HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG VÀ NUÔI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonnum multiflorum Thunb)” Giáo viên hướng dẫn : TS Nông Thị Huệ Bộ môn : CNSH Thực vật Sinh viên thực : Nguyễn Thị Nhung Lớp : K62 - CNSHB Mã sinh viên : 620525 HÀ NỘI 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ(Polygonnum multiflorum Thunb)của tơi thời gian qua với số liệu kết nghiên cứu trung thực, không chép nguồn khác Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn nguồn thích rõ ràng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Nhung i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp với Đề tài “Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ (Polygonnum multiflorum Thunb)” kết q trình cố gắng khơng ngừng nghỉ thân giúp đỡ tận tình, động viên khích lệ thầy cơ, bạn bè người thân Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người giúp đỡ em thời gian làm đề tài khóa luận vừa qua Em xin trân trọng gửi đến cô Nông Thị Huệ- Người trực tiếp tận tình hướng dẫn cung cấp tài liệu, thông tin khoa học cần thiết cho luận lời cảm ơn chân thành sâu sắc Xin cảm ơn lãnh đạo, ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam khoa Công Nghệ Sinh Học mơn thực vật tạo điều kiện cho em hồn thành tốt khóa luận Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, động viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT viii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vào đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Hà thủ ô đỏ 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Hệ thống phân loại thực vật 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Thành phần Hà Thủ Ô 2.1.5 Phân bố 2.1.6 Tác dụng dược lý 2.1.7 Khai thác sử dụng 2.1.8 Bảo quản 2.1.9 Kỹ thuật trồng chăm sóc 2.1.10 Những lưu ý sử dụng Hà Thủ Ô đỏ 2.2 Một số nghiên cứu cảm ứng nhân ni sinh khối rễ số lồi dược liệu 2.2.1 Trên giới iii 2.2.2 Tại Việt Nam 2.3 Một số nghiên cứu chiết suất phân tích hoạt chất, tính chất Hà Thủ Ơ đỏ 11 III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 12 3.1.1 Đối tượng 12 3.1.2 Vật liệu 12 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3 Các tiêu theo dõi 16 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Nghiên cứu cảm ứng rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 17 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả rạo rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 17 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng α-NAA đến khả rạo rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 19 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả rạo rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 22 4.1.4 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả hình thành rễ bất định 25 4.2 Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến tăng trưởng rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 28 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng α-NAA đến khả tăng sinh khối rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 28 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tăng sinh khối rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 30 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số phương thức nuôi cấy đến khả tăng sinh khối rễ bất định 32 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 39 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1.a Ảnh hưởng IAA lên khả hình thành rễ bất định mẫu Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 17 Bảng 4.1.b Ảnh hưởng IAA lên khả hình thành rễ bất định mẫu cuống Hà Thủ Ô đỏ sau tuần .18 Bảng 4.2.a Ảnh hưởng α-NAA đến hình thành rễ bất định mẫu Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 20 Bảng 4.2.a Ảnh hưởng α-NAA đến hình thành rễ bất định mẫu cuống Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 21 Bảng 4.3.a Ảnh hưởng IBA đến hình thành rễ bất định mẫu Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 23 Bảng 4.3.b Ảnh hưởng IBA đến hình thành rễ bất định mẫu cuống Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 24 Bảng 4.5 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả hình thành rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 26 Bảng 4.6 Ảnh hưởng α-NAA đến khả tăng sinh khối rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ sau tuần 28 Bảng 4.7 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tăng sinh khối rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ sau tuần .30 Bảng 4.8 Ảnh hưởng số phương thức nuôi cấy đến khả tăng sinh khối rễ bất định sau tuần 33 v DANH MỤC HÌNH Hình 4.1a Sự hình thành rễ bất định từ mẫu Hà Thủ Ơ đỏ mơi trường bổ sung IAA sau tuần nuôi cấy 18 Hình 4.1b Sự hình