Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis) VÀ CATECHIN 1 I. GIỚI THIỆU 1 1. Giới thiệu về cây trà 1 2. Thành phần hóa học của trà 1 3. Thuộc tính hóa học của Catechin 2 4. Hoạt tính sinh học Catechin 3 5. Ứng dụng 4 BÀI 2: TRÍCH LY CATECHIN TỪ LÁ TRÀ XANH 5 1. Nguyên Liệu 5 2. Hòa Chất 6 3. Dụng Cụ 6 4. Các bước tiến hành 6 5. Kết Quả Thu Được 10 BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CATECHIN … FOLINCLOCALTEU 11 I. LÝ THUYẾT 11 II. THỰC HÀNH 11 1. Nguyên liệu 11 2. Hóa Chất 11 3. Dụng cụ 12 4. Các bước thực hành 12 III. KẾT QUẢ 15 BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ... NĂNG LỰC KHỬ SẮT 16 I. LÝ THUYẾT 16 II. THỰC HÀNH 16 1. Nguyên liệu 16 2. Hóa chất 16 3. Dụng cụ 17 4. Các bước tiến hành 17 III. KẾT QUẢ 18 BÀI 5: ĐỊNH TÍNH CATECHIN … (TLC – THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) 19 I. LÝ THUYẾT 19 II. THỰC HÀNH 19 1. Nguyên liệu 19 2. Hóa chất 19 3. Dụng cụ 19 4. Các bước thực hiện 20 III. KẾT QUẢ 23 BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis) VÀ CATECHIN I.GIỚI THIỆU 1.Giới thiệu về cây trà Giới Thực vật Ngành Thực vật có hoa Lớp Hai lá mầm thực sự Phân lớp Asterids Order Ericales Họ Theaceae Chi Camellia Loài C.sinensis Trà là một những loại thức uống được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới. Trà được chiết xuất từ lá cây trà Camellia sinensis, tùy thuộc vào phương pháp kỹ thuật được áp dụng trong quá trình chế biến mà trà được phân ra làm 4 loại như sau: trà trắng, trà xanh, trà ô long và trà đen. 2. Thành phần hóa học của trà Thành phần hóa của trà biến đổi rất phức tạp, phụ thuộc vào vị trí địa lí, thổ nhưỡng, chế độ dinh dưỡng, và giống trà tuy nhiên để tận dụng được nguồn chất có lợi trong trà, đã có những nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần, cấu trúc các hoạt chất có trong trà.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH – DƯỢC PHẨM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH – DƯỢC PHẨM GVHD: T.S PHẠM MINH NHỰT LỚP: 20DSHA1 NHÓM: 02 THÀNH VIÊN NHÓM: LÊ LÂM HOÀNG ANH 2081000010 20DSHA1 TRẦN VÕ TƯ TỶ 2011100711 20DSHA1 NGÔ VĨNH KIÊN 2011100546 20DSHA1 TRẦN TẤN LỘC 2011100068 20DSHA1 PHAN TẤN MINH 2011100509 20DSHA1 TP HỒ CHÍ MINH, Ngày 12 Tháng 06 Năm 2023 MỤC LỤC BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis) VÀ CATECHIN I GIỚI THIỆU 1 Giới thiệu trà Thành phần hóa học trà Thuộc tính hóa học Catechin Hoạt tính sinh học Catechin Ứng dụng .4 BÀI 2: TRÍCH LY CATECHIN TỪ LÁ TRÀ XANH .5 Nguyên Liệu Hòa Chất Dụng Cụ Các bước tiến hành Kết Quả Thu Được 10 BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CATECHIN … FOLIN-CLOCALTEU 11 I LÝ THUYẾT 11 II THỰC HÀNH 11 Nguyên liệu .11 Hóa Chất 11 Dụng cụ .12 Các bước thực hành 12 III KẾT QUẢ 15 BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NĂNG LỰC KHỬ SẮT .16 I LÝ THUYẾT 16 II THỰC HÀNH 16 Nguyên liệu .16 Hóa chất 16 Dụng cụ .17 Các