BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Bích Ngọc MSSV: 0811110055 Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu sử dụng trong khóa luận là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa luận. Sinh viên thực hiện Phạ m Thị Bích Ngọc Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc ii MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Mục tiêu đề tài 2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 3 2.1. Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 3 2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người 3 2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 4 2.2. Giới thiệu về Vibrio spp 7 2.2.1. Lịch sử phát hiệ n Vibrio spp. 7 2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố 9 2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp 9 2.2.2.2. Phân bố 10 2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. 10 2.2.3.1. Đặc điểm chung 10 2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài 11 2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp. 14 2.2.5. Yếu tố độc lực 15 2.2.6. Cơ chế gây bệnh 18 2.2.7. Triệu chứng gây bệnh 21 2.2.7.1. Trên người 21 2.2.7.2 Trên động vật 23 2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 24 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam 24 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iii 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới 24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 26 3.1. Phương pháp truyền thống 26 3.1.1. Phương pháp định tính 26 3.1.1.1. Nguyên tắc. 26 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ 26 3.1.1.3. Môi trường và hóa chất 26 3.1.1.4. Quy trình phân tích. 28 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình 29 3.2. Phương pháp hiện đại 42 3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) 42 3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) 43 3.2.1.2. Sandwich ELISA 44 3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) 45 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) 46 3.2.2.1 Nguyên tắc 47 3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR 47 3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) 51 3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray 52 3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp 53 3.2.4.2. Các bước thực hiện 54 3.2.5. Kỹ thuật RAPD 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 61 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADH: Antidiuretic hormone APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic DNA: Acid Deoxyribo Nucleic ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays EU: Liên minh Châu Âu FDA: Food and Drug Administration HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points HLG :Canh Hugh Leifson Glucose KCN:Khu công nghiệp KI:Thạch Kligler Iron KIA: : Klingler Iron Agar KL: Khuẩn lạc KNXK: Kiêm ngạch xuất khẩu LDC: Linguistic Data Consortium NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng NST: Nhiễm sắc thể NTTS: Nuôi trồng thủy sản OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside ORF: Open reading frame PCA: Polymerase Chain Reaction TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose TSA: Thạch Tryptone Soya TSI: Triple Sugar Iron agar WHO: Tổ chức Y tế Thế giới Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ 4 Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU 4 Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả 19 Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho là gây bệnh ở người 20 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus 31 Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 41 Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 41 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Vibrio harvey 9 Hình 2.2: V.parahaemolyticus 12 Hình 2.3: V.cholerae 13 Hình 2. 4: V. vulnificus 13 Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae 19 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người 21 Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả 22 Hình 2.8: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio…………………… 23 Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh 23 Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar 29 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey 30 Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS…………… 30 Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA 32 Hình 3.5: Vibrio cholerae 33 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate 35 Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate 35 Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate 36 Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase 37 Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea 38 Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG…………………………………………… 38 Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG 39 Hình 3.13: ELISA gián tiếp. 44 Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA 45 Hình 3.15: ELISA cạnh tranh 46 Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR 48 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng, các chất dinh dưỡng cần thiết để con người sống và phát triển. Thế nhưng thực phẩm cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm, nếu như không bảo đảm được vệ sinh và an toàn. Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) là vấn đề xã hội đang được rất nhiều người quan tâm, bởi lẽ VSATTP tác động trực tiếp đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống con người và ảnh hưởng đến chất lượng phát triển của xã hội và nòi giống. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có hơn 400 căn bệnh lây truyền qua thực phẩm không an toàn. VSATTP đã được đặt lên hàng đầu nghị trình tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu, nhưng tình hình gần như không được cải thiện bao nhiêu, nhất là khi thế giới liên tiếp xảy ra thiên tai và nguồn nước sạch ngày càng hiếm. Khi người dân không có đủ miếng ăn thì việc kiểm tra chất lượng những gì mà họ ăn đã trở thành điều khá xa vời. Tiến sĩ Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết mỗi tháng Liên hiệp quốc nhận được khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia về các trường hợ p thực phẩm bị nhiễm độc. Chất lượng VSATTP hiện nay rất đáng lo ngại, đã được rất nhiều các phương tiện thông tin đại chúng phản ánh. Việc sử dụng không an toàn về phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông nghiệp, thủy hải sản hiện nay còn khá phổ biến. Có rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực ph ẩm, nhưng chủ yếu là người bị ngộ độc đã hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn đã bị ôi thiu, thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, không đạt yêu cầu hoặc do bảo quản không tốt. Khi đó, các loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc và ký sinh vật có điều kiện hoành hành. Vi sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ô nhi ễm, mất vệ sinh an toàn thực phẩm và có tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong nhóm vi sinh Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 2 vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Vibrio spp, E. Coli và Listeria là đáng sợ nhất. Một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại nhất hiện nay đó là ngộ độc do nhóm vi khuẩn tả Vibrio spp gây ra trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh (tôm, cá, mực…). Chúng có thể nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản bất kỳ lúc nào và được xem là nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng trên thế giới. Vibrio spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và mất nước. Bệnh tả do vi khuẩn này gây ra có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng. Dịch tả tấn công vào nước Anh vào năm 1848 – 1848 làm hơn 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 đã cướp đi 1/8 dân số thành phố London. Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truy ền sang Ecuador, Colombia, Mexico và Nicaragua kết quả hơn 12.000 người chết. Nếu hiểu biết đúng và kịp thời chúng ta có thể ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ mình và cộng đồng xung quanh. Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hi ểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu, đi sâu tìm hiểu về vi khuẩn Vibrio spp và đưa ra một số phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp. 1.3. Mục tiêu đề tài • Khảo sát về cấu trúc của Vibrio spp. • Khảo sát về sự phân bố của Vibrio spp. • Tình hình nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay. • Một số phương pháp xác định Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững. Thực phẩm thuỷ hải sản còn giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xoá đói giảm nghèo. Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt Nam. Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình mặt hàng thuỷ sản của mỗi người dân Việt Nam là 19,4 kg, cao hơn mức tiêu thụ trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) và thị t gia cầm (3,9 kg/người). Số lao động của ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng 3,8 triệu người năm 2001 (kể cả lao động thời vụ), như vậy, mỗi năm tăng thêm hơn 100 nghìn người. Xuất khẩu thực phẩm thủy hải sản cũng góp phần giúp các quốc gia khác bù đắp lượng thiếu hụt về lương thực, thực phẩm. Kim ngạch xuất khẩu toàn ngành nông nghiệp Việt Nam năm 2008 là 16,237 tỷ USD (Nông sản: 8,42 tỷ; Thủy sản: 4,502 tỷ; Lâm sản: 2,996 tỷ). Trong những mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam thì thủy sản luôn đứng ở vị trí cao. Trong số các nước có kim ngạch xuất khẩu thủy sản lớn thì Việt Nam là nước có tốc độ tăng nhanh nhất. Tỷ lệ tăng trưởng trung bình thời kỳ 1992 - 2003 là 20,4%, mức tăng bình quân nă m đạt 9,97%. Đến năm 2003, Việt Nam đứng thứ 7 trong số các nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Năm 1992 xuất khẩu thủy sản đạt 308 triệu USD, nhưng tới năm 2003 là 2,2 tỷ USD; năm 2005 vượt mức 2,5 tỷ USD và dự tính đến năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,8 tỷ USD. [...]... thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 25 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 3.1 Phương pháp truyền thống 3.1.1 Phương pháp định tính 3.1.1.1 Nguyên tắc Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường... môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.  Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh Kết luận Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 28 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 3.1.1.5 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau... xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 8 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 2.2.2 Phân loại Vibrio spp và phân bố 2.2.2.1 Phân loại Vibrio spp a Phân loại theo khoa học Vibrio spp thuộc : • Giới (regnum):... trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen 2.2.8 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 2.2.8.1 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản là rất đáng báo động Dịch tiêu chảy cấp năm 2007 xảy ra với diễn... SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 27 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 3.1.1.4 Quy trình phân tích 25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) giây độ pha loãng 10-1 đồng nhất trong 30 Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn Ủ trong 18 – 22 giờ.  Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae... Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 24 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong. . .Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ (đơn vị: triệu USD) Năm 1992 1996 2000 2001 2002 2003 2005 KNXK 308 697 1479 1778 2023 2200 2500 126,3 112,2 20,2 13,8 8,7 13,6 % tăng so với năm trước Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường... sản Việt Nam đó là nguyên liệu thuỷ sản có lẫn tạp chất hoá học và việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh trong nguyên liệu thuỷ sản SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 5 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Về thực trạng thuỷ sản nhiễm tạp chất vào nguyên liệu thuỷ sản Đã xuất hiện hoạt động gian lận thương mại nhằm kiếm lời bất chính từ năm 1983- 1995, bắt đầu từ việc đưa đinh... kiện trong môi trường tồn tại tự nhiên của phẩy khuẩn (môi trường nước) có thể trở thành yếu tố tác động, kích kích sản sinh độc tố và gây nhiễm SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 17 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 2.2.6 Cơ chế gây bệnh Trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tả chỉ gây bệnh cho người Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống Để xuống được ruột non, vi khuẩn phải... phép xuất khẩu thuỷ sản sang các thị trường tăng lên Số lượng các lô hàng bị nhiễm hoá chất, dư lượng kháng sinh đã giảm đi rất nhiều so với các năm trước đây SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 4 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh • Ở Việt Nam Trong 3 tháng đầu năm 2006, thuỷ sản xuất khẩu qua kiểm tra chất lượng đạt 84.800 tấn, tăng 15% so với cùng kì năm trước trong đó khối lượng . ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH. phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 24 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam 24 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy. nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay. • Một số phương pháp xác định Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: