Đang tải... (xem toàn văn)
Các hệ thống tái sinh in vitro cung cấp một công cụ mạnh mẽ để thao tác tạo thể đa bội nhằm tạo điều kiện cho việc nhân giống và phát triển cây trồng mới. Cảm ứng đa bội có thể mở rộng cơ hội nhân giống, hỗ trợ sự phát triển của các giống cây tam bội không hạt, nâng cao đặc điểm cảnh quan cho cây trồng và tăng khả năng chống chịu với môi trường, tăng sinh khối và phục hồi khả năng sinh sản ở các giống lai rộng. Thao tác tạo thể đa bội in vitro thường được cảm ứng bằng cách sử dụng các chất kháng phân bào như colchicine, oryzalin và trifluralin, trong khi còn nhiều chất kháng phân bào khác chưa được khám phá. Sự cảm ứng thành công đòi hỏi sự kết hợp đồng bộ của sự xâm nhập hiệu quả của chất kháng phân bào và có thể phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc và nồng độ của chất kháng phân bào, loại mô, và tương tác với môi trường cơ bản và chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Các điều kiện in vitro khác nhau giữa các đơn vị phân loại và các chi, loài và giống riêng, thường đòi hỏi các biện pháp xử lý chuyên biệt để tối đa hóa cảm ứng đa bội. Ở một số đơn vị phân loại, sự cảm ứng đa bội ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và hình thành rễ in vitro. Sau đây, chúng tôi cung cấp một cái nhìn tổng quan về các chất ức chế phân bào và ứng dụng của chúng trong thao tác tạo thể đa bội in vitro để nhân giống cây trồng và cải thiện cây trồng.
THAO TÁC TẠO THỂ ĐA BỘI IN VITRO ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG Các hệ thống tái sinh in vitro cung cấp công cụ mạnh mẽ để thao tác tạo thể đa bội nhằm tạo điều kiện cho việc nhân giống phát triển trồng Cảm ứng đa bội mở rộng hội nhân giống, hỗ trợ phát triển giống tam bội không hạt, nâng cao đặc điểm cảnh quan cho trồng tăng khả chống chịu với môi trường, tăng sinh khối phục hồi khả sinh sản giống lai rộng Thao tác tạo thể đa bội in vitro thường cảm ứng cách sử dụng chất kháng phân bào colchicine, oryzalin trifluralin, nhiều chất kháng phân bào khác chưa khám phá Sự cảm ứng thành cơng địi hỏi kết hợp đồng xâm nhập hiệu chất kháng phân bào phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc nồng độ chất kháng phân bào, loại mô, tương tác với môi trường chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các điều kiện in vitro khác đơn vị phân loại chi, lồi giống riêng, thường địi hỏi biện pháp xử lý chuyên biệt để tối đa hóa cảm ứng đa bội Ở số đơn vị phân loại, cảm ứng đa bội ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển hình thành rễ in vitro Sau đây, chúng tơi cung cấp nhìn tổng quan chất ức chế phân bào ứng dụng chúng thao tác tạo thể đa bội in vitro để nhân giống trồng cải thiện trồng GIỚI THIỆU Đa bội, trạng thái có nhiều hai nhiễm sắc thể, từ lâu cơng nhận động lực q trình tiến hóa hình thành thực vật (Soltis cộng sự, 2009) Các thể đa bội tự nhiên xác định loạt đơn vị phân loại ước tính gần cho thấy hầu hết tất thực vật hạt kín trải qua kiện đa bội lịch sử tiến hóa chúng (Soltis Burleigh, 2009) Các lợi tiến hóa/ thích nghi tiềm thể đa bội bao gồm tăng ưu lai, dư thừa gen độ bền đột biến, tính dẻo kiểu hình (Comai, 2005; Sattler et al., 2015) Sự cảm ứng đa bội nhân tạo cung cấp cơng cụ có giá trị để hỗ trợ cho việc tìm hiểu q trình tiến hóa tạo điều kiện cho chương trình cải tiến nhân giống trồng Các thể đa bội