Đang tải... (xem toàn văn)
Các phương pháp tách chiết các hợp chất hưu cơ từ thực vật Chương 1: Kỹ thuật chiết tách hợp chất hữu cơ khỏi cây cỏ Chương 2: Phương pháp nhận danh các loại hợp chất tự nhiên Chương 3: Phương pháp sắc ký cột Chương 4: Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chương 5: Phương pháp sắc ký trao đổi ion Chương 6: Phương pháp sắc ký gel Chương 7: Phương pháp sắc ký khí (GC) Chương 8: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Chương 9: Điện di
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ Hồ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN N G U Y Ễ N KIM PHI PH ỤN G PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP HƠP c h ấ t h ữ u c ị NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIẠ TP H CHÍ MINH - 2007 GT 01 HíVl DHQG.HCM.07 ™tM0í/47-72®HQGTPHCM H.GT.491-07(T) 3£ínk tăng, PGS-TS Nguyễn Ngọc Sương > Người kính u, người hướng dẫn tơi theo đường hoá học hợp chất tự nhiên LỜI NÓI ĐẦU * * * Sách “Phương pháp cồ lập hợp chất hữu cơ” biên soạn làm giáo trình cho chương trình cao học Bộ mơn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Sách hữu ích cho sinh viên năm cuối bậc đại học, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Hoá học Sinh học, nghiên cứu viên Viện Hoá Sinh Hố cần lập hợp chất hữu từ cỏ, từ phản ứng hóa học từ sinh khối Việc sử dụng kỹ thuật sắc ký khác nhằm cô lập hợp chất hữu hoạt động mà tất làm việc phịng thí nghiệm hố sinh phải tiến hành thường xuyên, nhiên Việt Nam sách trình bày loại kiến thức cịn Sách trình bày phần kiến thức cung cấp kiến thức chuyên sâu phương pháp sắc ký, vấn đề có thêm hình ảnh ninh hoạ để người đọc dễ hiểu Sách gồm có chín chương chương phụ lục: Chương 1: Kỹ thuật chiết tách hợp chất hữu khỏi cỏ Chương 2: Phương pháp nhận danh loại hợp chất tự nhiên Chương 3: Phương pháp sắc ký cột Chương 4: Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chương 5: Phương pháp sắc ký trao đổi ion Chương 6: Phương pháp sắc ký gel Chương 7: Phương pháp sắc ký khí (GC) Chương 8: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chương 9: Điện di Biên soạn sách lĩnh vực chuyên sâu, đại Việt Nam chưa có nhiều sách kỹ thuật nên chúng tơi gặp khơng khó khăn thuật ngữ Những thuật ngữ sử dụng sách ỉà theo "Từ điển Kỹ thuật tổng hợp Anh - Việt" Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 1991 Với phần lớn thuật ngữ, cố gắng phiên dịch có ghi lại ngoặc đơn ngũn mẫu tiếng Anh, cịn số thuật ngữ đành để nguyên dạng tiếng Anh Các hình ảnh hình ảnh minh họa Đây lần biên soạn sách nên chứng khố tránh khỏi sai sót, mong nhận ý kiến đóng góp q báu để chúng tơi hồn thiện lần tái Cuối chứng xin chận thành cám ơn PGS-TS Nguyễn Ngọc Sương, người cô kính yêu Tâm gương lao động khoa học miệt mài cô kim chĩ nam để dõi theo mà tiến tới khoa học Cô cho nhũng lời khuyên quý báu sống công tác giảng dạy; cô dành thời để nghỉ ngơi mà đọc giúp thảo, giúp tơi kịp thời chỉnh sửa, hồn tâ't Xỉn chân thành cảm ơn Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2007 TÁC GIