP-18 CC, using eluent of MeOHacetoneH2O (95:3:2) to yield three subfractions, B-2.1 to B-2.3 Subfraction B2.3 (28 mg) afforded compound (17 mg), after subjecting it to silica gel CC eluting with n-hexaneEtOAc (8.5:1) Fraction B4 (740 mg) was passed through Sephadex LH-20 with MeOHacetone (1:1) to yield five subfractions, B4.1 to B4.5 Subfraction B4.2 (46 mg) was further separated by silica gel CC 28 Luận văn thạc sỹ Sinh học 26), 22.59 (C-27), 15.89 (C-28), and 14.70 (C-29) A good agreement of the 13C-NMR data for the side chain of (table 1) with those of gorgost-5-ene3,9,11-triol [9] and combination with the HMBC correlations (figure 2) confirmed the gorgosteroltype side chain Moreover, one ketone group [C 200.00 (C-3)] and a tri-substituted double bond [C 124.16 (d, C-4)/172.06 (s, C-5)] were observed The carbon signals of the ketone group was strongly shifted upfield suggesting its conjugated location with the double bond The 13C-NMR data for the steroidal skeleton of were similar to those of 24ethylcholest-4-ene-3-one [16] Detailed analysis of other HMBC cross-peaks (figure 2) led to assignment of the structure of as gorgost-4-ene-3-one [17] This is the first report of the 13C-NMR data of Figure 1: Chemical structures of compounds 15 Table 1: 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of 13 and reported compounds 1b C a δC 36.10 δH (J = Hz) δC 0.98 m 3b d δC δC 2b c δH (J = Hz) δC δC δH (J= Hz) 35.7 36.22 1.66/1.97 m 36.23 1.66/1.97 m 34.0 33.48 2.22/2.34 m 33.45 2.22/2.34 m 1.67 dd (5.0, 14.0) 34.40 2.38/2.30 m 200.00 - 199.6 200.08 - 199.92 - 124.16 5.76 brs 123.7 124.28 5.68 brs 124.28 5.68 brs 172.06 - 171.9 172.15 - 171.97 - 32.45 1.81/0.98 m 32.9 32.58 1.79/0.97 m 32.56 1.79/2.31 m 33.26 2.35/2.22 m 31.1 31.09 0.89/1.33 m 31.47 0.89/1.33 36.07 1.47 m 35.6 36.14 1.47 m 36.12 1.47 m 54.25 0.89 m 53.8 54.35 0.87 m 54.39 0.85 m 10 38.99 - 38.6 39.11 - 39.10 - 11 21.48 1.49/1.37 m 21.0 21.55 1.48/1.38 m 21.55 1.45/1.36 m 12 40.11 1.15/2.02 m 39.6 40.14 1.52/2.02 m 40.15 1.97/1.09 m 13 43.24 - 42.4 42.90 - 42.94 - 29 Luận văn thạc sỹ Sinh học 14 58.28 1.21 m 56.0 56.39 0.95 m 56.39 0.95 m 15 24.84 1.06/1.58 m 24.2 24.71 1.55/1.04 m 24.70 1.54/1.69m 16 28.60 1.99/1.29 m 28.1 28.68 1.80/1.23 m 28.69 1.81/1.21 m 17 56.15 0.99 m 55.9 56.46 1.07 m 55.7 56.47 1.06 m 18 12.40 0.65 s 11.9 12.49 0.66 s 11.7 12.49 0.64 s 19 17.79 1.14 s 17.4 17.91 1.13 s 18.3 17.90 1.11 s 20 35.2 35.67 0.97 m 36.1 36.68 1.31 m 35.8 35.12 1.09 m 21 21.1 21.53 0.96 brs 18.8 19.36 0.87 d 7.0) 18.8 19.17 0.88 d 7.0) 22 31.9 32.46 0.13 m 33.7 34.18 1.34/0.89 m 34.7 34.49 2.38/2.24 m 23 25.8 26.23 - 30.6 31.09 0.89/1.33 m 30.9 31.47 2.03/1.78 m 24 50.7 51.88 0.20 m 39.1 40.67 1.98 m 157.0 157.14 - 25 31.9 32.47 1.53 m 31.5 31.98 1.51 m 33.9 34.30 2.27 m 26 21.6 21.96 0.82 d (7.0) 17.6 18.14 0.73 d (7.0) 22.1 22.53 0.95 d (7.0) 27 22.2 22.59 0.92 d (7.0) 20.5 21.07 0.80 d (7.0) 22.1 22.40 0.95 d (7.0) 28 15.5 15.89 0.90 d (7.0) 15.4 15.99 0.86 d (7.0) 106.0 106.57 4.64 d (7.0) 4.58 d (7.0) 29 14.3 14.70 0.87 s 30 21.3 21.73 -0.16 dd (4.0, 6.0) 0.46 dd (4.0, 9.0) a C of gorgost-5-ene-3,9,11-triol [9], brecorded in CDCl3, cC of ergost-4-ene-3-one [10], dC for the side chain of 3β,7α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene [11] The 1H- and 13C-NMR data of and were similar to those of 1, except for diffence in the data