thường sở hữu đặc điểm ưu dày hơn, màu sẫm hơn; hoa to hơn, lâu tàn cánh hoa dày hơn; sức sống mạnh hơn; khả chống chịu với áp lực môi trường, sâu bệnh mầm bệnh cao hơn; tăng sản xuất chất chuyển hóa phục hồi khả sinh sản lai rộng vô sinh (Kehr, 1996; Comai, 2005; Ranney, 2006; Banyai et al, 2009) Tuy nhiên, việc đưa thể đa bội vào chương trình nhân giống trồng thường địi hỏi phải tạo thể đa bội Nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro chủ yếu cảm ứng cách sử dụng colchicine, tác nhân kháng phân bào Tuy nhiên, thuốc diệt cỏ oryzalin trifluralin, thường ưa chuộng độc tính thấp hơn, lực cao với tubulin thực vật đạt hiệu nồng độ thấp Sự thành công quy trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro phụ thuộc vào hiệu chất kháng phân bào để tạm thời ngăn chặn phân chia tế bào (cytokinesis) mơ phát triển tích cực Trong thời gian tiếp xúc nồng độ chất kháng phân bào quan trọng cho việc nhân đôi nhiễm sắc thể, số yếu tố khác loại mô, phương pháp áp dụng, điều kiện ni cấy khác biệt lồi ảnh hưởng đến hiệu việc nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro Các quy trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro chuyên biệt loài riêng cho đơn vị phân loại đa dạng có giá trị báo cáo rộng rãi (Bảng 1) Trong tổng quan này, khám phá chất ức chế phân bào xem xét yếu tố ảnh hưởng đến thao tác tạo đa bội in vitro cung cấp lĩnh vực cho nghiên cứu xa LỊCH SỬ Cảm ứng đa bội nhân tạo thực vật lần báo cáo vào cuối năm 1930 với Blakeslee Avery (1937) chứng minh việc sử dụng colchicine để nhân đôi nhiễm sắc thể số loài Nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng colchicine đến thao tác tạo thể đa bội sau báo cáo (xem Dunham Banta, 1940) Mối quan tâm đến thể đa bội tăng lên nhanh chóng, vào năm 1941, The American Naturalist xuất “Hội nghị chuyên đề khía cạnh lý thuyết thực tiễn thể đa bội trồng” (The American Naturalist, 1941) Trong tập xuất đó, Emsweller Ruttle (1941) lần thảo luận giá trị thể đa bội cảm ứng việc cải tạo cảnh Kể từ nghiên cứu ban đầu này, nhân đôi nhiễm sắc thể trở thành phần khơng thể thiếu chương trình nhân giống cho nhiều loại trồng quan trọng kinh tế Những tiến nuôi cấy mô thực vật vào năm 1960 tạo hội để phát triển thể đa bội Murashige Nakano (1966) phân lập tế bào tứ bội từ rễ thuốc lưỡng bội sử dụng nuôi cấy in vitro để ổn định tạo tứ bội Ngay sau đó, Heinz Mee (1970) báo cáo việc sử dụng colchicine để tạo huyền phù tế bào mía đa bội Hussey Hypher (1978) phục hồi củ cải đường tứ bội cách xử lý in vitro với colchicine Hai thập kỷ qua chứng kiến gia tăng đáng kể việc ứng dụng cảm ứng tạo thể đa bội in vitro Sự gia tăng phần phát triển gia tăng quy trình ni cấy mơ cho loạt đơn vị phân loại khác CÁC TÁC NHÂN CHỐNG PHÂN BÀO Thao tác tạo đa bội in vitro phụ thuộc vào việc phá vỡ chu kỳ tế bào để ngăn chặn di chuyển cực nhiễm sắc thể anaphase Các hóa chất khác nhau, từ caffein (Thomas cộng sự, 1997) oxit nitơ (Taylor cộng sự, 1976) đến thuốc diệt cỏ kháng vi ống chứng minh cảm ứng đa bội Tuy nhiên, số hợp chất kháng vi ống, chẳng hạn colchicine oryzalin, ưu tiên sử dụng in vitro để cảm ứng đa bội thành công (Bảng 2) Colchicine [N-5,6,7,9-tetrahydro-1,2,3,10-tetra-methoxy-9-oxobenzo (a) heptalen-7-yl] acetamide có lẽ chất ức chế phân bào sử dụng phổ biến sử dụng để phục hồi đa bội nhiều loài (Bảng 1) Colchicine