Các kỹ thuật gen sử dụng tạo sinh vật biến đổi gen THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN Nguyễn Tiến Thành - HUST Làm thế nào tạo GMO Gen Tế bào sinh vật Tế bàgen o sinh vật mang chuyển bình thường (GMO) Các bước chính tạo GMO Lựa chọn gen và sinh vật cho gen tách gen từ sinh vật cho gen, “tách dòng” kháng sâu đục thân cry từ Bacillus cry Sàng lọc tế bào đạt yêu cầu Chuyển gen vào tế bào đích Chọn cá thể ngô có đặc điểm khán g sâu Sún g bắn gen vào ngô Thiết kế cấu trúc biểu gen Promoter-cry-Terminator Đưa gen lên các phương tiên chuyển hạt vàn g Các kỹ thuật bản u Tách chiết, tinh sạch DNA hệ gen u Khuếch đại DNA u Cắt và ghép nối DNA u Chuyển (Biến nạp) DNA vào tế bào vật chủ u Các phương pháp đánh giá kết quả chuyển gen Chọn gen mục tiêu và sinh vật cho gen u u Thường là các gen tạo cho sinh vật nhận các đặc tính : u Kháng sâu đục thân: cry từ Bacillus thurigensis u Kháng thuốc trừ cỏ: bar từ Streptomyces, espsp từ Agrobacterium… u Hormon sinh trưởng: từ cá hồi Chinok u Etc Cần rõ trình ̀ tự DNA, đặc biệt là vùng mã hóa cho protein tương ứng Tách gen từ sinh vật cho u Phương pháp chủ đạo là ”câu” nhân gen (khuếch đại gen) từ DNA hệ gen của sinh vật cho gen: u Tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen Trường hợp sinh vật cho gen là virus thì cần tạo cDNA từ RNA của virus u Nhân gen từ DNA hệ gen đã tách chiết Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen Phương pháp nhân gen Phương pháp tách/tinh sạch DNA hệ gen u Mục đích: thu DNA nguyên vẹn (không bị cắt đoạn, gẫy), không lẫn thành phần khác (protein…), hiệu suất thu hồi cao u Nguyên tắc chính: u Phá màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA u Tách DNA khỏi thành phần khác u Thu nhận DNA Phương pháp tách chiết/tinh DNA u u u Phá màng tế bào, màng nhân: kết hợp phương pháp u Cơ học: nghiền Ni tơ lỏng, siêu âm, rung lắc với bi thuỷ tinh u Hoá học: lyzozyme (enzyme phân giải màng peptidoglycan), SDS (giãn mạch protein), proteinase (thuỷ phân protein, tách DNA khỏi protein), Rnase (phân giải RNA) Tách DNA khỏi thành phần khác: phương pháp u Trích ly phenol – chloroform để thu protein, DNA pha nước u Sử dụng cột silica, bám đặc hiệu DNA Thu nhận DNA u Kết tủa isopropanol, ly tâm thu kết tủa u Rửa giải DNA màng silica thu DNA Tách chiết DNA Phương pháp nhân gen u PCR: polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp, dựa đặc tính của DNA và khả tổng hợp chuỗi của DNA polymerase chuỗi khuôn từ các mồi bổ sung ban đầu (xem tái bản gen) u Cần có: u u Đoạn DNA gốc cần nhân lên u Các nucleotide A, T, G, C tự u Enzyme DNA polymerase u Các mồi: mồi: xuôi và ngược ứng với mạch đơn DNA u Thiết bị luân nhiệt Kết quả: từ đoạn DNA kép gốc tạo số lượng vô cùng lớn các đoạn DNA kép giống với DNA gốc Phương pháp nhân gen Nguyên tắc phản ứng PCR Đoạn DNA ban đầu Mồi Các nucleotide Biến tính tại 94 –96oC Bắt cặp tại 55 - 65oC Kéo dài tại 72oC Phương pháp nhân gen PCR u u Thiết kế mồi: u Mồi định sản phẩm PCR u Để thu sản phẩm, mồi cần thiết kế dựa đoạn gen cần ”câu” nhân lên từ DNA cần trình tự đoạn gen cần “câu” u Mồi cần có chiều dài đủ để bắt cặp mồi với DNA đích đúng: 20 -25 nt u Tỷ lệ GC tốt 50% Tổng