bước tiến hành 17 III KẾT QUẢ 18 BÀI 5: ĐỊNH TÍNH CATECHIN … (TLC – THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) 19 I II LÝ THUYẾT 19 THỰC HÀNH 19 Nguyên liệu .19 Hóa chất 19 Dụng cụ .19 Các bước thực 20 III KẾT QUẢ .23 BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ XANH (Camellia sinensis) VÀ CATECHIN I GIỚI THIỆU Giới thiệu trà Giới Hình 1.1: Thực Lá trà vật Ngành Thực vật có hoa Lớp Hai mầm thực Phân lớp Asterids Order Ericales Họ Theaceae Chi Camellia Loài C.sinensis Trà loại thức uống tiêu thụ nhiều giới Trà chiết xuất từ trà Camellia sinensis, tùy thuộc vào phương pháp kỹ thuật áp dụng trình chế biến mà trà phân làm loại sau: trà trắng, trà xanh, trà ô long trà đen Thành phần hóa học trà Thành phần hóa trà biến đổi phức tạp, phụ thuộc vào vị trí địa lí, thổ nhưỡng, chế độ dinh dưỡng, giống trà nhiên để tận dụng nguồn chất có lợi trà, có nghiên cứu đầy đủ thành phần, cấu trúc hoạt chất có trà Thành phần Catechin (-)-Epigallocatechin gallate (-)-Epicatechin gallate (-)-Epigallo catechin % khối lượng khô 25-30 8-12 3-6 3-6 (-)-Epicatechin (+)-Catechin (+)-Gallocatechin Flavonol flavonol glucoside Polyphenolic acid depside Leucoanthcyanin Chlorophyll chất màu 1-3 1-2 3-4 3-4 3-4 2-3 0,5-0,6 khác Khoáng Caffeine Theobromine Theophylline Amino acid 5-6 3-4 0,2 0,5 4-5 Acid hữu Monosaccharide Polysaccharide Cellulose hemicellulose Pectin Lignin Protein Lipid Các hợp chất dễ bay Thuộc tính hóa học Catechin 0,5-0,6 4-5 14-22 4-7 5-6 5-6 14-17 3-5 0,01-0,02 Theo bảng 1.2, chè tươi, Catechin chiếm khiangr 25-35% tổng trọng lượng khơ Catechin thuộc nhóm flavan-3-ols với cấu trúc nhóm Hình 1.2:Cấu trúc hóa học flavonoid với khung sườn C6-C3-C6 diphenylpropane với vòng benzen (vòng A B) liên kết vòng dihydropyan heterocylic (vòng C) hình thành từ chuỗi carbon kín chứa oxygen Do đó, sườn cấu trúc phân tử flavonoid C6-C3-C6 Trong đó, vịng C chứa nhóm hydroxyl phân tử carbon số Catechin gồm hợp chất (+)-catechin; (-)-epicatechin (EC); (+)-gallocatechin (GC); (-)-epicatechin gallate (ECG); (-)-epigallocatechin (EGC); (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), EGCG đối tượng nghiên cứu nhiều Hoạt tính sinh học Catechin Các hoạt tính sinh học catechin đánh giá qua thí nghiệm invitro sử dụng tế bào nuôi cấy vi khuẩn Các catechin trà (+)catechin, (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-epigallocatechin gallte (EGCG) có nhiều hoạt tính sinh học Hình 1.3: Các hoạt chất Catechin kháng viêm, kháng tế bào ung thư, có khả kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật hạ huyết áp Ứng dụng Trong lĩnh vực thực phẩm - Nhờ khả diệt loại vi khuẩn Gram âm dương nên dùng làm chất kháng khuẩn - Nhờ có khả kháng oxi hóa, Catechin dùng cơng nghệ thực phẩm để thay chất chống oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ có hại Trong lĩnh vực y học - Nhờ khả nhắm đích tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào thường, Catechin nên dùng thay kết hơp cho hóa chấ dùng hóa trị liệu jay nhằm giảm tác dụng phụ chúng đồng thời giúp bệnh nhân hồi phục nhanh - Nhờ đặc tính tiêu diệt dòng tế bào kháng thuốc điều trị (như kháng thuốc Imatinid bệnh bạch hầu cầu mạn dòng tủy (CML) ung thư mơ đệm đường tiêu hóa (GÍT)), Catechin ứng dụng trường hợp giúp tăng cường hi vọng cho bệnh nhân mắc phải BÀI 2: TRÍCH LY CATECHIN TỪ LÁ TRÀ XANH I LÝ THUYẾT Nguyên tắc chiết lỏng - lỏng phân bố chất tan vào hai pha lỏng hai pha lỏng khơng hịa tan vào nhau: Cần nhớ: - Dung mơi khơng phân cực (như eter dầu hỏa) hịa tan tốt hợp chất có tính khơng phân cực (như alcol béo, ester béo…) - Dung môi phân cực trung bình (như diethy eter, cloroform…) hịa tan tốt hợp chất có tính phân cực trung bình (như hợp chất có chứa nhóm chức eter ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)O-, aldehyd ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)O, ceton ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)CO₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…), ester ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)COO₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)…) - Dung môi phân cực mạnh (như methanol…) hịa tan tốt hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)OH, ₋O-, aldehyd ₋CH₌O, ceton ₋CO₋, ester ₋COO₋…)COOH…) Lá trà xanh chứa hàm lượng lớn catechin, thu nhận cách xử lý trà xanh với nước dung môi hữu cơ, hình 1.1 hình 1.2 Hình 1.1: Sơ đồ sơ chế trà tưới thành bột trà II THỰC HÀNH Nguyên Liệu Sử dụng nguyên liệu trà xanh Camellia sinensis Hòa Chất - Chloroform - Ethyl acetate - FeCl3 Dụng Cụ - Máy ly tâm - Giấy lọc - Máy cô quay - Phễu chiết lê - Bình hứng - Cân phân tích - Tủ sấy Các bước tiến hành Giai đoạn 1: Sơ chế nguyên liệu trà xanh Lá trà thu hái trà vị trí tơm 1, Lá trà tiến hành sấy nhiệt độ 95-105oC thời gian 30-40 phút để giảm hàm lượng nước xuống 4-5% Tiếp theo nghiền trà xnah thành bột nhỏ tạo thành bột trà Kết Quả Thu Được Độ ẩm Hình 2.15: Độ ẩm sau sấy Khối lượng catechin thu 0.34g 11 BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CATECHIN THÔNG QUA HÀM LƯỢNG POLYMEPHENOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN-CLOCALTEU I LÝ THUYẾT Phương pháp Folin-cincalteu phương pháp sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tồn phần Catechin có chất Flavonol, thuộc nhóm polyphenol, cho chất polyphenol oxy hóa với thuốc thử Folin-ciocalteu tạo sản phẩm màu xanh lam Giá trị OD màu hỗn hợp tỷ lệ thuận với hàm lượng polyphenol dung dịch Căn vào cường độ màu đo máy so màu bước sóng 765nm đồ thị đường chuẩn acid gallic với thuốc thử Folin-ciocalteu xác định hàm lượng polyphenol mẫu khảo sát II THỰC HÀNH Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng để tiến hành làm chế phẩm catechin thu trước Hóa Chất - Cồn 96o - Acid gallic - Cồn tuyệt đối 12 - Thuốc thử Folin-ciocalteu dung dịch Na2CO3 