of the side chain The most easily visible changes are the absence of four high-field proton signals and the presence of 28 carbon signals in and relative to Four secondary methyl proton signals (each 3H, d, J = 7.0 Hz) in the side chain of were observed at H 0.87 (H-21), 0.73 (H-26), 0.80 (H-27), and 0.86 (H-28) suggesting for the presence of an ergosterol-type side chain, which was further confirmed by an agreement of the 13C-NMR data of (table 1) with those of ergost-4-ene-3-one [10] and combination with HMBC correlations (figure 2) 30 Luận văn thạc sỹ Sinh học The presence of a 1,1-disubstituted double bond at C 157.14 (s, C-24) and 106.57 (t, C-28)/H 4.64 and 4.64 (each 1H, d, J = 7.0 Hz, H-28), and three secondary methyl groups at H 0.88 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-21) and 0.95 (6H, d, J = 7.0 Hz, H-26 and H-27) indicating a 24-methylene ergosterol-type side chain of [11, 13] Compounds and were elucidated as ergost-4ene-3,6-dione [10, 12] and 24-methylenecholest-4ene-3,6-dione [13] by comparison of their 13C-NMR data with the reported values and combination with 2D-NMR data This is the first report of compounds 15 from S dissecta Table 2: 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of 4, 5, and reported compounds 4c C a δC b 5c d δC δC δC δH mult (J = Hz) δC δH mult (J = Hz) 36.63 36.15 2.12/1.88 m 35.5 36.01 1.39/1.86 m 34.46 34.60 2.51/2.43 m 33.8 34.46 2.12/2.52 m 198.16 200.21 - 199.5 200.01 - 125.82 126.08 6.14 brs 125.5 125.94 6.12 brs 160.77 161.75 - 161.0 161.56 - 200.98 203.03 - 202.4 202.82 - 46.36 47.45 2.01/2.65 m 47.8 47.28 2.63/1.99 m 34.44 34.84 1.87 m 34.0 34.29 2.18 m 51.09 51.60 1.34 m 50.9 51.43 1.33 m 10 39.78 40.70 - 39.1 40.30 - 11 23.65 21.50 1.61/1.47 m 20.8 21.37 1.46/1.60 m 12 40.07 39.74 1.21/2.07 m 39.8 39.62 1.22/2.06 m 13 43.07 43.15 - 42.5 43.07 - 14 56.46 57.16 1.18 m 55.8 57.02 1.15 m 15 24.50 24.61 1.59/1.15 m 23.9 24.46 1.57/1.14 m 16 28.69 28.60 1.30/1.87 m 28.0 28.50 1.28/1.87 m 17 55.9 56.98 56.40 1.14 m 56.5 56.29 1.14 m 18 11.9 12.54 12.52 0.69 s 11.9 12.39 0.68 s 31 Luận văn thạc sỹ Sinh học 19 17.4 18.03 18.22 1.13 s 17.5 18.01 1.12 s 20 36.1 36.63 36.71 1.35 m 35.6 36.11 2.11 m 21 18.8 19.39 19.45 0.90 d (7.0) 18.6 19.14 0.92 d (7.0) 22 33.7 35.97 34.60 2.51/2.43 m 34.5 35.04 1.50/1.12 m 23 30.6 26.69 31.15 1.35/0.93 m 30.9 31.42 1.84/2.06 m 24 39.1 34.40 39.66 2.07 m 156.6 157.11 - 25 31.5 29.71 32.08 1.54 m 34.2 34.29 2.17 m 26 17.6 19.77 18.14 0.76 d (3.0) 21.8 22.50 0.99 d (3.5) 27 20.5 20.53 21.15 0.82 d (7.0) 22.0 22.37 0.97 d (3.5) 28 15.4 21.41 16.08 0.75 d (3.0) 106.1 106.61 4.68/4.61 brs a C for the side chain of ergost-4-ene-3-one [10], bC of 24S-ergost-4-ene-3,6-dione [12], crecorded in CDCl3, dC of 24methylenecholest-4-ene-3,6-dione [13] 2D-NMR spectroscopic methods and comparison of their data with the published values This is the first report of these compounds from S dissecta Acknowledgements This work was financially supported by Vietnam Academy of Science and Technology (Codes: VAST.TÐ.ÐAB.02/13–15 and VAST.HTQT.Nga.06.13-14) Figure 2: Key HMBC correlations of 1, 2, and CONCLUSION Five sterols, gorgost-4-ene-3-one (1), ergost-4ene-3-one (2), 24-methyleneergost-4-ene-3-one (3), ergost-4-ene-3,6-dione (4), and 24methylenecholest-4-ene-3,6-dione (5), were isolated from the methanol extract of the soft coral Sinularia dissecta Their structures were elucidated by 1D and REFERENCES M V D'Auria, L Minale, R Riccio 32 Luận văn thạc sỹ Sinh học Polyoxygenated steroids of marine origin Chem Rev., 93(5), 1839-1895 (1993) Eunicea laciniata J Nat Prod., 63(12), 1669-1671 (2000) N S Sarma, M S Krishna, S G Pasha, T S P Rao, Y Venkateswarlu, P S Parameswaran Marine metabolites: The sterols of soft coral Chem Rev., 109(6), 2803-2828 (2009) 15 A Rueda, E Zubı́a, M a J Ortega, J Salvá Structure and cytotoxicity of new polyhydroxylated sterols from the Caribbean gorgonian Plexaurella grisea Steroids, 66(12), 897-904 (2001) V Lakshmi, R Kumar Metabolites from Sinularia species Nat Prod Res., 23(9), 801-850 (2009) B M Jagodzinska, J S Trimmer, W Fenical, C Djerassi Sterols in marine invertebrates 49 Isolation and structure elucidation of eight new polyhydroxylated sterols from the soft coral Sinularia dissecta J Org Chem., 50(9), 1435-1439 (1985) 16 P Georges, M Sylvestre, H Ruegger, P Bourgeois Ketosteroids and hydroxyketosteroids, minor metabolites of sugarcane wax Steroids, 71(8), 647652 (2006) B M Jagodzinska, J S Trimmer, W Fenical, C Djerassi Sterols in marine invertebrates 51 Isolation and structure elucidation of C-18 functionalized sterols from the soft coral Sinularia dissecta J Org Chem., 50(16), 2988-2992 (1985) P Jin, Z Deng, Y Pei, H Fu, J Li, L Van Ofwegen, P Proksch, W Lin Polyhydroxylated steroids from the soft coral Sinularia dissecta Steroids, 70(8), 487493 (2005) P Ramesh, Y Venkateswarlu Novel steroid constituents of the soft coral Sinularia dissecta Steroids, 64(11), 785-789 (1999) N P Thao, N H Nam, N X Cuong, B H Tai, T H Quang, N T T Ngan, B T T Luyen, S Y Yang, C H Choi, S Kim, D Chae, Y.-S Koh, P V Kiem, C V Minh, Y H Kim Steroidal constituents from the soft coral Sinularia dissecta and their inhibitory effects on lipopolysaccharide-stimulated production of pro-inflammatory cytokines in bone marrowderived dendritic cells Bull Korean Chem Soc., 34(3), 949 - 952 (2013) H T D'Armas, B S Mootoo, W F Reynolds Steroidal compounds from the Caribbean octocoral Eunicea laciniata J Nat Prod., 63(12), 1669-1671 (2000) 17 S Popov, R M K Carlson, A Wegmann, C Djerassi Minor and trace sterols in marine invertebrates General methods of analysis Steroids, 28(5), 699-732 (1976) 10 W.-R Abraham, G Schmeda-Hirschmann (24S)-3βhydroxy-ergost-5-en-6-one from Cyttaria johowii Phytochemistry, 36(2), 459-461 (1994) 11 F De Riccardis, L Minale, M Iorizzi, C Debitus, C Lévi Marine sterols Side-chain-oxygenated sterols, possibly of abiotic origin, from the new Caledonian sponge Stelodoryx chlorophylla Journal of Natural Products, 56(2), 282-287 (1993) 12 K A Eshbakova, B Tashkhodzhaev, Z I Tursunov, K K Turgunov, K M Bobakulov, N D Abdullaev Structure of a new sterol 24S-4-en-3,6-dione from Aconitum septentrionale Chem Nat Comp., 47(1), 73-75 (2011) 13 A Migliuolo, V Piccialli, D Sica Steroidal ketones from the sponge Geodia cydonium J Nat Prod., 53(5), 1262-1266 (1990) 14 H T D'Armas, B S Mootoo, W F Reynolds Steroidal compounds from the Caribbean octocoral 33 Luận văn thạc sỹ Sinh học Corresponding author: Nguyen Hoai Nam Institute of Marine Biochemistry, Vietnam Academy of Science and Technology 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam E-mail: namnguyenhoai@imbc.vast.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học