hợp mồi: cơng ty bên ngồi thực Phương pháp nhân gen PCR u Thực các thiết bị luân nhiệt: các nhiệt độ khác (95oC, 60oC, 72oC), thời gian khác nhau, lặp lại chu trình nhiều lần Phương pháp nhân gen PCR u Kiểm tra sản phẩm nhân gen: sử dụng điện di agarose u Sản phẩm nhân gen đưa vào agarose, đặt điện trường, DNA sẽ di chuyển tùy thuộc và kích thước của nó (nhỏ thì nhanh, lớn thì chậm) là hỗn hợp nhiều DNA kích thước khác nhau, sau thời gian sẽ phân tách chúng u Quan sát sự phân bố các sản phẩm DNA tia UV với sự hỗ trợ của ethidium bromide (EtBr) Kiểm tra sản phẩm nhân gen điện di agarose Điện trường Điện tích âm DNA từ phản ứng nhân gen Đưa vào các đường chạy Agarose, có kèm DNA chuẩn biết kích thước DNA phân tách theo kích thước Chất màu Điện tích dương Hiện sản phẩm UV So sánh kích thước “Tách dòng” gen u “Tách dòng”: Là thuật ngữ thể cơng việc sau đã thu gen đích, chuyển vào “phương tiện” để giữ gen, đồng thời có thể tạo số lượng gen lớn cần u “phương tiện” giữ gen thường là các vec tơ các vi sinh vật trung gian giữ vector đó, loại vector phổ biến là các plasmid u Plasmid giữ gen thường có kích thước nhỏ, có thể tồn tại số lượng lớn (vài trăm plasmid) tế bào giữ plasmid u u Plasmid cần tương thích (không bị đào thải) với tế bào giữ plasmid “Phương tiện” phổ biến: thường là vi khuẩn E.coli, nấm men… và các plasmid tương ứng với nó “Tách dòng” gen u Cấu trúc chung của plasmid dùng để “tách dòng”: • Gen chọn lọc: gen kháng kháng sinh • Tín hiệu khởi đầu tái bản: cần phù hợp với tế bào mang plasmid (cho phép plasmid có thể nhân lên tế bào) và định số lượng bản plasmid tế bào • Vùng MCS: cho phép có thể mở vòng plasmid để gắn thêm gen đích vào Gen chọn lọc khung Gen chọn lọc Vùng MCS Vùng MCS Gen đích Tín hiệu khởi đầu tái bản Tín hiệu khởi đầu tái bản Plasmid tách dòng pJET (E.coli) Cắt hạn chế DNA (restricted digestion) u DNA có thể bị phân giải toàn bộ = enzyme DNAse (cắt thành các nucleotit đơn) u u Đôi cần chú ý không bị nhiễm tạp từ ngoài vào DNA có thể bị cắt “hạn chế” = enzyme RE (restriction enzyme) tại số vị trí đặc biệt u Các enzyme RE có các điểm nhận biết đặc hiệu trình tự DNA, có thể cắt tại ví trí nhận biết (loại II), cách xa vài nucleotit (loại III) 1000 – 2000 nucleotit (loại I) u Loại II sử dụng rộng rãi cho kỹ thuật gen, loại III sử dụng RE cắt DNA u Cách gọi tên: EcoRI: chữ cái đầu Tên giống - tên loài – chủng số thứ tư la mã ̣của enzyme tìm từ loài vi sinh vật này: từ E.coli chủng H thứ I u Đặc điểm vị trí nhận biết của các RE: đối xứng nghịch đảo u Cách cắt: tạo đầu (blunt end) đầu dính (sticky end) u Điều kiện hoạt động phụ thuộc RE, thông thường là 37oC, pH trung tính, có mặt ion kim loại Vector tách dòng pJET u Có điểm cắt SalI, BamHI plasmid bên? u Nếu cắt plasmid bên các enzyme này thì sản phẩm có đoạn DNA? Ghép nối DNA (ligation) u Sử dụng enzyme có tên là ligase: tạo liên kết este đầu 5’ P và đầu 3’ OH u Có thể ghép nối đầu đầu đầu lệch u Phổ biến là enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4 Thường có sản phẩm thương mại u Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thời gian ngắn (5 -10 phút), nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài (qua đêm)