BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Phương Khanh BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Trần Minh Định ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: Lãnh ñạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng ñã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn. Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. TS. Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. PGS. TS Nguyễn Anh Dũng ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; ñã luôn quan tâm, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực hiện khoa luận. Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhiệt tình và có những trao ñổi quý báu trong quá trình thực hiện ñề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á ñã cung cấp chủng vi sinh vật tham khảo. Cô Giang (phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng), anh Nguyện (phòng khám ña khoa Hồng Đức), bạn Việt (Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh), Cô Oanh (BS sản khoa, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu) và các anh chị tại phòng xét nghiệm Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh, phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu, phòng khám số 46 Phan Chu Trinh, phòng khám ña khoa Hồng Đức ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu dịch phết cổ tử cung. iii Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn. Buôn Ma Thuột, ngày tháng năm 2011 Tác giả Trần Minh Định iv MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 2. Mục tiêu của ñề tài 2 3. Ý nghĩa khoa học 2 4. Ý nghĩa thực tiễn 2 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Định nghĩa ung thư cổ tử cung 3 1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung 4 1.21. Tác nhân 4 1.2.2. Các type của Human papillomavirus 4 1.2.3. Bộ gen của virus HPV type 16 5 1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV nguy cơ cao vào bộ gen người 6 1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen người hiện nay 9 1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 11 1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới 11 1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam 12 1.4. Các phương pháp phổ biến chuẩn ñoán ung thư cổ tử cung hiện nay 13 1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng 13 1.4.2. Các phương pháp chẩn ñoán dựa trên tế bào cổ tử cung 14 1.4.3. Các phương pháp chuẩn ñoán tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung 15 1.5. Phương pháp RT – PCR trong chuẩn ñoán gắn chèn gen gây ung thư cổ tử cung 19 1.6. Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung 20 1.6.1. Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 20 1.6.2. Điều trị ung thư cổ tử cung 21 v 1.7. Các loại vaccine phòng HPV hiện nay 21 Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Nội dung nghiên cứu 23 2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23 2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 23 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 23 2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 23 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 24 2.3.2. Hoá chất nghiên cứu 25 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 27 2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu 27 2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi 28 2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 28 2.4.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 30 2.4.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 30 2.4.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm 31 2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số 31 2.4.4. Phương pháp kiểm soát nội phản ứng 32 2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR 33 2.4.5.1. Phản ứng RT 33 2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR 33 2.4.6. Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR 34 2.4.7. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 35 2.4.7.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu nhận hoàn toàn RNA tổng số 35 2.4.7.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 36 vi 2.4.7.3. Khảo sát nồng ñộ mồi 36 2.4.7.4. Khảo sát nồng ñộ Mg 2+ 39 2.4.7.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP 39 2.4.7.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 39 2.4.7.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 40 2.4.9. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột 40 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16 41 3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 41 3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44 3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 45 3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 47 3.2.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết 47 3.2.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 49 3.2.3. Khảo sát nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR 50 3.2.4. Khảo sát nồng ñộ Mg 2+ 54 3.2.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP 55 3.2.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 56 3.2.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 57 3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 58 3.3. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột 60 vii Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1. Kết luận 65 4.2. Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người. BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công cụ tìm kiếm các trình tự tương ñồng. Bp base pairs: Cặp base CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tổn thương trong tế bào biểu mô cổ tử cung. Cs Cộng sự CD Chứng dương cDNA complementary DNA: DNA bổ sung dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hội các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu. HPV Human Papilomavirus IARC International Agenecy For Research on Cancer IDT Intergrated DNA Technology Kb Kilo base mRNA Messenger Ribonucleotide acid NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học. [...]... ng 3.8: Sơ nh y c a quy trình 54 quy trình phát hi n g n chèn gene E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gene ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR 56 B ng 3.9: K t qu gi i trình t gene E6 và E7 c a HPV type 16 g n chèn vào b gene ngư i 58 B ng 3.10: K t qu ki m ch ng quy trình phát hi n g n chèn gene E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gene ngư i trên các m u d ch ph t c t cung thu th... p m i E6f-E6r và 500nM v i c p m i E7f-E7r - N ng Mg2+ t i ưu cho ph n ng: 3mM - N ng dNTP t i ưu cho ph n ng: 200 M - nh y c a quy trình 103 b n sao mRNA E6 và E7/ ml - Quy trình nghiên c u c hi u cho phát hi n s g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i 4 K t qu gi i trình t s n ph m khu ch khu ch i c a qui trình ã kh ng nh s n ph m i thu c gen E6 và E7 c a HPV type 16 do g n chèn vào b... c t cung thu th p t i Tp Buôn Ma Thu t 62 23 Ph n II N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 N i dung nghiên c u 1 Nghiên c u thi t k và ki m tra m i khu ch i c hi u gen E6 và E7 c a HPV type 16 2 Xây d ng quy trình phát hi n s g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR - Nghiên c u n ng enzym DNase I x lý d ch sau tách chi t - Kh o sát nhi t lai... thu th p t i Tp Buôn Ma Thu t và ã phát hi n 1 m u thu t i phòng khám s 120 H Tùng M u có g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i 66 4.2 Ki n ngh Nh m hoàn thi n và nâng cao hi u qu phát hi n g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t sinh h c phân t , tài có m t s ki n ngh sau: 1 Ti p t c nghiên c u hoàn thi n ánh giá hi u l c sơ c p và th c p c a quy trình nh m... và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR trên các m u d ch ph t c t cung b nh ph m thu th p t i Tp Buôn Ma Thu t Th c hi n ph n ng multiplex RT-PCR ã nghiên c u trên 86 m u d ch ph t c t cung thu th p t i Tp Buôn Ma Thu t – ăk Lăk, qua ó xác gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i nh s g n chèn 65 Ph n IV K T LU N VÀ KI N NGH 4.1 K t lu n Qua nghiên c u và th c hi n tài,... chúng tôi i t i m t s k t lu n sau: 1 Thi t k thành công h m i phát hi n c hi u s g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i 2 Thi t k thành công ch ng n i nh m ki m soát n i ph n ng 3 Bư c u xây d ng thành công các i u ki n c a quy trình phát hi n s g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR - N ng enzym DNase I thích h p cho x lý DNA còn sót l i... cung do HPV type 16 gây ra b ng k thu t multiplex RT-PCR 2 M r ng nghiên c u hoàn thi n quy trình ch n oán ti n ung thư c t cung trên các HPV type khác thu c nhóm type "nguy cơ cao" gây ung thư c t cung b ng k thu t multiplex RT-PCR 41 Ph n III K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Nghiên c u thi t k và ki m tra m i khu ch i c hi u gen E6 và E7 c a HPV type 16 3.1.1 Thi t k và ki m tra m i Sau khi thi t k và ki m tra... n ph m PCR ư c ghi nh n s i chi u v i ch ng dương, ch ng âm và thang chu n 100bp 35 2.4.7 Phương pháp xây d ng quy trình phát hi n g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR Quy trình multiplex PCR th c hi n trên ch ng dương là m u b nh ph m ung thư c t cung ã ư c xác b sung ch ng n i nh do HPV type 16 gây ra Trong m i ph n ng luôn giai o n PCR nh m ki m soát... trình phát hi n g n chèn gen E6 và E7 c a HPV type 16 vào b gen ngư i b ng k thu t multiplex RT-PCR trên các m u m u d ch ph t c t cung thu th p t i Tp Buôn Ma Thu t 2.2 2.2.1 a i m và th i gian nghiên c u a i m nghiên c u - Phòng thí nghi m Sinh h c phân t - B môn Sinh h c th c nghi m, Khoa KHTN&CN, trư ng i h c Tây Nguyên - Phòng thí nghi m CNSH&MT, trư ng i h c Tây Nguyên 2.2.2 Th i gian nghiên. .. i xuôi E6f có v trí t nucleotide 116 t i nucleotide 139 và m i ngư c E6r có v trí t nucleotide 420 t i nucleotide 382 c a gen E6 C p m i E6f – E6r khu ch i m t o n DNA có kích thư c 287 bp M i xuôi E76 f có v trí t nucleotide 91 t i nucleotide 110 và m i ngư c E7r có v trí t nucleotide 273 t i nucleotide 254 c a gen E76 C p m i E76 f – E76 r khu ch i m t o n DNA có kích thư c 183 bp Thông tin v và 3.4 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT. trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene người 58 Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch. của quy trình 54 Bảng 3.8: Sơ ñồ quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 56 Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7