thành rễ bất định từ mẫu cuống Hà Thủ Ơ đỏ mơi trường bổ sung IAA sau tuần nuôi cấy 19 Hình 4.2a Sự hình thành rễ bất định từ mẫu Hà Thủ Ơ đỏ mơi trường bổ sung α-NAA sau tuần nuôi cấy 21 Hình 4.2b Sự hình thành rễ bất định từ mẫu cuống Hà Thủ Ô đỏ môi trường bổ sung α-NAA sau tuần nuôi cấy 22 Hình 4.3a Sự hình thành rễ bất định từ mẫu Hà Thủ Ô đỏ môi trường bổ sung IBA sau tuần nuôi cấy 23 Hình 4.3b Sự hình thành rễ bất định từ mẫu cuống Hà Thủ Ơ đỏ mơi trường bổ sung IBA sau tuần nuôi cấy 25 Hình 4.5 Sự hình thành rễ bất định từ nguồn mẫu hà Thủ Ô đỏ mơi trường có điều kiện chiếu sáng khác sau tuần 27 Hình 4.6 Sự nhân sinh khối rễ bất định từ rễ Hà Thủ Ô đỏ môi trường bổ sung α-NAA sau tuần nuôi cấy 29 Hình 4.7 Sự nhân sinh khối rễ bất định từ rễ Hà Thủ Ơ đỏ mơi trường khác sau tuần nuôi cấy 32 Hình 4.8 Sự nhân sinh khối rễ bất định từ rễ Hà Thủ Ô đỏ phương thức nuôi cấy khác sau tuần nuôi cấy 33 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MS Môi trường Murashige and Skoog B5 Môi trường Gamborg α-NAA α-naphthaleneacetic acid IBA Indole – butyric acid IAA β-indol-acetic acid ĐC Đối chứng CT Cơng thức TN Thí nghiệm LSD 0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% CV Sai số thí nghiệm TB Trung bình CS Cộng NĐ Nồng độ vii TĨM TẮT Hà Thủ Ơ lồi nhiều nhà nghiên cứu quan tâm đánh giá cao lồi dược liệu có giá trị kinh tế cao Các nghiên cứu in vitro Hà Thủ Ô đạt nhiều thành tựu có nhiều hướng Tuy nhiên với Hà Thủ Ô đỏ hai loại Hà Thủ Ô cần nên nhân giống bảo tồn nhu cầu sử dụng ngày gia tăng Cảm ứng tạo rễ nuôi cấy sinh khối rễ bất định thành công nhiều đối tượng đặc biệt loài Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nguồn mẫu, ánh sáng, chất điều hòa sinh trưởng IAA, α-NAA, IBA phương thức nuôi cấy, môi trường nuôi cấy khác tiến hành nhằm đánh giá khả cảm ứng nhân ni rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ viii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vào đề Từ xưa đến nay, thuốc ln giữ vai trị quan trọng chủ yếu việc trì sức khỏe hạnh phúc cộng đồng toàn giới Những năm gần đây, việc sử dụng thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược gặp nhiều bất cập tác dụng khôn lường, ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh Do đó, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên ngày nhiều, không nước Á Đơng mà cịn nước phương Tây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) thuốc quý sử dụng y học cổ truyền nhiều kỉ Các chiết xuất từ rễ dùng để điều trị nhiều loại bệnh khác Theo Đông y, Hà Thủ Ơ đỏ có cơng dụng làm đen tóc, có tác dụng bổ máu, an thần, dưỡng can, ích thận, cố tinh, nhuận tràng, chữa sốt rét Nó vị thuốc bổ gan thận, bổ máu, chữa đau lưng mỏi gối, uống lâu làm đen râu tóc Theo Tây y, Hà Thủ Ơ đỏ điều trị suy nhược thần kinh bệnh thần kinh, bổ tim, giúp sinh huyết dịch, kích thích co bóp ruột, kích thích tiêu hóa Hiện nay, nguồn cung cấp dược liệu nước chủ yếu thu hái tự nhiên canh tác truyền thống Tuy nhiên, phương pháp khai thác tự để lại nhiều hạn chế gây xói mịn nguồn tài ngun di truyền thực vật, nguồn cung khơng ổn định…Trong đó, biện pháp canh tác truyền thống trồng Hà Thủ Ô đỏ phải thời gian, cơng sức Ngồi ra, việc kiểm soát loại dịch bệnh, tồn dư thuốc bảo vệ thực vật kim loại nặng vấn đề khó khăn Hàm lượng sản phẩm mục tiêu chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái, trồng trọt dẫn đến không ổn định Tất điều gây trở ngại việc khai thác nguồn dược liệu quý này.Hơn nữa, nghiên cứu Hà Thủ Ô đỏ tập trung vào việc nghiên cứu tách chiết thu nhận hoạt chất thứ cấp, đánh giá tác dụng dược lý, phân tích thành phần hóa học hay nhân giống vơ tính in vitro.Việc cảm ứng nhân nuôi sinh khối từ rễ tơ Bảng thành phần môi trường Gamborg B5 Thành phần Đa lượng Tên gọi thường Tên hóa học Nồng độ (mg/L) Ammonium sulphate (NH )2SO 134.000 Calcium chloride CaCl 113.230 Magnesium sulphate MgSO 122.090 KNO 2500.000 Potassium nitrate Vi lượng Vitamins Sodium phosphate monobasic NaH PO 130.420 Boric acid H BO 3.000 Cobalt chloride hexahydrate CoCl 6H O 0.025 Copper sulphate pentahydrate CuSO 5H O 0.025 EDTA disodium salt dihydrate Na H EDTA.2H O 37.300 Ferrous sulphate heptahydrate FeSO 7H O 27.800 Manganese sulphate monohydrate MnSO H O 10.000 Molybdic acid (sodium salt) MoO H O 0.213 Potassium Iodide KI 0.750 Zinc sulphate heptahydrate ZnSO 7H O 2.000 myo-Inositol 100.000 Nicotinic acid (free acid) 1.000 Pyridoxine HCl 1.000 40 Thí nghiệm 1:Ảnh hưởng α-NAA lên hình thành rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ Tại mẫu Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N R² Khoi luong tuoi(mg) Adj R² CV 90 0.97 0.97 0.03 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df