chiết xuất từ củ crocus mùa thu (Colchicum autumnale) sử dụng rộng rãi loại thuốc điều trị bệnh gút bệnh viêm nhiễm khác Là chất kháng phân bào, colchicine phá vỡ chu kỳ tế bào, metaphase, nơi làm ổn định vi ống cách liên kết với tiểu đơn vị ꞵ-tubulin để tạo thành phức hợp colchicine-tubulin Do đó, colchicine ngăn chặn q trình trùng hợp (polymerization) vi ống, mà khơng ảnh hưởng đến q trình khử trùng hợp, dẫn đến phân hủy vi ống (Leung et al, 2015) Trong nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro, colchicine có ưu điểm hịa tan dung dịch nước, bền nhiệt, hấp khử trùng dễ dàng áp dụng cho mô thực vật Tuy nhiên, colchicine có lực liên kết cao với vi ống động vật có khả gây độc cho người (Morejohn cộng sự, 1984) Ngược lại, colchicine có lực liên kết tương đối thấp với vi ống thực vật, địi hỏi phải sử dụng nồng độ cao để trì hiệu Nói chung, số loại thuốc diệt cỏ cung cấp giải pháp thay khả thi cho colchicine việc thao tác tạo đa bội in vitro Người ta ước tính khoảng 25% chất diệt cỏ hoạt động cách ảnh hưởng đến trình nguyên phân (Vaughn Lehnen, 1991) Thuốc diệt cỏ bao gồm số nhóm hóa học khác có hoạt tính kháng phân bào, bao gồm dinitroanilines (oryzalin, trifluralin, lactilin) (Morejohn cộng sự, 1987; Hugdahl Morejohn, 1993), phosphorothioamidates (amipro-phos-methyl) (Murthy cộng sự, 1994 ), benzamit (propyzamit) (Bartels Hilton, 1973), xyanoacrylat (etyl (2Z) -3amino-2-xyano-4-etylhex-2-enoat) (Tresch cộng sự, 2005), cacbonat (chlorpropham , propham) Dinitroanilines loại thuốc diệt cỏ phổ biến sử dụng thao tác tạo đa bội in vitro Dinitroaniline cho thấy có lực liên kết cao với tubulin thực vật nồng độ thấp có lực liên kết với tubulin động vật (Morejohn cộng sự, 1987; Hugdahl Morejohn, 1993) Nhóm hợp chất hoạt động tương tự colchicine để phá vỡ trình nguyên phân metaphase Dinitroaniline liên kết với α-tubulin để tạo thành phức hợp tubulindinitroaniline để ngăn chặn trình trùng hợp vi ống Các dinitroaniline chứa nhiều hợp chất chia thành hợp chất đối xứng (ví dụ, oryzalin, trifluralin) khơng đối xứng (ví dụ, lacmethalin) tương tác khác biệt với α-tubulin (xem Ma cộng sự, 2010) Trong nghiên cứu toàn diện đánh giá tác động 12 loại dinitroaniline khác lên ký sinh trùng đơn bào, Toxoplasma gondii, biểu kiểu hoang dã nhạy cảm với oryzalin đột biến α-tubulin gây kháng oryzalin, Ma cộng (2010) phát hợp chất không đối xứng dinitramine pendimethalin chứng tỏ ức chế tăng lên Tương tự, số chất tương tự trifluralin cho thấy hiệu liên kết tăng lên với α-tubulin sinh vật đơn bào Trypanosoma brucei (Giles et al., 2009) Những nghiên cứu cho thấy khác biệt nhỏ khơng đặc hiệu đặc tính vị trí liên kết α-tubulin ảnh hưởng đến tương tác với nhóm chức dinitroaniline khác Đối với loài thực vật, nghiên cứu đột biến vị trí liên kết α-tubulin làm thay đổi lực liên kết tạo khả kháng dinitroanilines, đặc biệt oryzalin trifluralin (Anthony Hussey, 1999; Chu cộng sự, 2018) Điều có ý nghĩa thao tác tạo đa bội in vitro, nghiên cứu chủ yếu oryzalin trifluralin (Bảng 1), có số báo cáo hạn chế dinitroaniline thay pendamethalin (Ren et al., 2018), dinitramine (Nasr et al , 2004), ethylfluralin (Mitrofanova cộng sự, 2003), butralin (Nasret cộng sự, 2004) Với đa dạng cấu trúc dinitroanilines, hợp chất khác mang lại hiệu cao việc phục hồi thể đa bội lồi khó xử lý (recalcitrant