BÀI GIẢNG: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Khoa: Cơng nghệ sinh học – môi trường Th.s Vưu Ngọc Dung CHƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Công nghệ tế bào động vật có vú Tế bào động vật Mơi trường nuôi cấy Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Các ứng dụng công nghệ tế bào động vật Tài liệu tham khảo: Phạm Thành Hổ, Nhập môn công nghệ sinh học, NXBGD CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CĨ VÚ Các ưu điểm ni cấy tế bào động vật Một số hạn chế nuôi cấy tế bào động vật CÁC ƯU ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Sản xuất phân tử phức tạp kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị chẩn đốn  Đáp ứng q trình hậu dịch mã xác sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical)  Sản xuất viral vector dùng liệu pháp gen: bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, bệnh tim mạch xơ hóa u nang  Sản xuất tế bào động vật làm chất in vitro nghiên cứu độc chất học dược học  Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp: Da nhân tạo (bỏng), Mô gan (viêm gan), Đảo Langerhans (tiểu đường)  MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Kích thước lớn cấu trúc phức tạp tế bào vi sinh vật  Tốc độ sinh trưởng chậm sản lượng thấp  Dễ bị biến dạng vỡ (bao bọc màng huyết tương)  Môi trường nuôi cấy chưa xác định cách đầy đủ phải bổ sung huyết máu  Mô phân hóa thể đơn bào vi sinh vật  Hầu hết tế bào động vật sinh trưởng gắn bề mặt  TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Các tế bào dịch huyền phù  Tế bào hồng cầu bạch huyết mơ liên kết khơng điển hình, dạng thể lỏng  Các tế bào máu dịch bạch huyết tế bào dịch huyền phù (suspension cells), không dính bám chúng sinh trưởng ni cấy in vitro  Các tế bào khơng dính bám khơng địi hỏi bề mặt để sinh trưởng  Nuôi cấy môi trường dịch lỏng tương tự vi khuẩn Các tế bào dính bám  Hầu hết tế bào động vật bình thường tế bào dính bám, chúng cần có bề mặt để gắn vào sinh trưởng  Các loại tế bào dính bám tế bào biểu mô nguyên bào sợi (fibroblast) (c) (a) (b) Hình : Các tế bào động vật thường sử dụng nuôi cấy (a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi MƠI TRƯỜNG NI CẤY Động vật khơng trao đổi chất nitrogen vô cơ, bổ sung nhiều amino acid vitamin vào môi trường  Môi trường: amino acid, vitamin, hormone, nhân tố sinh trưởng, muối khoáng glucose bổ sung 2-20% huyết tương động vật có vú (bị bụng mẹ)  Nhiều nghiên cứu thực để xây dựng cơng thức mơi trường khơng có huyết thanh, hormone nhân tố sinh trưởng tinh để thay cho huyết  Thành phần Nồng độ Thành phần (mg/L) Thành phần môi trường Eagle (1959) L-Amino acid Nồng độ (mg/L) 3.Vitamin Arginine 105 Choline Cystine 24 Folic acid Glutamine 292 Inositiol Histidine 31 Nicotinamide Isoleucine 52 Pantothenate Leucine 52 Pyridoxal Lysine 58 Riboflavin 0,1 Methionine 15 Thiamine Phenylalanine 32 Muối 6800 Threonine 48 NaCl 400 Tryptophan 10 KCl 200 Tyrosine 36 CaCl2 200 Valine 46 MgCl2.6H2O 150 2000 Carbohydrate 1000 NaH2PO4.2H2O Glucose 5-10% NaHCO3 Serum KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Sản xuất sản phẩm sinh-dược nuôi cấy dịch huyền phù hệ lên men  Cánh khuấy có dạng hình mái chèo  Cung cấp oxygen cách khuếch