1 MỞ ðẦU Cây thuốc Việt Nam rất phong phú và ña dạng. Việc sử dụng nguồn tài nguyên quý giá này ñể phòng ngừa chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người ñã có một quá trình lịch sử hàng ngàn năm và ngày càng ñược chú ý quan tâm hơn trong xã hội hiện ñại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ñang phát triển rất mạnh và dần trở thành một ngành sản xuất mang hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ này ñã giúp tạo ra ñược một số lượng lớn cây trồng ñồng nhất trong một thời gian ngắn, duy trì các tính trạng tốt từ thế hệ này sang thế hệ khác. Thực chất, nuôi cấy mô tế bào thực vật là một bước tiến bộ vượt bậc về chất của các phương pháp nhân giống vô tính cổ ñiển như giâm cành, chiết, ghép, tách dòng… Nói cách khác, nuôi cấy mô ñã biến những phương pháp cổ ñiển ñó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất mà phương pháp cổ ñiển không thể vượt qua [10]. Trong những năm gần ñây, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ñã áp dụng thành công cho nhiều loại cây. ðối với những loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô ñã ñem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học có nhiều triển vọng, ñược ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ Gừng (Zinggiberaceae) chi Amomum, là một loại dược liệu rất quý, chuyên trị các bệnh ñường ruột, kém tiêu hóa và dung làm gia vị, hương liệu. Sa nhân ñược dùng nhiều trong nước và ñược xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới. Sa nhân là loại thuốc quý ñược sử dụng nhiều trong y học phương ðông, bao gồm cả Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Triều tiên và một số quốc gia khác. Hạt sa nhân còn ñược dùng làm gia vị, tinh dầu hạt sa nhân 2 cũng ñược dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm ñể sản xuất nước hoa, dầu gội ñầu và xà phòng thơm. Sa nhân tím phân bố chủ yếu ở vùng Tây Nguyên và một số tỉnh thuộc khu vực duyên hải Nam Trung Bộ, là một loại cây ưa bóng và mọc xen giữa nhiều cây khác. Sa nhân trong tự nhiên phát triển rất mạnh. Mỗi năm cứ ñến vụ người ta lại vào rừng hái quả sa nhân ñem di bán. Với giá 8.000 – 10.000 ñ/kg quả sa nhân tươi, sau khi phơi là 150.000 – 200.000 ñ/kg quả khô thì sau trồng 2 năm ñã cho thu nhập 6 – 8 triệu ñồng/ha và những năm tiếp theo còn cao hơn [15]. Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn phá rừng, do triệt hạ rừng tự nhiên ñể mở rộng diện tích sản xuất nông nghiệp như: trồng rừng cao su, trồng rừng keo, trồng sắn ñã làm thu hẹp phân bố của cây sa nhân, làm giảm trầm trọng năng suất, sản lượng hằng năm, ảnh hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế và ñời sống của hộ gia ñình vùng núi. Trước thực trạng ñó nếu chúng ta không kịp thời khoanh vùng, bảo vệ, trồng mới và có những biện pháp tích cực thì nguồn gen quý giá này cũng dần bị mất ñi. Nhân giống sa nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra ñược một sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục ñược những khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống, giúp cho người dân chủ ñộng ñược mùa vụ không phải mất diện tích trồng cũng như chi phí lưu trữ giống. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hàh dề tài : " Bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu). 3 Phần 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NHÂN GIỐNG INVITRO THỰC VẬT 1.1.1. Lược sử phát triển và tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và ñưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann ñề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào: + Mọi cơ thể sống ñược cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào. + Tế bào là ñơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống. + Tế bào chỉ ñược tạo ra từ tế bào tồn tại trước ñó [5]. Năm 1902, Haberlandt lần ñầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1934, Kogl lần ñầu tiên xác ñịnh ñược vai trò của IAA, hoocmon thực vật ñầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White ñã ñồng thời nuôi cấy callus thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, callus có khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs ñã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs ñã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin ñóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. ðến năm 1957, Skoog và Miller ñã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng ñộ các chất auxin/cytokinin trong môi trường ñối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng ñộ IAA/ nồng ñộ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi tỷ lệ IAA/kinetin lớn 4 hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng ñộ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh [10], [18]. Năm 1949, Limmasets và Cornuet ñã phát hiện rằng virus phân bố không ñồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng ñỉnh sinh trưởng. Năm 1952, Morel và Martin ñã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến ñã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus ñược dùng rộng rãi ñối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952, Morel