species) Các amide phosphoric nhóm thuốc diệt cỏ khác có hoạt tính kháng phân bào, amiprophos-metyl (APM) sử dụng để nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro (Khosravi cộng sự, 2008) Amiprophos-methyl cho thấy có lực cao với α-tubulin thuốc nhắm mục tiêu vào vị trí liên kết tương tự oryzalin (Murthy cộng sự, 1994) Một ưu điểm APM khả hịa tan nước tăng so với dinitroaniline, giảm việc sử dụng thêm dung môi Tương tự, benzamide, đặc biệt propyzamide cho thấy khả nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro (Cai et al., 2016) Propyzamide nhắm mục tiêu vào vị trí liên kết tương tự oryzalin (Bartels Hilton, 1973) Cyanoacrylate nhóm chất chống phân bào khác có chế tương tự dinitroaniline (Tresch cộng sự, 2005) Tương tự APM propyzamide, cyanoacrylat, ethyl (2Z) - 3-amino-2-cyano-4-ethylhex-2enoate (CA1) CA2 liên kết với α-tubulin vị trí tương tự oryzalin (Tresch et al , 2005) Tuy nhiên, chúng chưa sử dụng để cảm ứng tạo đa bội in vitro Nitơ oxide báo cáo cảm ứng tạo đa bội (Taylor cộng sự, 1976) Cơ chế hoạt động chưa rõ Tuy nhiên, Kitamura cộng (2009) cho Nitơ oxide cảm ứng đa bội cách ức chế trùng hợp vi ống Có khả Nitơ oxide tương tác với tyrosine để tạo thành nitrotyrosine (Neill cộng sự, 2003) Nitrotyrosine thay tyrosine α-tubulin ảnh hưởng đến trình trùng hợp (Blume cộng sự, 2013; Lipka Müller, 2014) Lipka Müller (2014) nhận thấy nitrotyrosine Arabidopsis thaliana ức chế trình trùng hợp vi ống, làm giảm độ nhạy cảm với oryzalin thay đổi vị trí liên kết α-tubulin Tuy nhiên, Jovanovic´ cộng (2010) chứng minh nitrotyrosine làm tăng độ nhạy nuôi cấy tế bào Nicotiana tabacum L oryzalin, cho thấy nitrotyrosine cung cấp thêm chất kháng vi ống (antimicrotubule qualities) Trái ngược với chất kháng vi ống (antimicrotubule agents), thuốc diệt cỏ carbamate, chẳng hạn propham chlorpropham, hoạt động để phá vỡ nguyên phân mà khơng ảnh hưởng đến q trình trùng hợp ổn định vi ống Thay vào đó, cacbamat hoạt động để phá vỡ phân mảnh cực tế bào, dẫn đến di chuyển nhiễm sắc thể theo đa cực lưỡng cực (Vaughn Lehnen, 1991) Do đó, khơng cacbamat có hiệu việc phát triển thể đa bội Khơng có báo cáo việc sử dụng chất ức chế proteasome sử dụng cho thao tác tạo thể đa bội in vitro Tuy nhiên, chất ức chế proteasome lactacystin MG132, can thiệp vào protein điều hòa quan trọng chi phối trình chuyển tiếp metaphase, anaphase cytokinesis (Planchais et al., 2000) Một hạn chế chất ức chế proteasome phương pháp xử lý đảo ngược hồn tồn (Planchais et al., 2000) Một nhóm chất ức chế chu kỳ tế bào khác, bao gồm hydroxyurea aphididcolin, hoạt động để bắt giữ chu kỳ tế bào đầu pha S Sau loại bỏ chất ức chế, tế bào tiến triển qua pha S, G2 M cách đồng (Darzynkiewicz cộng sự, 2011) Mặc dù hợp chất không ảnh hưởng trực tiếp đến thể đa bội, chúng sử dụng phương pháp xử lý để tạo điều kiện đồng hóa chu kỳ tế bào tối đa hóa số lượng tế bào bị ảnh hưởng chất kháng vi ống, làm giảm cytochimeras (các tế bào phân bào/ tế bào không đồng nhất???) TỔNG QUAN – CẢM ỨNG TẠO ĐA BỘI IN VITRO Sự thành công cảm ứng tạo đa bội in vitro tích hợp nhiều với việc phát triển quy trình ni cấy in vitro hiệu Các hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường tỏ khó khăn nhiều đơn vị phân loại, đặc biệt thân gỗ có số lồi hạn chế ni cấy mơ thành cơng Việc phát triển quy trình thường cần tiến hành