tán thông qua ống silicone, khơng tạo bọt khí tốc độ truyền oxygen thỏa đáng  Môi trường chứa nhiều protein huyết có khả gây tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm nhẹ  Dòng tế bào dính bám cần hệ thống chất mang microcarrier  Các dòng tế bào thường sử dụng nuôi cấy CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 tế bào võng mạc người  ỨNG DỤNG TẾ BÀO MẦM PHÔI Trong nghiên cứu  Công cụ quý giá để hiểu phát triển phơi người dị dạng khác làm rối loạn phát triển  Phương tiện nghiên cứu: tăng sinh tế bào đa năng, phân hóa đặc thù, nhân tố điều khiển chúng  Việc nghiên cứu tai biến di truyền đến phát triển  Niềm hy vọng chống lại nhiều loại u trẻ em, u nguyên bào thận, bắt nguồn từ quần thể tế bào phôi  Xác định tác dụng gen gây ung thư gen ngăn chặn ung thư  Về phương diện điều trị, tế bào ES máu ứng dụng lâm sàng trường hợp ghép tủy, ni cấy tế bào ES có ứng dụng việc tái tạo mô khác Nghiên cứu chức gen Xét nghiệm nhanh ống nghiệm để xác định chức gen  Các tế bào ES ni cấy dễ xử lý di truyền, chịu biến đổi định vị vị trí nhiễm sắc thể đặc thù nhờ cách tái tổ hợp nguồn, biết, tế bào phôi tế bào trưởng thành phân hóa  Nghiên cứu mơ hình bệnh lý Theo nguyên lý, tế bào ES nguồn in vitro loại tế bào thể  Khả sản xuất ống nghiệm biến đổi di truyền  Những tế bào bắt nguồn từ tế bào ES biến đổi di truyền nguyên liệu lý tưởng để chọn lọc phân tử điều trị  NHÂN BẢN VƠ TÍNH ĐỘNG VẬT CĨ VÚ Nhân vơ tính (tạo dịng vơ tính) q trình tạo một tập hợp cá thể giống hệt mặt di truyền giống bố (hoặc mẹ) ban đầu phương thức sinh sản vơ tính  Dựa quan điểm tế bào thể đa bào xuất phát từ tế bào hợp tử ban đầu qua phân bào nguyên nhiễm  nhân hoàn toàn giống hệt mặt di truyền  NHÂN BẢN VƠ TÍNH CỪU DOLLY Cơng trình Wilmut, Campbell cộng (Ecosse, Anh)  Đối tượng nghiên cứu: tế bào lấy từ tuyến vú cừu Finn Dorset, sáu năm tuổi, lông trắng  Thời kỳ ba tháng cuối từ cừu mang thai, tế bào tuyến vú phân hóa cao độ phát triển  Ni cấy in vitro tế bào tuyến vú môi trường ni cấy nghèo huyết (5 ngày), mục đích làm cho chu kỳ tế bào giảm từ từ ngừng hoàn toàn, giai đoạn gọi G0  Làm lạnh trước đưa tế bào tuyến vú vào noãn chưa thụ tinh, rút nhân cừu khác, đầu đen  Kết quả, tế bào hình thành, phát triển tạo thành phôi  Cừu Dolly sinh ngày 5/7/1996, có trọng lượng bình thường khơng có biểu dị dạng thí nghiệm trước  Sống tử cung “mẹ nuôi hộ” lông đen, cừu Dolly có lơng trắng  Các phân tích kiểm tra di truyền xác nhận cừu Dolly cừu Finn Dorset, cừu cung cấp tế bào tuyến vú  Cừu cho tế bào trứng Cừu cho tế bào tuyến vú Tế bào trứng từ nỗn Loại bỏ nhân Ni cấy tế bào tuyến vú Chu kỳ tế bào ngừng lại (phage G0) Dung hợp tế bào Nhân tế bào tuyến vú Tế bào sinh trưởng nuôi cấy Phôi sớm Cừu mẹ thay Cừu non (Dolly) giống hệt nhiễm sắc thể với cừu cho tế bào tuyến vú CÔNG NGHỆ SINH SẢN NHÂN TẠO thiệp vào sinh sản người  Các biện pháp sinh sản nhân tạo động vật nuôi  Can CAN THIỆP VÀO SINH SẢN Ở NGƯỜI Các nguyên nhân vô sinh người: - Ở nam giới: tinh trùng ít, yếu, dị dạng, bị tắc, yếu tố di truyền hay miễn dịch - Ở nữ giới: cố rụng trứng, tiết chất chống tinh trùng hay hệ thống tử cung  Các biên pháp sinh sản nhân tạo: - Bơm tinh nhân tạo (artificial insemination – AI) - Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization – IVF)  Bơm tinh nhân tạo: - Ca thực vào năm 1970 - Năm 1953 tinh trùng đông lạnh bảo quản nên biện pháp trở nên phổ biến - Hiện nay, 250000 trẻ em toàn giới sinh năm nhờ phương pháp  Thụ tinh ống nghiệm (IVF): - Phương pháp IVF tách tế bào trứng cho thụ tinh với tinh trùng ống nghiêm đĩa petri - Sau phơi đưa vào tử cung người mang thai - “Đứa bé ống nghiệm” (test-tube baby) sinh năm 1978 - Tỉ lệ thành công khoảng 20%  Tóm tắt kỹ thuật IVF:  Kích thích buồng trứng cho vợ  Chọc hút trứng  Chuẩn bị tinh trùng chồng  Cấy tinh trùng trứng mơi trường nhân tạo để hình thành phơi  Chuyển phôi vào buồng tử cung cho vợ Từ năm 1995, kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng - ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) đời  ICSI có nghĩa tiêm tinh trùng trực tiếp vào trứng để tạo phôi  ICSI dùng trường hợp tinh trùng tự thụ tinh bất thường thụ tinh, dẫn đến khơng có phơi để chuyển vào buồng tử cung  phương pháp có hiệu với chi phí thấp IVF là:  GIFT (gamete intrafallopian transfer): - Là kỹ thuật thụ tinh tinh trùng thể người mẹ - Người mẹ kích thích siêu rụng trứng trước tuần vài trứng to lấy - Tinh trùng tốt thu - Cả trứng tinh trùng đặt vào ống dẫn trứng cho tiếp xúc để thụ tinh  ZIFT (Zygote intrafallopian transfer): Chuyển hợp tử vào ống dẫn trứng biến dạng GIFT hợp tử IVF đưa vào ống dẫn trứng với kết tương đương GIFT CÁC BIỆN PHÁP SINH SẢN NHÂN TẠO ĐỘNG VẬT NUÔI Thụ tinh nhân tạo  Được áp dụng động vật (chó) từ năm 1782  Năm 1952, bị sinh nhờ tinh trùng đơng lạnh  Sản xuất tinh đông viên: bảo quản tinh trùng nitrogen lỏng (-1960C) dạng viên Giải đông trước gieo tinh nhân tạo  Sản xuất tinh đơng viên áp dụng rộng rãi lợn, bị, cá  Tinh đông viên ứng dụng cho 80% bò, 60% lợn nước phát triển (vấn đề quan trọng chọn lọc giống)  Năm 1959, thỏ đời nhờ IVF  Kỹ thuật IVF áp dụng cho động vật quý Cấy chuyển phôi (Embryo transplantation)  Từ năm 1951, bị đời nhờ cấy chuyển phơi  Quy trình tiến hành qua bước: - Gây siêu rụng trứng nhờ hormone - Thu nhận hợp tử - Nuôi trứng - Thụ tinh ống nghiệm để có hợp tử tạo phơi - Cấy chuyển phơi vào động vật  Cấy chuyển phôi cần kỹ thuật liên quan khác như: ni trứng chín in-vitro, tạo hàng loạt phôi từ động vật suất cao, cắt phơi,…  Xác định giới tính phơi (sexing embryos) nhằm tăng hiệu cấy chuyển phôi cách sử dụng mồi đặc hiệu nhiễm sắc thể Y khuếch đại gen PCR  Ngồi ra, cịn cấy ghép phơi lồi tạo động vật khảm Chó Ruppy ánh sáng ban ngày Phát sáng phịng tối có tia cực tím ...CHƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Công nghệ tế bào động vật có vú Tế bào động vật Môi trường nuôi cấy Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Các ứng dụng công nghệ tế bào động. .. Hổ, Nhập môn cơng nghệ sinh học, NXBGD CƠNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CĨ VÚ Các ưu điểm ni cấy tế bào động vật Một số hạn chế nuôi cấy tế bào động vật CÁC ƯU ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Sản xuất... thể tiền tế bào thần kinh khiết, số điều kiện chúng phân hóa thành tế bào thần kinh thành thục Tế bào gan Tế bào mầm phôi Tế bào thần kinh Nuôi cấy tế bào mầm Tế bào mầm trưởng thành Tế bào tim