Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải MỞ ĐẦU Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh. Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và vitamin tan trong nước. Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng nhưng chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người. Vitamin thúc đẩy quá trình trao đổi chất và là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo của nhiều loại enzyme. Do đó vitamin đóng vai trò như những chất xúc tác.Trong các loại vitamin thì vitamin B 2 (Riboflavin) giữ vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể. Vitamin B 2 có nhiều trong các sản phẩm từ sữa, men bia, thịt, gan, trứng, rau xanh và các sản phẩm từ cá. Các phương pháp định lượng vitamin B 2 hầu hết chỉ tiến hành bằng phương pháp hóa học, vì phương pháp sinh học phụ thuộc một cách đáng kể vào tính chất của động vật và tương đối ít chính xác. Trong các phương pháp lý học có thể dùng chủ yếu là phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tử ngoại và phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B 2 . Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự phân công của giáo viên hướng dẫn, em đã tiến hành tìm hiểu “ Phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang”. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 1 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải Phần I Tổng quan 1.1. Giới thiệu chung về vitamin 1.1.1. Định nghiã Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với số lượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể người cũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyển hóa khác nhau. 1.1.2. Phân loại Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm: - Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C - Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitaminK 1.1.3. Vai trò của vitamin Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơ thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin. Các động vật cũng như con người không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồng hóa. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn. Do vậy, cơ thể có thể thừa hay thiếu vitamin. Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì sẽ mắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh… SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 2 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải Ngược lại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào thải ra ngoài. 1. 2. Vài nét về vitamin B 2 1.2.1. Lịch sử Vitamin B2 được khám phá vào năm 1920 và lần đầu tiên vitamin B2 được tách từ trứng vào năm 1933. Lúc đầu, nó có tên là ovoflavin, sau đó được các nhà khoa học Booher, Elliger, Koschara tách được viboflavin từ casein. Vì vậy nó mang tên là lactoflavin. Tới năm 1935 Karrer và các cộng tác viên đã tổng hợp được hàng loạt các dẫn xuất có cấu tạo 6,7 dimetyl-9- isoaloxazin tương ứng đúng với lactoflavin tách được từ các nguyên liệu thiên nhiên. 1.2.2. Cấu tạo và tính chất 1.2.2.1. Cấu tạo Trong cấu tạo của vitamin B2, có 2 phần tách biệt : một hợp chất đường Ribose và một công thức 3 vòng nhân. Công thức thô của riboflavin : C 17 H 20 N 4 O 6 Tên khoa học là : 6,7 di metyl-9-isoaloxazin SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 3 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.2.2.2. Tính chất - Phân tử khối : 367,4 - Nhiệt độ nóng chảy : 274-282 o C - Độ hòa tan : Trong nước ở 25 o C : 0,012g trong 100ml. Trong cồn etylic tuyệt đối : 0,045g trong 100ml. Không tan trong ete, benzen, hexan. - Vitamin B 2 tồn tại dạng tinh thể hình kim, màu vàng da cam, có huỳnh quang màu vàng xanh khi chiếu tia tử ngoại vào. - Tinh thể khô, có vị đắng, bền với nhiệt và dung dịch axit. - Vitamin B 2 rất quan trọng đối với cơ thể , trong cơ thể vitamin B 2 dễ bị phosphoryl hóa tạo nên nhóm hoạt động của các enzym xúc tác cho các quá trình oxi hóa - khử. - Vitamin B 2 không bền với ánh sáng. Khi tiếp xúc với ánh sáng làm mất hoạt tính, nên bảo quản vitamin B 2 hạn chế tiếp xúc ánh sáng, dùng lọ màu nâu để bảo quản. - Riboflavin tương đối bền trong môi trường axit, nhưng lại dễ bị phá hủy nhanh trong môi trường kiềm, thuốc thử KMnO 4 . - Các chất khử như H hoạt tính, NaHSO 4 , TiCl khử nó một cách thuận nghịch thành hợp chất leuco. - Môi trường kiềm phần lớn tạo ra lumiflavin, môi trường axit tạo ra lumicrom. - Vitamin B 2 được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 4 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.2.3. Vai trò của vitamin B 2 đối với sức khoẻ con người - Vitamin B2 tham gia vào cấu trúc của enzym dehydrogenase hiếu khí (men vàng) ở dạng flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenozindinucleotid ( FAD). Hai dẫn xuất này chính là xúc tác cho phản ứng chuyển vị hydro trong quá trình hô hấp của tế bào. Vì vậy thiếu vitamin B2 thì khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào biểu bì ruột bị rối loạn dẫn đến chảy máu đường ruột. Các quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể xấu đi và xuất hiện các triệu chứng rối loạn dẫn đến tình trạng nở miệng, long móng, thiếu máu, rụng tóc. - Vitamin B2 cần thiết để nâng cao sức đề kháng cơ thể sống đối với bệnh nhiễm trùng, để làm tăng tốc độ tái tạo máu cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của bào thai. - Ngoài ra, cùng với vitamin PP, vitamin A, vitamin B2 tham gia quá trình cảm nhận ánh sáng của mắt. 1.2.4. Nhu cầu Nhu cầu vitamin B 2 phụ thuộc vào điều kiện nghề nghiệp, vào trạng thái sinh lý của cơ thể, vào lứa tuổi. Trung bình người lớn cần 1,8- 2,0mg/24h ; trẻ em cần 0,5-1,5mg/24h ; phụ nữ mang thai cần : 2,0- 4,0mg/24h. . Người và động vật không có sừng không tổng hợp được B 2 mà phải nhận từ nguồn thức ăn. Động vật có sừng có thể tự tổng hợp được vitamin B2 ở ruột của chúng nhờ các vi sinh vật và cung cấp cho động vật chủ. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 5 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.2.5. Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B 2 Vitamin B2 có nhiều trong các sản phẩm từ sữa, rau cải , nấm men, bánh mì, men bia, thịt, gan, trứng và các sản phẩm từ cá. Trong rau xanh cũng có nhiều vitamin B2, nó được tổng hợp từ các tế bào thực vật và vi sinh vật. Bảng 1.2.1: Nguồn vitamin B2 trong thực phẩm Thực phẩm Hàm lượng (mg/100g) Gan 1,5 – 13 Trứng 0,34 – 0,6 Nấm 0,26 – 0,44 Sữa chua 0,13 – 0,27 Thịt 0,05 – 0,47 Bánh mì 0,06 – 0,16 1.3. Các phương pháp xác định riboflavin Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B 1 là một lĩnh vực rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu về phương pháp xác định hàm lượng vitamin B 1 . Dưới đây là một số phương pháp đã được ứng dụng rộng rãi. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 6 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 7 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.3.3.Phương pháp cực phổ Phương pháp cực phổ được dùng có hiệu quả để định lượng riboflavin trong dược phẩm. R.Brdicka và E.Kno-bloch là người đầu tiên đã nghiên cứu phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2 và nghiên cứu sự phụ thuộc của vitamin B2 vào pH. Sóng cực phổ của riboflavin có tính khuếch tán, chiều cao của sóng phụ thuộc theo đường thẳng vào nồng độ, vì thế sóng này rất phù hợp để định lượng. Để định lượng riboflavin, trước tiên ta lập đường chuẩn của mẫu chuẩn với các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5mg trong 10ml dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH =6,8. Sau đó ta hút các thể tích tương ứng 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 ml dung dịch riboflavin chuẩn và đổ đầy dung dịch đệm phosphate đến thể tích 10ml. Ta tiến hành đo cực phổ và ghi đường chuẩn. Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 2ml mẫu thử và 8ml dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH = 6,8 vào bình định mức 10ml. Ta sục dung dịch bằng khí Nito khoảng 15 phút và ghi đường cong trong cùng điều kiện với dung dich mẫu chuẩn, dùng acquy 2V. Ta được hình cực phổ và xác định riboflavin theo đường chuẩn. Phương pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lượng riboflavin trong các chế phẩm dược và có thể định lượng thẳng hỗn hợp vitamin nhóm B. Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp để định lượng riboflavin trong các nguyên liệu sinh vật học vì riboflavin tồn tại trong các nguyên liệu sinh vật học dạng kết hợp nên phương pháp cực phổ không xác định được. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 8 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.3.4.Phương pháp huỳnh quang Đo huỳnh quang màu xanh của riboflavin được coi như một phương pháp cơ bản hay dùng nhất để định lượng chất này trong các nguyên liệu thiên nhiên. Nồng độ của huỳnh quang phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ cực đại nằm ở vùng pH = 6-7. Huỳnh quang giảm mạnh nhất ở pH dưới 3,8 và pH trên 7,7. Độ chính xác của phương pháp đo huỳnh quang dựa trên cơ sở điều kiện triết và loại trừ các huỳnh quang phụ có ảnh hưởng khi đo. Cách tiến hành định lượng sau khi chuẩn bị mẫu thử, dụng cụ và các thuốc thử hóa học : Nhỏ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 10ml dung dịch chiết của mẫu thử, cho vào trong hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch mẫu chuẩn riboflavin và hai ống kia mỗi ống 1ml nước. Trong mỗi một ống nghiệm lại cho thêm 1ml axit axetic kết tinh, lắc đều và cho thêm 0,5ml dung dịch Kali pemanganat và để yên trong 2 phút. Sau đó cho thêm vào cả 4 ống nghiệm mỗi ống 0,5ml dung dịch nước oxy già và lắc đều. Màu của kali pemanganat mất trong 5 giây. Cho tiếp vài giọt cồn caprylic hoặc axeton. Điều chỉnh máy so màu huỳnh quang ở độ nhạy thích hợp. Sau đó tiến hành tính cả mẫu thử có cho thêm mẫu chuẩn và mẫu thử chính không cho thêm mẫu chuẩn. Tính trung bình cả hai lần đo. Định lượng mẫu trắng sau khi cho 20mg natri hidro sunfit vào từng ống nghiệm.Từ đó tính ra nồng độ của riboflavin trong mẫu thử. Phương pháp huỳnh quang có nhược điểm là sự phân tích bằng ánh sang không xảy ra hoàn toàn được và các sản phẩm phân tích lumicrom và lumiflavin sẽ bị phân hủy tiếp khi tiếp xúc với ánh sáng. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 9 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải 1.3.5.Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Kuhn và đồng nghiệp là người đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ của riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nước riboflavin bốn cực đại hấp thụ ở các bước sóng 223nm ; 375nm ; 267nm ; 444nm. C.Daglish, M.Baxter xác định rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc đáng kể vào pH. Và khi xác định về định lượng cần phải đo quang phổ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm như nhau. Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 10mg riboflavin, thêm hỗn hợp gồm 5ml axit axetic kết tinh và 100ml nước. Đun cách thủy 1 giờ, lắc liên tục. Thêm 500ml nước, để nguội, thêm 30ml dung dịch natri hidroxyd 1N và lắc liên tục, pha loãng với nước thành 1000,0ml, lắc đều. Lọc loại bỏ dung dịch đầu. Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở bước song 444nm, trong cốc dày 1cm, so với mẫu trắng là nước. Tình hàm lượng riboflavin trong mẫu theo giá trị A(1%,1cm) ở 444nm là 328. Phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại được dùng như một phương pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu riboflavin và dược phẩm. Theo sự phân công của giáo viên hướng dẫn, em xin trình bày về phương pháp định lượn vitamin B2 bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử. SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3 10 [...]... chuẩn và xác định hàm lượng vitamin B2  Tìm hiểu thêm về các phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2  Tổng quan về vitamin B2 và cách hiệu chỉnh máy quang phổ Để phát triển đề tài thì cần phải : Nghiên cứu khảo sát thêm các phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 trong thực phẩm và sinh học : Và nghiên cứu sâu hơn để xây dựng các phương pháp xác định hàm lượng vitamin nhóm B khác như vitamin B1,B6,... một mẫu thêm chuẩn để xác định độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trên từng đối tượng mẫu Phần mẫu lưu cho vào trong túi đựng mẫu và bảo quản trong tủ mẫu 3.3.