loài thường dịng để tối ưu hóa quy trình tái sinh áp dụng cho cảm ứng tạo đa bội in vitro Tuy nhiên, việc nhân đôi nhiễm sắc thể thành công đạt số lượng đáng kể loài đại diện cho nhiều họ chi (Bảng 1) CÁC YẾU TỐ QUAN TRỌNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN CẢM ỨNG ĐA BỘI IN VITRO Loại mô Thao tác tạo đa bội in vitro phụ thuộc nhiều vào sẵn có hệ thống tái sinh in vitro thành công Mặc dù mô phân sinh đỉnh xử lý in vitro, tái sinh thơng qua hình thành phơi soma hình thành chồi mong muốn phương pháp xử lý cảm ứng đa bội Khả tái sinh toàn từ một vài tế bào cải thiện phát triển đa bội đồng giảm thiểu khả xuất tế bào phân bào (cytochimeras) Các hệ thống tái sinh tạo quan tạo phôi sử dụng để nhân đôi nhiễm sắc thể cho số loài (Bảng 1) Đối với Echinacea purpurea, đa bội tái sinh từ cuống xử lý colchicine (Nilanthi et al., 2009) Tương tự, phát sinh quan từ Populus sp xử lý oryzalin dẫn đến đa bội Sakhanokho cộng (2009) xử lý mô sẹo tạo phôi Hedychium muluense colchicine oryzalin để phát triển thể đa bội đồng Hơn nữa, hệ thống tái sinh ống nghiệm cần thiết để phát triển thể đa bội Hansen Andersen (1998) tái sinh đa bội từ vi bào tử Triticum aestivum xử lý colchicine Trong nghiên cứu khác, Yuan cộng (2015) tái sinh đa bội từ rễ in vitro xử lý colchicine thể đơn bội Brassica sp Tuy nhiên, hệ thống tái sinh in vitro thông qua phát sinh quan phát sinh phôi soma phát triển cho số lồi tương đối cách tiếp cận dẫn đến biến đổi dịng soma lớn đột biến thay đổi biểu sinh (epigenetic changes) (Bairu et al., 2007) Đối với nhiều loại trồng, phát triển hệ thống tái sinh in vitro có thách thức riêng mơ thay cần xem xét Do đó, đoạn nốt đỉnh chồi mơ sử dụng rộng rãi để nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro (Bảng 1) Để thu thể đa bội đồng cách sử dụng đoạn nốt đỉnh chồi, tất tế bào ban đầu ba lớp mô phân sinh cần phải chịu tác động tác nhân kháng phân bào (Dermen, 1953; Klekowski, 2003) Nếu tất tế bào ban đầu không bị ảnh hưởng, thể đa bội hỗn hợp (mixoploids) cytochimeras hình thành Thể đa bội hỗn hợp (Mixoploids) quan sát thấy rộng rãi q trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro loạt loài, bao gồm: Acer platanoides (Lattier cộng sự, 2013), Helleborus sp (Dhooghe cộng sự, 2009b), Hypericum sp (Meyer et al., 2009), Lagerstroemia indica (Zhang et al., 2010), Rhododendron hybrid (Väinölä, 2000; Hebert et al., 2010), Rosa rugosa (Allum et al., 2007), Ranunculus asiaticus (Dhooghe et al., 2009a), Tulipa gesneriana (Chauvin et al., 2005), Vitis sp (Notsuka cộng sự, 2000; xem Bảng 1) Mô đa bội hỗn hợp (Mixoploid tissue) thường không ổn định có xu hướng chọn lọc lưỡng bội cao trở lại trạng thái đa bội ban đầu Chọn lọc lưỡng bội xảy tế bào lưỡng bội (hoặc đa bội thấp) (có DNA hơn) chép phân chia nhanh so với tế bào đa bội cao lân cận (Dermen, 1953; Klekowski, 2003) Theo thời gian, tỷ lệ tế bào đa bội thấp tăng lên dẫn đến tế bào chuyển đổi Ví dụ, Hussey Hypher (1978) ghi nhận củ cải đường cytochimeral (Mô đa bội hỗn hợp) sau xử lý với colchicine quan sát thấy tế bào đa bội biến qua lần nuôi cấy Tương tự, Lattier cộng (2013) phát Acer platanoides, mô đa bội hỗn hợp trở lại thành lưỡng bội khoảng thời gian tháng Một cách tiếp cận khác xử lý hạt chất ức chế kháng phân bào trước thiết lập nuôi cấy in vitro Hannweg cộng (2013) xử lý hạt giống cỏ Crocosmia 0,25 µM colchicine qua đêm 25 µM colchicine ngày trước đưa chúng vào nuôi cấy mô Cảm ứng cao thể tứ bội đồng hợp (29,82%) đạt với xử lý 0,25 µM qua đêm Lựa chọn tiếp xúc với tác nhân kháng phân bào Cảm ứng đa bội khác loài giống trồng phụ thuộc vào tác nhân kháng phân bào, loại mô điều kiện nuôi cấy (Bảng 1) Trong chất diệt cỏ dinitroaniline có lực cao với tubulin thực vật gần đây, ngày sử dụng nhiều để nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro, colchicine tác nhân phân bào có hiệu cao nhiều loài Morejohn cộng (1984) hiệu gắn kết colchicine với tubulin thực vật khác đáng kể loài, colchicine tác nhân kháng phân bào hiệu sử dụng nhiều loài Populus hopeiensis (Wu cộng sự, 2020) Colchicine rõ ràng tác nhân kháng phân bào sử dụng nhiều (Bảng 1), nhược điểm ghi nhận rõ ràng (Dhooghe cộng sự, 2009a), sử dụng cho nhiều loài khác từ thân thảo (ví dụ: Echinacea purpurea; Nilanthi et al ., 2009) đến thân gỗ (ví dụ, Chaenomeles japonica; Stanys cộng sự, 2006) Sự thành công rộng rãi colchicine chất ức chế kháng phân bào dẫn đến việc sử dụng liên tục thường xuyên nghiên cứu gần hơn, ví dụ Bletilla striata (Pan-pan cộng sự, 2018), Petuna axillaris (Regalado cộng sự, 2017) Populus Hopeiensis (Wu cộng sự, 2020) So với colchicine, oryzalin sử dụng thành cơng để tạo dịng đa bội thân gỗ bán thân gỗ bao gồm Rosa (Kermani cộng sự, 2003), Rhododendron (Hebert cộng sự, 2010), Chaenomeles (Stanys cộng sự, 2006), Hypericum (Meyer et al., 2009), Acer platanoides (Lattier et al., 2013; Bảng 1) Hơn nữa, oryzalin chứng minh hiệu colchicine việc nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro Chaenomeles japonica (Stanys cộng sự, 2006), Rhododendron sp (Väinölä, 2000), Watsonia lepida (Ascough et al., 2008), Ranunculus asiaticus (Dhooghe et al., 2009a) Nồng độ thời gian tiếp xúc với hợp chất kháng phân bào yếu tố khảo sát Trong mức độ phơi nhiễm thấp khơng có hiệu mức độ cao gây chết mẫu, tương tác thời gian tiếp xúc nồng độ chưa hiểu đầy đủ Đối với oryzalin, Meyer cộng (2009) phát nồng độ ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ sống sót cảm ứng đa bội mô sẹo Hypericum sp.; nhiên, thời gian tiếp xúc khơng ảnh hưởng Tương tự, nồng độ thời gian tiếp xúc oryzalin khơng phải yếu tố có ý nghĩa việc gây đa bội lai Rhododendron (Väinölä, 2000) Đối với Populus hopeiensis, nồng độ thời gian tiếp xúc với colchicine yếu tố có ý nghĩa lớn ảnh hưởng đến đa bội Đối với Rosa sp mối quan hệ nồng độ thời gian tiếp xúc với oryzalin dường phụ thuộc vào loại mô (Kermani cộng sự, 2003; Allum cộng sự, 2007) Kermani cộng (2003) nhận thấy thời gian giảm oryzalin yêu cầu sử dụng đoạn nốt mm so với đỉnh chồi Tương tự, Allum cộng (2007) nhận thấy kích thước đoạn nốt ảnh hưởng đến thời gian tiếp xúc với oryzalin Allum cộng (2007) cho để đảm bảo nhiễm sắc thể nhân đôi, thời gian tiếp xúc phải đủ lâu để tối đa hóa số lượng tế bào trình nguyên phân tiếp xúc với hợp chất kháng phân bào Độ hòa tan liên quan đến lực liên kết với tubulin yếu tố khác cần xem xét lựa chọn chất kháng phân bào Ví dụ, colchicine hịa tan cao nước (> 1,5M) dễ dàng thêm vào môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn, có lực liên kết tương đối thấp với tubulin thực vật (Morejohn cộng sự, 1987) Ngược lại, dinitroaniline tương đối khơng hịa tan dung dịch nước, với oryzalin đạt đến độ bão hòa