Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt
NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ THÀNH THỤC IN VITRO BẰNG PHƢƠNG PHÁP THUỶ TINH HOÁ VI GIỌT Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Thoa, Đỗ Văn Hƣơng, Quản Xuân Hữu Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng sống, tạo phôi sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. Trứng thu từ buồng trứng lò mổ được lựa chọn, nuôi thành thục in vitro trong môi trường IVM từ 22-24h ở 38.50C, 5% CO2. Sau đó lựa chọn những tế bào trứng thành thục in vitro loại A chuyển vào môi trường trước cân bằng (TCM 199 có bổ sung 1M EG và 20% FCS) ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo tế bào trứng được chuyển vào và rửa 3 lần trong môi trường đông lạnh ( TCM 199 có bổ sung 5.5M EG + 20% FCS + 1.0M sucrose). Hút 5-8 tế bào trứng/giọt cho trực tiếp vào trong dung dịch ni tơ lỏng. Chuyển các giọt này vào trong ống chịu lạnh, bảo quản trong ni tơ lỏng. Trứng đã thủy tinh hóa được giải đông trong môi trường giải đông (TCM 199 + 20% FCS + 1M sucrose), sau đó được nuôi in vitro từ 1-3h ở 38.5oC 5% CO2 để đánh giá khả năng sống, tạo phôi. Tỷ lệ tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu này là 47.86%. Tỷ lệ thụ tinh đạt 13.21%, tỷ tạo phôi dâu đạt 2.86%. Tỷ lệ này thấp hơn so với đối chứng tương ứng là 56.13% và 34.78%, P < 0.05. 1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học lạnh là nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp lên những cơ thể sống. Trong một thời gian dài con người cho rằng nhiệt độ thấp có ảnh hưởng không tốt đến tế bào và mô, nhưng ngày nay dựa trên những nguyên tắc cơ bản về sinh học lạnh tế bào, các nhà nghiên cứu đã tìm ra những biện pháp đông lạnh tế bào sinh sản với mục đích bảo tồn nguồn gen vật nuôi và những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng. Đồng thời đó cũng là nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu cơ bản khác như thụ tinh ống nghiệm (IVF), Cloning, chuyển nhân, chuyển gen… Trong chăn nuôi, quá trình sinh sản sẽ duy trì được nguồn gen từ con cái và tế bào trứng sẽ thay thế phôi khi được lựa chọn làm con giống mang tính thương mại. Hiện nay trên thế giới có thể đông lạnh phôi và trứng động vật có vú bằng phương pháp đông lạnh chậm hoặc đông lạnh nhanh. Tuy nhiên so với phôi thì đông lạnh tế bào trứng của động vật có vú là khó thành công hơn. Fuku năm 1992 và Otoi năm 1993 có báo cáo đầu tiên tạo ra bê từ trứng bò đông lạnh. Năm 1992, Hamano và cs đã nghiên cứu phương pháp đông lạnh tế bào trứng theo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, bằng cách sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao và tốc độ đông lạnh nhanh. Nhờ hai ưu điểm trên, phương pháp thủy tinh hóa vi giọt hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong công tác bảo tồn phôi cũng như tế bào trứng của các loài động vật có vú thay thế phương pháp đông lạnh chậm truyền thống. Kỹ thuật đông lạnh và lưu trữ tế bào sinh sản như tinh trùng và phôi đã ứng dụng thành công ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, kỹ thuật đông lạnh phôi và tinh trùng bò, lợn đã được nghiên cứu từ những năm 1990. Tuy nhiên, kỹ thuật đông lạnh tế bào trứng bò nói chung và đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt nói riêng chưa được nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt”, với mục đích là góp phần bảo tồn nguồn gen vật nuôi và làm nguyên liệu cho các nghiên cứu cơ bản khác, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu về đông lạnh tế bào trứng của một số loài động vật nuôi có ý nghĩa kinh tế khác . 2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Nội dung - Thu và nuôi thành thục invitro tế bào trứng bò - Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. - Giải đông tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm (TTON), đánh giá tỷ lệ tạo phôi từ trứng sau đông lạnh-giải đông. 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Thu tế bào trứng bò và nuôi thành thục invitro Buồng trứng bò được lấy ở các lò mổ, bảo quản trong dung dịch NaCl 0.9% ở nhiệt độ 25 o C-30 O C sau đó đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 3-5giờ. Dịch nang trứng được hút trên bề mặt buồng trứng bằng cách chọc hút với kim 18G từ những nang trứng có đường kính 3-8mm, sau đó để lắng rồi soi dưới kính hiển vi soi nổi để tìm tế bào trứng. Tế bào trứng được 2 lần trong môi trường nuôi tế bào IVM. Các tế bào trứng bò (COCs) có từ 3 lớp màng tế bào cumulus chặt chẽ trở lên được đưa vào môi trường nuôi thành thục in vitro trong 22-24 giờ ở 38.5 o C, 5% CO 2 2.2.2. ĐL-GĐ tế bào trứng bò thành thục in vitro, nhuộm nhân tế bào 2.2.2.1. Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt của Kikuchi và cs., 2006. Sau nuôi in vitro 22-24 giờ, lựa chọn những tế bào trứng thành thục in vitro loại A rửa 3 lần trong môi trường TCM 199 rồi chuyển vào môi trường TCM 199 + 20% FCS + 1M ethylene glycol (EG) trong 15 phút. Tiếp sau đó chuyển tế bào trứng vào môi trường đông lạnh chứa 5.5 M EG + 20% FCS + 1.0 M Sucrose, hút 5-8 trứng /giọt (6-8μl/giọt) cho trực tiếp vào dung dịch nitơ lỏng trong vòng 30 giây. Các giọt chứa tế bào trứng đã đông lạnh được cho vào ống chịu lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng -196°C. 2.2.2.2. Giải đông tế bào trứng bò thành thục in vitro Các tế bào trứng sau khi được bảo quản lạnh trong ni tơ lỏng từ 2-3 tuần sẽ được giải đông để đánh giá tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông và TTON. Các giọt chứa trứng được lấy ra và đưa vào môi trường giải đông TCM 199 chứa 20% FCS và 1 M Sucrose. Sau đó tế bào trứng được nuôi invitro trong môi trường IVM sau thời gian 1-3 giờ ở 38.5 o C, 5% CO 2 . 2.2.2.3. Nhuộm nhân tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông Các tế bào trứng sau đông lạnh giải đông có lớp màng cumulus sáng và giãn nở trở lại sẽ được nhuộm nhân bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342, sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào trứng sống là những tế bào trứng có nhiễm sắc thể không đứt gãy, phân tán. Thụ tinh in vitro thử nghiệm các tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông. 2.2.3. Thụ tinh in vitro Những tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông được đưa vào giọt thụ tinh (IVF) có chứa tinh trùng đã được họat hóa. Sau 5 giờ thụ tinh các hợp tử được rửa 2-3 lần trong môi trường nuôi phôi (IVC) và được loại bỏ lớp màng cumulus sau đó chuyển sang môi trường nuôi phôi và nuôi ở nhiệt độ 38.5 o C, 5% CO 2 . Số liệu được xử lý và phân tích bằng phương pháp thống kê sinh học và χ 2 với P < 0.05. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả Kết quả thu buồng trứng bò, tế bào trứng bò và nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò được thể hiện ở bảng 1. Từ 100 buồng trứng bò thu ở lò mổ, chúng tôi thu được 1030 tế bào trứng bò loại A, B, C, D. Sau đó lựa chọn được 845 tế bào trứng bò loại A, B đủ tiêu chuẩn dùng cho nuôi thành thục in vitro, tỷ lệ thành thục in vitro đạt 85.91% (726/845). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng những tế bào trứng bò thành thục in vitro loại A để tiến hành đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, đó là những tế bào trứng có từ 3lớp màng cumulus giãn nở trở lên. Tổng số có 585 tế bào trứng bò loại A đã được đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng -196°C. Sau 2-3 tuần chúng tôi tiến hành giải đông và nuôi invitro từ 1-3h, quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào để kiểm tra tế bào trứng bò sống sau đông lạnh-giải đông. Kết quả được thể hiện ở bảng 2. Bảng 1. Kết quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò Đợt TN Số buồng trứng (n) Số tế bào trứng thu được (A, B, C, D) (n) Số tế bào trứng nuôi thành thục in vitro (A, B) (n) Số tế bào trứng thành thục in vitro (n) A B C D 1 6 62 51 35 5 1 1 2 8 82 67 47 5 2 1 3 8 80 63 48 6 2 2 4 10 103 84 58 10 3 1 5 8 88 68 46 10 2 2 6 12 124 100 72 12 2 1 7 10 106 87 55 12 2 1 8 8 78 62 44 7 3 1 9 10 102 85 58 12 2 2 10 10 104 88 62 10 4 2 11 10 101 90 60 13 1 1 TS 100 1030 845 585 102 24 15 Bảng 2. Khả năng sống sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt Đợt thí nghiệm Tế bào trứng giải đông (n) Tế bào trứng sống (%) 1 105 42 (40) 2 92 47 (51.08) 3 90 42 (46.67) 4 84 41 (48.81) 5 108 50 (46.3) 6 106 58 (54.71) Tổng 585 280 (47.86) Kết quả cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống là 47.86% (280/585). Các tế bào trứng sống là những tế bào có lớp màng cumulus sáng và giãn nở trở lại, nhiễm sắc thể còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, phân tán. Những tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải đông được thử nghiệm thụ tinh in vitro. Kết quả được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Khả năng thụ tinh, tạo phôi sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng PP thủy tinh hóa vi giọt Đợt TN Thụ tinh Tạo phôi Đối chứng Trứng sau ĐL-GĐ Đối chứng Trứng sau ĐL-GĐ 1 34/50 (68) a 4/42 (9.52) b 17/50 (34) c 0/42 (0) d 2 36/62 (58.06) a 7/47 (14.89) b 24/62 (38.71) c 2/47 (4.25) d 3 46/95 (48.42) a 5/42 (11.9) b 38/95 (40) c 1/42 (2.38) d 4 51/98 (52.04) a 4/41 (9.76) b 29/98 (29.6) c 1/41 (2.44) d 5 62/103 (60.2) a 7/50 (14) b 36/103 ( 34.95) c 1/50 (2.0) d 6 55/ 98 (56.12) a 10/58 (17.24) b 32/98 (32.65) c 3/58 (5.17) d Tổng 284/506 (56.13) a 37/280 (13.21) b 176/506 (34.78) c 8/280 (2.86) d a, b Các giá trị khác nhau có ý nghĩa; P < 0.05 c, d Các giá trị khác nhau có ý nghĩa; P < 0.05 Kết quả cho thấy, tỷ lệ thụ tinh và tạo phôi in vitro của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông là thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với đối chứng (13.21% so với 56.13%, 34.78% so với 2.86%, tương ứng) 3.2. Thảo luận Đông lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt là một quá trình làm đông đặc chất bảo quản lạnh ở nồng độ cao trong suốt quá trình đông lạnh mà không có sự hình thành tinh thể đá gây tổn thương cho tế bào trứng trong quá trình đông lạnh (Niemann và cs., 1993). Mỗi một tế bào sẽ có một tốc độ làm lạnh tối ưu khác nhau và khả năng thấm màng của chất bảo quản lạnh cũng thay đổi theo sự thay đổi của nhiệt độ (Leibo và cs., 1971; Mazur, P. 1970; Mazur, P. 1977). Khi tốc độ làm lạnh nhanh phù hợp sẽ làm giảm thời gian tiếp xúc của tế bào trứng với nhiệt độ và làm giảm độc tố của chất bảo quản lạnh, do đó sẽ làm giảm bớt các tổn thương của tế bào trứng trong quá trình thủy tinh hóa. Trong phương pháp đông lạnh thủy tinh hóa vi giọt việc sử dụng một lượng rất nhỏ dung dịch bảo quản (5 μl mỗi giọt) đã làm tăng tốc độ đông lạnh và giảm bớt nguy cơ hình thành tinh thể đá làm tổn thương tế bào trong quá trình hạ nhiệt cũng như nâng nhiệt. Với các ưu điểm trên chúng tôi lựa chọn phương pháp thủy tinh hóa vi giọt cho thí nghiệm của mình. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải đông, tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm và tỷ lệ tạo phôi của trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải đông tương ứng là 47.86%, 13.21% , 2.86% thấp hơn so với một số báo cáo khác. Trong báo cáo của Dinnyes và cộng sự (2000), tỷ lệ sống của tế bào trứng bò sau đông lạnh-giải đông là 79-85%. Còn theo Andreas Mavrides và cộng sự (2002), tỷ lệ sống của trứng bò sau đông lạnh-giải đông là 90.5%. Tuy nhiên tỷ lệ trứng bò sống sau đông lạnh-giải đông của nghiên cứu này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của J.M.Lim, Y. Fukui and H. Ono năm 1991, trứng sống sau đông lạnh giải đông đạt 31.6%, tỷ lệ phôi phát triển đến 8 tế bào là 2.2 %. Hiện nay, kết quả đông lạnh và bảo quản tế bào trứng của các giống vật nuôi như bò (Doong-Hoon kim và cs., 2007), lợn (Tamas Somfai và cs., 1998), trâu (R.C.S YADAV và cs., 2008), cừu (N. Grag, N.G. Purhit., 2007) đã được công bố, nhưng tỷ lệ tạo phôi từ trứng sau đông lạnh-giải đông phát triển đến phôi nang còn rất thấp. Nguyên nhân chính là do sự tổn thương của trứng trong suốt quá trình đông lạnh-giải đông như sự hóa rắn của màng zonapellucida, sự đứt gãy nhiễm sắc thể…. Đa số các nghiên cứu về đông lạnh tế bào trứng bò đều cho rằng khả năng sống và phát triển của trứng bò thành thục sau đông lạnh-giải đông cao hơn so với trứng chưa thành thục, các tác giả cho rằng nguyên nhân là do trứng bò thành thục có khả năng thấm màng cao hơn trứng chưa thành thục. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi dùng trứng bò thành thục in vitro loại A để đông lạnh. Kết quả của nghiên cứu này còn thấp có rất nhiều lý do, có thể là do màng nguyên sinh chất bị tổn thương, sự tăng lên của tế bào chất không bình thường trong trứng, sự tổn thương của thoi vô sắc hoặc sự thay đổi cấu trúc của vành trong suốt trong quá trình đông lạnh, đây là vấn đề mà chúng tôi còn phải tiếp tục nghiên cứu. Mặc dù kết quả đạt được của chúng tôi trong nghiên cứu này chưa cao nhưng cũng khẳng định rằng khả năng đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt của Viện Chăn nuôi bước đầu đã thành công. 4. Kết luận Kết quả của nghiên cứu này cho thấy : - Việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt bước đầu đã thành công trong điều kiện tại Việt Nam. Tỷ lệ tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông đạt 47.86%, tỷ lệ thụ tinh và phát triển đến phôi dâu đạt 13.21% và 2.86%. - Có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu này trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, từ đó có thể mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học lạnh trong việc bảo quản tế bào trứng của một số loài động vật quý hiếm, động vật chăn nuôi có ý nghĩa kinh tế khác. Tài liệu tham khảo 1. Andreas Mavrides, David Morroll , 2002. Cryopresrevation of bovine oocytes : is cryoloop vitrification the future to preserving the female gamete?. Reprod. Nutr. Dev. 42 73-80. 2. Dong-Hoon Kim, Hyo-Suk Park, Se-Woong Kim, In-Sun HWANG, Byoung-Chul YANG, Gi-Sun IM , 2007. J.Reprod. Dev. 53 : 843-851. 3. Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X , 2000. Hight development rates of vitrified bovine oocytes following parthennogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod;63:513-8. 4. Fuku E, Kojima A, Shioya Y, Marcus GJ, Downey BR ,.1992. In vitro fertilization and development of frozen-thawed bovine oocytes. Cryobiology); 29 : 485-49. 5. Lim J.M, Fukui. Y and Ono. H June 1991. The post-thaw developmental capacity of frozen bovine oocytes following in vitro maturation and fertilization. Theriogenology. VOL.35No.6 6. Landa V, Tepla O. Cryopreservation of mouse 8-cell embryos in microdrops. Folia Biologica (Praha) 1990; 36 : 153-158 7. Le Gal F., Massip A., Cryopreservation of cattle oocytes : effects of meiotic stage, cycloheximide treatment, and vitrification proceduce, Cryobiology 38 , 290-300, 1999 8. Leibo S.P. and Mazur P. 1971. The role of cooling rates in low-temperature preservation.Cryobiology 8:447-452. 9. Mazur P. 1970. Cryobiology: The freezing of biological systems. Science 168:939-949. 10. Mazur P. 1977. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. Cryobiology 14:251-272. 11. Niemann H, Lucas-hahn A, Stoffregen C. 1993. Cryopreservation of bovine oocytes and embryos following microsurgical operation. Mol reprod dev1993; 36 : 232-235. 12. Grag N, Purohit N.G 2007. Effect of different cryoprotectant concentrations for ultrarapid freezing of immature goat follicular oocytes on their subsequent maturation and fertilization invtrro. Anim.Reprod.,V.4, n.3/4, p. 113-11813. 13. Hamano S, Koikeda A, Kuwayama M & Nagai T 1992. Full-term development of in vitro-matured, vitrified and fertilized bovine oocytes. Theriogenology 38 1085–1090. 14. Otoi T, Tachikawa S, Kondo S, Suzuki T 1993. Developmental capacity of bovine oocytes frozen in different cryoprotectants. Theriogenology; 40:801–807. 15. Tamas Somfai, Andras Dinnyes, Dagma Sage, Miklos Marosan, Joseph W, Carnwath, Manbu Ozawa, Kazuhiro Kikuchi, Heiner Niemann 2006. Theriogenology; 66 : 415-422. 16. Vajta G, Kuwayama M, Booth PJ, Holm P, Greve T, Callesen H 1998. Open pulled straw (OPS) vitrification of cattle oocytes. Theriogenology; 49:176. 17. Yadav R. C. S, Sharma A and Purohit G. N (2008). Survival of vitrified water buffalo cumulus oocytes complexes and their subsequent development in vitro. Bulgarian Jounal of Veterinary Medicine, 11, No 1, 55-64. . dung - Thu và nuôi thành thục invitro tế bào trứng bò - Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. - Giải đông tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm (TTON),. ĐL-GĐ tế bào trứng bò thành thục in vitro, nhuộm nhân tế bào 2.2.2.1. Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. năng sống sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt Đợt thí nghiệm Tế bào trứng giải đông (n) Tế bào trứng sống (%) 1 105 42