và Martin lần ñầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật vi ghép sau ñó ñã ñược ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp vô tính khác nhau, ñặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh. Năm 1960, Morel ñã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại ñịa lan Cymbidium, mở ñầu công nghiệp vi nhân giống thực vật [18]. Năm 1960, Cocking lần ñầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và ñã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau ñó ñã ñược hoàn thiện ñể tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1971, Takebe và cs ñã tái sinh ñược cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần ñầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo ñược cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo ñược cây lai soma "cà chua - thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. ðến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần ñã thành công ở nhiều loài thực vật [17]. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần ñầu tiên thành công trong tạo ñược cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau ñó ñã ñược nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng ñơn bội, dòng thuần nhị bội kép, cố ñịnh ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 ñể tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai) [18], [19]. Năm 1959, Tulecke và Nickell ñã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô 5 thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs ñã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 lít. Năm 1978, Tabata và cs ñã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ ñã chọn lọc ñược dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần ñầu tiên sản xuất chất trao ñổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn ñã ñược thương mại hoá ở mức công nghiệp ñể sản xuất sinh dược [18], [19]. Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và Scowcroft ñã ñưa ra thuật ngữ "biến dị dòng soma" (somaclonal variation) ñể chỉ các thay ñổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro. Từ các dòng tế bào hoặc cây biến dị di truyền ổn ñịnh có thể nhân nhanh, tạo ra các dòng và giống ñột biến có năng suất, hàm lượng hoạt chất hữu ích cao, kháng một số các ñiều kiện bất lợi như bệnh, mặn, hạn,… [18]. ðến nay các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh rằng mức ñộ thành công của chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gen. Năm 1974, Zaenen và cs ñã phát hiện plasmid Ti ñóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall) ở cây trồng. Năm 1977, Chilton và cs ñã chuyển thành công T- DNA vào thực vật. Năm 1979, Marton và cs ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng ñồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Năm 1982, Krens ñã chyển thành công DNA vào tế bào trần. Năm 1985, Fraley và cs thiết kế vector plasmid Ti ñã loại bỏ các gen ñộc gây hại ñể sử dụng cho việc thiết kế vector chuyển gen vào thực vật. Cùng trong năm, Horsch và cs ñã chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen. An và cs (1985) ñã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật. Năm 6 1987, Klein và cs ñã sử dụng súng bắn gen (particle gun) mang vi ñạn trong chuyển gen và tái sinh ñược cây biểu hiện gen chuyển. Năm 1994, thương mại hoá giống cà chua chuyển gen 'FlavrSavr' [19]. 1.1.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói ñây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người ñã thúc ñẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc ñộ vốn có trong tự nhiên. ðiều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian ñể ñưa một giống mới và sản xuất với quy mô lớn [11], [19]. Ngoài ra, dựa vào kĩ thuậ nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản ñược nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài thực vật sinh sản sinh dưỡng. Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống cổ ñiển không thực hiện ñược. Bên cạnh ñó, các nhà nghiên cứu ñã thu nhận các chất trao ñổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn ñến sự ổn ñịnh và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên " mở ra triển vọng sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học ñể thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [9]. Ưu ñiểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong ñiều kiện in vitro ñể sản xuất các hợp chất thứ cấp: + Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý. Không cần thiết ñể vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô. + Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của 7 nguyên liệu thô, sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. + Một số sản phẩm trao ñổi chất ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [11]. Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – ñột biến, sinh lý dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn ñề sinh học khác…[19]. 1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy 1.2.1.1. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng thực vật Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết ñịnh kết quả nuôi cấy là chất kích thích sinh trưởng. Chất kích thích sinh trưởng thực vật là những chất ở nồng ñộ sinh lý có tác dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của mô. Tuy vậy, yêu cầu ñối với những chất này thay ñổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. * Auxin Môi trường nuôi cấy ñược bổ sung các auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA, 2,4-D, NOA. Trong ñó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do ñặc ñiểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin oxydase) không có tác dụng [10]. Năm 1934, Kogl ñã tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt tính tương tự chất sinh trưởng và năm 1935 Thiman cũng tách ñược chất này từ nấm rhyzopus. Sau ñó người ta chiết tách ñược auxin từ các loại thực vật khác nhau (Hagen Sminth, 1941,1942, 1946 ) và ñã xác ñịnh bản chất hóa học của nó là 1H- indole-3-acetic acid (IAA). Người ta ñã khẳng ñịnh rằng IAA là 8 dạng auxin chủ yếu, quan trọng nhất của tất cả các loại thực vật, kể cả thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao [13]. ðặc ñiểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, ñất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn [5], [10]. Auxin là nhóm chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng ñể kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và ñiều hòa sự phát sinh hình thái, ñặc biệt là khi nó ñược phối hợp sử dụng với các cytokinin [5]. ðối với nuôi cấy mô, auxin ñã ñược sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin ñược dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D và 2,4,5-T. Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả ñối với môi trường tạo và phát triển callus. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH loãng. * Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, ñây là những hormone liên quan chủ yếu ñến sự phân chia tế bào, sự thay ñổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin ñược sử dụng thường xuyên nhất là 6- benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl- aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6- (4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng ñược hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa 9 chồi từ callus hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Kinetin ñược phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt ñộ cao hay ñun sôi. Kinetin không tồn tại trong cơ thể sống, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng ñộ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào ở các mô không phân hóa. Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác ñộng của nhiệt ñộ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao ñổi chất. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng ñối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. ðối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), ñể tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn ñến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn ñề quan trọng không kém là nồng ñộ của hai nhóm chất ñiều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng ñộ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng ñộ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 [10], [13]. 1.2.1.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính Bổ sung than hoạt tính (AC) vào môi trường nuôi cấy ñã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà chua. Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, ñậu tương và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung AC ñược rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng ñộ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy. AC cũng giúp làm giảm ñộc tố bằng cách ñào thải các hợp chất ñộc (ví dụ: phenol) ñược tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì. 10 Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất ñiều hòa sinh trưởng có trong môi trường. NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol ñộc tiết ra trong thời gian nuôi cấy [12]. 1.2. VÀI NÉT VỀ SA NHÂN TÍM 1.2.1. ðặc ñiểm thực vật Sa nhân tím hay sa nhân (Amomum Longgiligulare T. L.Wu) còn có tên ñịa phương là : Mắc néng, Mè tré bà, Dương xuân sa, Mắc nẻng, Sa ngần, Pa ñooc, La vê… 1.2.1.1. Hình thái Sa nhân, cây thân thảo cao 1,5 - 2,5m. Thân trên mặt ñất (thân kí sinh) hình trụ, ñường kính 0,7 – 1,0 cm, nhẵn. Sa nhân sinh sản bằng thân ngầm bò ngang dưới mặt ñất, mang vẩy và rễ phụ. Từ thân ngầm mọc lên các thân kí sinh, quả mọc từ gốc cây mẹ. Thân ngầm mọc bò ngang trên mặt ñất, gồm nhiều ñốt, ñường kính 0,6 - 0,8 cm, bao bọc bởi các lá vảy màu nâu. Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, mọc xiên hướng lên phía trên. Lá gần như không có cuống, mọc so le, xếp thành hai dãy. Phiến lá hình elip dài 20 – 40 cm, rộng 5 - 8 cm, gốc lá hình nêm, mặt trên màu lục ñậm, mặt dưới nhạt hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 – 10 cm hoặc hơn. Lưỡi bẹ nhỏ, hình mác nhọn dài 1,5 – 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám trắng, mỏng. Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 – 6 cm, gồm nhiều ñốt, có vảy màu nâu. Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng; cuống hoa rất ngắn. Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm, rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài 1,5cm, ñầu chia thành 2 thuỳ nông. ðài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn, màu trắng hồng, ñầu xẻ 3 thuỳ. Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt [...]... NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 ð I TƯ NG NGHIÊN C U ð i tư ng nghiên c u c a chúng tôi ñây là sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thu c: Ngành: Magnoliophyta L p: Monocotyledonae B : Zingiberales H : Zingiberaceae Chi: Amomum Loài: Longiligulare V t li u nghiên c u là ño n thân mang ch i ng c a cây sa nhân tím và h t sa nhân tím ngoài t nhiên [6] 2.2 TH I GIAN VÀ ð A ðI M NGHIÊN C U Các thí... t cho sa nhân tím sinh trư ng phát tri n m nh Trong trư ng h p có nh ng ñám sa nhân tím m c dày ñ c, không có cây che bóng tr c ti p mà v n sinh trư ng phát tri n t t là do xung quanh ñó ( ñư ng biên) có nh ng cây g hay cây b i V n ñ quan tr ng nh t ñây chính là môi trư ng ñ t còn ñ th y sa nhân tím xu t hi n m Vì th chưa bao gi nh ng nơi ñ t khô c n * Nhu c u v dinh dư ng khoáng: Cây sa nhân tím m... Cây sinh trư ng phát tri n g n như quanh năm, nhưng m nh nh t vào mùa mưa m Sa nhân tím ra hoa qu ñ u hàng năm Tái sinh t nhiên ch y u b ng h t và b ng cách m c ch i t thân r Sa nhân tím là cây có biên ñ sinh thái r ng, d tr ng và có th tr ng ñư c nhi u vùng sinh thái khác nhau, t vùng núi th p ñ n trung du và c ñ ng b ng * ði u ki n sinh thái - Khí h u: Nhìn chung các loài sa nhân (trong ñó có sa nhân. .. thích sinh trư ng K t qu nghiên c u nh hư ng c a BAP lên kh năng phân hóa ch i cho th y ch i t o r ngay trên môi trư ng này ði u này tư ng t k t qu c a S K Shukla khi nghiên c u s tái sinh in vitro c a cây Curcuma angustifolia Roxb [28] 31 3.1.3 nh hư ng c a Kin lên kh năng tái sinh ch i t ñ nh sinh trư ng Cytokinin, ñ c bi t là kinetin, có nh hư ng rõ r t ñ n quá trình t ng h p acid nucleic do kinetin... 1.2.2.2 Sinh lý * Nhu c u nư c và ñ m: Nư c và ñ m không khí là m t nhân t sinh thái quan tr ng ñ i v i quá trình sinh trư ng phát tri n c a cây sa nhân tím Nh có nư c, r sa nhân tím m i h p th ñư c các ch t h u cơ và ch t khoáng hoà tan trong nư c ñ th c hi n quá trình ñ ng hoá Trong nh ng tháng mùa khô các t nh phía Nam, cây sa nhân m c t nhiên r ng v n th c hi n thoát hơi nư c ñ mát lá và sinh trư... c chuy n ra ngoài [30] Ping-Lung Huang and Chi-Chu Tsai ñã nghiên c u năm 2004 nhân gi ng in vitro cây Zingiber spectabile, m t loài có giá tr kinh t , trang trí làm ñ p M c ñích c a th nghi m này không ch nhân gi ng in vitro cây Zingiber spectabile, d ki n s ñư c s d ng làm các v t li u c a cây chuy n gen K t qu cho th y khi b sung 0,05 ~ 0,1 mg/l ABA thúc ñ y bình thư ng sinh cơ quan và tăng trư... khác nhau có s d ng sa nhân Ngoài ra, h t sa nhân còn ñư c dùng làm gia v Tinh d u sa nhân dùng trong k ngh m ph m [3], [4] 1.3 NHÂN GI NG IN VITRO M T S CÂY H G NG 1.3.1 Chi Amomum Chi Amomum là m t chi có s lư ng loài l n trong h G ng Chi này có r t nhi u loài có giá tr kinh t cao, cũng như giá tr ch a b nh Vì v y, ñây là ñ i tư ng ñư c nhi u nhà khoa h c quan tâm K thu t vi nhân gi ng có th ñư... th i kinetin còn có tác d ng kích thích ho t tính các enzyme tham gia t ng h p acid nucleic [12] M u ñ nh sinh trư ng ñư c c y lên môi trư ng cơ b n MS b sung kinetin n ng ñ t 0,0 - 2,0 mg/l và 1,0 g/l than ho t tính ñ thăm dò kh năng tái sinh ch i K t qu thu sau 2 tu n quan sát ñư c trình bày b ng 3.5 và bi u ñ 3 B ng 3.5 nh hư ng c a Kin lên kh năng tái sinh ch i t ñ nh sinh trư ng N ng ñ kinetin (mg/l)... ng b sung t h p BAP và Kin, ch i t o thành có ñư ng S ch i/m u kính, màu s c gi ng trư ng h p b sung riêng l BAP hay Kin N ng ñ BAP và Kin (mg/l) Bi u ñ 4 nh hư ng c a t h p BAP và Kin lên kh năng tái sinh ch i t ñ nh sinh trư ng 3.1.5 nh hư ng c a t hơp Kin và NAA lên kh năng tái sinh ch i t ñ nh sinh trư ng M u ñ nh sinh trư ng ñư c c y lên môi trư ng cơ b n MS b sung kinetin n ng ñ t 0,0 - 2,0 mg/l,... Ch i 20 in vitro ñư c chuy n lên môi trư ng MS có b sung 3,0 mg/l BAP và 25 mg/l adenine sulfate ñ nhân ch i Kho ng 6,9 ± 0,69 vi ch i/m u ñư c t o ra trong 6 tu n Ch i t o r ngay trên môi trư ng nhân ch i Cây in vitro hoàn ch nh có r ñư c chuy n ra ch u cho th y 83% s ng sót trong ñi u ki n bình thư ng [28] 1.3.4 Chi Zingiber Azra Sultana và cs (2009) ñã nghiên c u s c m ng c a lá và r in vitro c . m t diện t ch trồng cũng như chi phí l u trữ giống. Xu t ph t từ những cơ sở trên, chúng t i tiến hàh dề t i : " Bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân t m (Amomum longiligulare. ñược m t số l ợng l n cây trồng ñồng nh t trong m t thời gian ngắn, duy trì các t nh trạng t t từ thế hệ này sang thế hệ khác. Thực ch t, nuôi cấy mô t bào thực v t l m t bước tiến bộ vư t bậc. có l l thích hợp nh t cho sa nhân t m sinh trưởng ph t triển mạnh. Trong trường hợp có những ñám sa nhân t m mọc dày ñặc, không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trưởng ph t triển t t l