BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN ………………………. NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG Buôn Ma Thuột, năm 2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan: ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. HỌC VIÊN NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ii LỜI CẢM ƠN! Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: Người thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng ñã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. TS. Phan Văn Tân ñã tạo ñiều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn tại bộ môn sinh học thực vật. ThS. Nguyễn Đình Sỹ ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tất cả các thầy cô giáo Khoa Sau ñại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên. Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị và các bạn ñồng nghiệp Trường THCS Đoàn Kết ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian công tác và học tập. Tất cả các anh, chị và các bạn trong lớp cao học Sinh học thực nghiệm khóa 1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Chị Tuyến, em Ngọc, em Bình ở Bộ môn Sinh học thực vật ñã tạo ñiều kiện thuận lợi, ñộng viên và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này. Cuối cùng xin gửi lòng biết ơn ñến tất cả những người thân trong gia ñình ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi học tập và làm việc trong suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN iii MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắt i Danh mục ảnh ii Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về cây khoai lang 3 1.1.1 Đặc ñiểm sinh học 3 1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang 7 1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang 8 1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang 9 1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô 14 1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 1.2.4 Các bước nhân giống invitro 15 1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy 15 1.2.6. Mẫu cấy 17 1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 18 1.2.8. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật 19 1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 25 1.4 Sự phát sinh hình thái 26 1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 28 iv 1.6. Tổng quan về Chitosan 29 1.6.1. Công thức cấu tạo 29 1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan 31 CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Nội dung nghiên cứu 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1. Vật liệu, hóa chất 40 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của mô nuôi cấy 41 2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường ñến sự hình thành protocorm 44 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân khoai lang in vitro 46 2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai lang in vitro 48 2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô 50 2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê 52 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 53 3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 53 v 3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 57 3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 69 3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm 62 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng ñến hình thành chồi và rễ cây con trong in vitro 65 3.3.1. Ảnh hưởng của N 6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành chồi và tăng trưởng chồi cây khoai lang 65 3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành rễ cây khoai lang 69 3.4. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô 75 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81 KẾT LUẬN 81 ĐỀ NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Acid abscisic BA N 6 – benzyladenine cs cộng sự CV Coefficient of Variation GA 3 Gibberellin MS Murashige và Skoog NAA Napthalen acetic acid IAA Idol – 3 – acetic acid IBA Indol – 3 – btyric acid TDZ Thidiazuron JA Jasmonic acid vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 55 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 59 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 61 Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm sau 40 ngày nuôi cấy 64 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 67 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 72 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy 77 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin 19 Hình 1.2. Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp 19 Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 20 Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA 4 thành các GA khác 21 Hình 1.5. Cấu trúc của ABA 22 Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen 22 Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ 23 Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) 31 Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) 31 Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) 31 Hình 1.11. Cơ chế hoạt ñộng của Chitosan 39 Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1% (A), 0.3% (B), 0.5% (C) 56 Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 60 Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 62 Hình 3.4. Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68 [...]... Nghiên c u ngoài nư c v cây khoai lang t o gi ng cho năng su t cao, ph m ch t t t, s ch b nh, trên th gi i ã nghiên c u nhân gi ng khoai lang b ng k thu t nuôi c y mô Tuy nhiên nh ng nghiên c u v nuôi c y mô khoai lang trên th gi i còn r t h n ch Hwang, Robert (1983) nghiên c u nuôi c y mô khoai lang b ng k thu t nuôi c y mô r s d ng môi trư ng MS v i n ng khoáng và inositol cao S d ng chóp ng n, ch... sinh h c trong vi c phát tri n nông nghi p b n v ng, v a tăng năng su t cây tr ng, gi ng không b thoái hoá, không sâu b nh, gi m t l nhi m trong nuôi c y mô Chúng tôi nghiên c u su t tài: ‘ Nghiên c u b sung Chitosan oligomer trong nuôi c y mô khoai lang cao s n Nh t B n (Ipomoea batatas L.).’’ M c tiêu c a • tài : Xây d ng quy trình nhân gi ng khoai lang cao s n b ng công ngh nuôi c y mô t bào trong. .. u cao ch i, s r và chi u dài r t ch i cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi c y 73 Hình 3.9 nh hư ng c a n ng chitosan oligomer n chi u cao ch i c a khoai lang nuôi c y mô sau 30 ngày 78 Hình 3.10 nh hư ng c a n ng chitosan oligomer n kh i lư ng ch i tươi và kh i lư ng ch i khô c a khoai lang nuôi c y mô sau 30 ngày 78 1 M U Khoai lang (Ipomoea batatas L (Lam) là cây lương... ã nghiên c u s hình thành c khoai lang in vitro t mô r cây khoai lang in vitro Sau 6-7 nuôi c y ư ng kính c a r l n nh t l n hơn 2mm dư i tác d ng c a ch t i u hòa sinh trư ng th c v t JA trong 9 môi trư ng c và BA trong môi trư ng l ng, ph n r phình to ra có màu , màu t nhiên c a cây tr ng này[53] Podobo (1995) nghiên c u nhân gi ng khoai lang t lá theo quy trình g m 2 bư c: nuôi c y mô lá trên môi... ng khoai lang trong vi c t o mô s o lá và t o i u ki n cho vi c tái sinh khi mô lá ư c chuy n sang môi trư ng không có ch t i u hòa sinh trư ng th c v t [22] Môi trư ng cho t l tái sinh ch i cao nh t gi ng khoai lang Chiêm dâu là môi trư ng MS có b sung 1ppm/l BA + 0.5ppm/l NAA và gi ng khoai lang NN31 là môi trư ng MS có b sung 1ppm/lBA + 0.1ppm/l IAA, ch i ư c hình thành là ch i ơn và tái sinh t mô. .. c a r , ch i trong nghiên c u nuôi c y mô t y thu c lá ph thu c vào n ng auxin/cytokinin và t tương ic a ó ưa ra quan ni m i u khi n hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan th c v t 13 Năm 1962, Murashige và Skoog ã thành công trong vi c c i ti n môi trư ng nuôi c y, ánh d u m t bư c ti n quan tr ng trong kĩ thu t nuôi c y mô Môi trư ng c a h c y nhi u lo i cây và cho ã ư c dùng làm môi trư ng cơ... tr ng khoai không ăk Nông là t nh i u tư thâm canh u trong tr ng và xu t kh u khoai lang cao s n Nh t B n T năm 2004, Sau khi gi ng khoai lang nh t b n (Benniazuma) ư c du nh p vào lang c a t nh a bàn t nh ăk Nông n nay, di n tích gieo tr ng khoai ăk Nông ngày càng ư c m r ng T ng di n tích khoai lang năm 2004 là 1,917 ha, s n lư ng 9,251 t n, năm 2005 là 2,333 ha, s n lư ng 21,668 t n (khoai lang Nh... Hình 3.5 Chi u cao ch i c a cây khoai lang khi BA và Kinetin thay n ng các và t l khác nhau sau 30 ngày nuôi c y 68 Hình 3.6 Chi u cao ch i c a cây khoai lang khi IBA và NAA thay n ng i i các và t l khác nhau sau 30 ngày nuôi c y 72 Hình 3.7 S r c a cây khoai lang khi IBA và NAA thay i các n ng và t l khác nhau sau 30 ngày nuôi c y .73 Hình 3.8 nh hư ng c a IBA và NAA lên chi u cao ch i, s r... sang môi trư ng MS b sung zeatin riboside K t qu cho th y r ng mô lá c a các gi ng khoai lang ư c c y trên môi trư ng MS có b sung 0,2mg/l-1 2,4 D thì có 19/27 gi ng có bi u hi n s tái sinh ch i, 8 gi ng không có ph n ng Trong ó, gi ng có t l tái sinh ch i cao nh t là PI 318846-3 (78,6%) và khi chuy n sang môi trư ng MS b sung 0.2mg/l-1 zeatin riboside thì gi ng này cũng có t l tái sinh ch i cao nh... 1.1.4 Nghiên c u trong nư c v cây khoai lang Khoai lang là cây lương th c ng n ngày quan tr ng c a Vi t Nam, là cây tr ng l y c có th i gian sinh trư ng ng n kho ng 90 – 110 ngày, ch u h n, ch u t x u, u tư th p, ít chăm sóc, ít sâu b nh, nên ư c nông dân ưa tr ng V i các gi ng cao s n, thâm canh chăm sóc t t, khoai lang có th cho năng su t cao 20 – 25 t n/ha và ti m năng năng su t c a khoai lang có . tài: ‘ Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’ Mục tiêu của ñề tài : • Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng. Tuy nhiên những nghiên cứu về nuôi cấy mô khoai lang trên thế giới còn r ất hạn chế. Hwang, Robert (1983) nghiên cứu nuôi cấy mô khoai lang bằng kỹ thuật nuôi cấy mô rễ sử dụng môi trường MS. NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