bão hòa: hòa tan NaHCO3 800ml nước cất mang đun sơi Sau làm lạnh, cho thêm vài tinh thể Na2CO3 để nhiệt độ phịng tỏng 24h Sau lọc thêm nước cất 1000ml Bảo quản nhiệt độ phòng Dụng cụ - Cốc thủy tinh - Bình định mức - Đũa thủy tinh - Các loại pipet Các bước thực hành Bước 1: Chuẩn bị dung dịch sau - Na2CO3 7,5% - Methanol 40% - Acid gallic - Folin-Ciocalteu 100% (F-C) Bước 2: Chuẩn bị dung dịch Acid Gallic có dãy nồng độ sau: Nồng độ DD Cách pha lỗng nồng độ Hút 100µl GA Stock + 900µl nước cất 400 500µl dung dịch có nồng độ 0.4µg/µl + 500µl nước cất 200 500µl dung dịch có nồng độ 0.2µg/µl + 500µl nước cất 100 500µl dung dịch có nồng độ 0.1µg/µl + 500µl nước cất 50 (µg/ml) 13 500µl dung dịch có nồng độ 0.05µg/µl + 500µl nước cất 25 500µl dung dịch có nồng độ 0.025µg/µl + 500µl nước cất 12.5 500µl dung dịch có nồng độ 0.0125µg/µl + 500µl nước cất 6.25 Hình 3.1: Hút Gallic Acid Bước 3: Tiến hành đặt phản ứng sau: - Hút 200µl acid gallic (Methanol 40% mẫu blank) - Thêm 200µl F-C, vortex, đợi phút - Thêm 1600µl Na2CO3 5%, ủ tối 40oC 20 phút 14 - Tiến hành đo OD bước sóng 765nm máy quang phổ kế Hình 3.2: mẫu chuẩn bị đo OD Bước 4: Thu nhận kết dựng đường chuẩn Gallic acid cho hệ số R2>0.95 Bước 5: Tiến hành tương tự bước 2-3 mẫu Catechin với nồng độ tương ứng 0.1mg/ml pha loãng bậc xuống 0.00625 mg/ml Nồng độ DD Cách pha loãng nồng độ 441µl dung dịch có nồng độ 0.1133µg/µl + 559µl nước cất 50 500µl dung dịch có nồng độ 0.05µg/µl + 500µl nước cất 25 500µl dung dịch có nồng độ 0.025µg/µl + 500µl nước cất 12.5 500µl dung dịch có nồng độ 0.0125µg/µl + 500µl nước cất 6.25 500µl dung dịch có nồng độ 0.00625µg/µl + 500µl nước cất 3.125 (µg/ml) 15 500µl dung dịch có nồng độ 0.003125µg/µl + 500µl nước cất 1.5625 Bước 6: Tiến hành đặt phản ứng sau: - Hút 200µl Catechin (Methanol 40% mẫu blank) - Thêm 200µl F-C, vortex, đợi phút - Thêm 1600µl Na2CO3 5%, ủ tối 40oC 20 phút - Tiến hành đo OD bước sóng 765nm máy quang phổ kế Hình 3.3: mẫu Catechin chuẩn bị đo OD Bước 9: Lựa chọn nồng độ catechin cho kết OD nằm giới hạn đường chuẩn Gallic acid dựng bước Căn vào đường chuẩn tính tốn hàm lượng polyphenol tổng số theo cơng thức: polyphenol tổng= X∗V ∗hệ số phalỗng m Trong đó: X: nồng độ polyphenol mẫu đo V: thể tích Catechin ban đầu (ml) m: Khối lượng catechin pha dung dịch stock (g) Hàm lượng polyphenol tổng(mg/g) GAE III KẾT QUẢ Đường chuẩn Gallic acid 16 Y = 0.0012x + 0.01312 R2 = 0.6843 Kết đo OD mẫu Catechin BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA CỦA CATECHIN THƠNG QUA NĂNG LỰC KHỬ SẮT I LÝ THUYẾT Khả khử catechin đánh gia khả khử potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) thành dạng potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]) Phản ứng Fe3+ FeCl3 với potassium ferroanide tạo thành phức sắt (K3[Fe(CN)6]3) màu xanh dương Độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có mẫu Đo độ tăng cường độ màu bước 17