Ứng dụng của phương pháp phân tích Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS được coi là một phương pháp thử đặc hiệu để xác định vitamin B2 trong dược phẩm Quy trình phân tích vitamin B2 bằng phương pháp trắc quang như trên được áp... Minh Tân 33 Lớp ĐH Hóa 3_k3 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải KẾT LUẬN Sau thời gian tìm hiểu đề tài: “ Xác định hàm lượng vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang thì em đã thu được một số kết quả như sau :  Xây dựng được quy trình định lượng vitamin B2 bằng phương pháp trắc quang : + Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại + Khảo sát khoảng thời gian tối ưu + Khảo sát khoảng pH tối ưu... trung ương… Ngoài ra, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS còn có thể xác định hàm lượng vitamin B2 trong nước tiểu, sữa mẹ, huyết SVTH : Vi Thị Minh Tân 32 Lớp ĐH Hóa 3_k3 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải tương trong máu, các mô, cây xanh và trong thực phẩm : trứng khô, lúa mì, sữa bột… SVTH : Vi Thị Minh Tân 33 Lớp ĐH Hóa 3_k3 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải KẾT LUẬN... trình với các điều kiện tối ưu đã xác định ở trên Chuẩn bị các mẫu có nồng độ tăng dần ( bắt đầu từ giới hạn phát hiện của phép phân tích) Tiến hành đo mật độ quang của dung dich hấp thụ, ta xác định được khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B2 3.2.1.7.Xây dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng Vitamin B2 Sau khi đã khảo sát tìm được khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B2 ta tiến hành lập đường chuẩn... có đặc tính quang học như nhau + Cuvet thạch anh : dùng đo vùng tử ngoại và khả kiến SVTH : Vi Thị Minh Tân 23 Lớp ĐH Hóa 3_k3 Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải + Cuvet thủy tinh : chỉ đo ở vùng khả kiến Hiệu chỉnh máy quang phổ Trong định tính và định lượng các chất bằng phương pháp quang phổ UV-VIS, việc chuẩn hóa máy đóng vai trò quan trọng, đặc biệt là trong kỹ thuật định lượng bằng đo phổ...Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải Phần II Phân tích Vitamin B2 bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 2.1.Cơ sở lý thuyết của phương pháp 2.1.1Nguyên tắc Muốn xác định một cấu tử X nào đó, người ta chuyển nó thành những chất mà có khả năng hấp thụ ánh sáng, sau đó đo sự hấp thụ ánh sáng của nó Từ đó suy ra hàm lượng của chất cần phân tích Phản ứng thực hiện trong phép so màu có phản ứng trực... cơ, điện, quang thành những tín hiệu, thường là tín hiệu điện Trong máy UV-VIS thì đêtectơ là các tế bào quang điện với hiệu ứng quang điện ngoài hay các nhân quang điện - Bộ phận chỉ thị kết quả :là một máy tính hoặc bộ phjận giống máy tính có chức năng thu nhân và hiển thị kết quả phân tích(các dãy phổ phân tích) 2.4.Các phương pháp định lượng trong quang phổ hấp thụ phân tử 2.4.1 .Phương pháp tỉ lệ... cho máy quang phổ UV-VIS Ta sử dụng nước cất 2 lần  Chuẩn vitamin B2 tinh khiết ( 99,6% ) của Viện Kiểm nghiệm thuốc quốc gia  Dung dịch axit acetic 2,5%: hút 12,5ml acid acetic 100% cho vào bình định mức 500ml và định mức tới vạch bằng nước cất  Dung dịch chuẩn vitamin B2: Hòa tan 25mg chuẩn vitamin B2 ở 50oC trong 50ml nước cất và 1ml axit acetic 2,5%, cho thêm 500ml nước cất, lắc đều và định mức... này càng gần nhau kết quả càng chính xác Ưu điểm: Độ chính xác tương đối cao Nhược điểm: - Không thể xác định được hàng loạt mẫu - Sai số do mắt quan sát - Mắc sai số do thành phần hóa học chất phân tích có thể lẫn các tạp chất hóa học khác 2.4.2 .Phương pháp thêm chuẩn so sánh Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai số cho quá trình định lượng : Xử lý mẫu ( chiết xuất), sai . vitamin, người ta chia thành 2 nhóm: - Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C - Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitaminK 1.1.3. Vai trò của vitamin. thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào thải ra ngoài. 1. 2. Vài nét về vitamin B 2 1.2.1. Lịch sử Vitamin B2 được khám phá vào năm 1920 và lần đầu tiên vitamin B2 được. cung cấp vitamin B 2 Vitamin B2 có nhiều trong các sản phẩm từ sữa, rau cải , nấm men, bánh mì, men bia, thịt, gan, trứng và các sản phẩm từ cá. Trong rau xanh cũng có nhiều vitamin B2, nó