Model 5153472.89 MS F 1288368.22 Nong khoang 5153472.89 Error 133671.26 85 1572.60 Total 5287144.14 89 p-value 819.26 0.05) Thí nghiệm 2:Ảnh hưởng IAA lên hình thành rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ Mẫu Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N R² Khoi luong tuoi(mg) Adj R² CV 90 0.48 0.46 0.03 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 43 Model 179876.18 44969.04 Nong khoang 179876.18 Error 191571.57 85 2253.78 Total 371447.74 89 19.95 44969.04 0.05) Khoi luong kho(mg) Variable N R² Khoi luong kho(mg) Adj R² CV 90 0.16 0.12 0.43 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df Model 4125.47 MS F 1031.37 4.12 p-value 0.0042 Nong khoang 4125.47 1031.37 4.12 Error 21274.40 85 250.29 Total 25399.88 89 0.0042 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.03367 Error: 250.2871 df: 85 Nong khoang Means n S.E 0.00 0.00 18 3.73 A 1.00 0.62 18 3.73 A 0.50 1.68 18 3.73 A 2.00 13.24 18 3.73 B 1.50 15.66 18 3.73 B 44 0.05 Mẫu cuống New table : 3/8/2022 - 10:32:00 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N R² Khoi luong tuoi(mg) Adj R² CV 90 0.23 0.19 7.12 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 36.71 6.34 0.0002 Nong khoang 146.83 36.71 6.34 Error 491.76 85 5.79 Total 638.58 89 Model 146.83 0.0002 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.02254 Error: 5.7854 df: 85 Nong khoang Means n S.E 1.00 0.00 18 0.57 A 0.50 0.00 18 0.57 A 0.00 0.00 18 0.57 A 1.50 0.03 18 0.57 A 2.00 3.20 18 0.57 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Khoi luong kho(mg) Variable N R² Khoi luong kho(mg) Adj R² CV 90 0.22 0.18 20.31 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 3.93 0.98 5.93 0.0003 Nong khoang 3.93 0.98 5.93 Error 0.17 14.07 85 0.0003 45 Total 18.00 89 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.01431 Error: 0.1655 df: 85 Nong khoang Means n S.E 1.50 0.00 18 0.10 A 1.00 0.00 18 0.10 A 0.00 0.00 18 0.10 A 0.50 0.00 18 0.10 A 2.00 0.52 18 0.10 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Thí nghiệm 3:Ảnh hưởng IBA lên hình thành rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ Mẫu Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N R² Khoi luong tuoi(mg) Adj R² CV 90 0.20 0.17 0.89 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df Model 3088.28 MS F 772.07 5.47 p-value 0.0006 Nong khoang 3088.28 772.07 5.47 Error 12005.24 85 141.24 Total 15093.52 89 0.0006 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.03640 Error: 141.2381 df: 85 Nong khoang Means n S.E 0.00 0.00 18 2.80 A 1.00 1.92 18 2.80 A 0.50 5.18 18 2.80 A B 46 1.50 11.86 18 2.80 2.00 15.37 18 2.80 B C C Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Khoi luong kho(mg) Variable N R² Khoi luong kho(mg) Adj R² CV 90 0.19 0.16 6.17 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 77.76 19.44 5.09 0.0010 Nong khoang 77.76 19.44 5.09 Error 324.56 85 3.82 Total 402.32 89 0.0010 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.03215 Error: 3.8184 df: 85 Nong khoang Means n S.E 0.00 0.00 18 0.46 A 1.00 0.39 18 0.46 A 0.50 0.87 18 0.46 A 2.00 2.16 18 0.46 1.50 2.31 18 0.46 B B C C Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Mẫu cuống Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N R² Khoi luong tuoi(mg) Adj R² CV 90 0.08 0.04 2.47 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df Model 388.29 MS F p-value 97.07 1.93 0.1121 97.07 1.93 Nong khoang 388.29 0.1121 47 Error 4265.02 85 Total 4653.31 89 50.18 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.03237 Error: 50.1767 df: 85 Nong khoang Means n S.E 0.50 0.00 18 1.67 A 0.00 0.00 18 1.67 A 1.50 2.33 18 1.67 A B 2.00 4.44 18 1.67 A B 1.00 4.83 18 1.67 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Khoi luong kho(mg) Variable N R² Khoi luong kho(mg) Adj R² CV 90 0.09 0.05 12.08 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 15.07 3.77 2.05 0.0940 Nong khoang 15.07 3.77 2.05 Error 155.89 85 1.83 Total 170.96 89 0.0940 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:= 0.03387 Error: 1.8340 df: 85 Nong khoang Means n S.E 0.50 0.00 18 0.32 A 0.00 0.00 18 0.32 A 1.50 0.34 18 0.32 A B 2.00 0.79 18 0.32 A B 1.00 1.01 18 0.32 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) 48 Thí nghiệm 4:Ảnh hưởng ánh sáng lên hình thành rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ New table_1 : 3/17/2022 - 12:50:25 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Khoi luong tuoi(mg) Variable N Khoi luong tuoi(mg) R² Adj R² CV 90 0.71 0.70 0.03 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS Model 3808414.99 Anh sang Error 3808414.99 1536588.64 85 F p-value 952103.75 52.67 952103.75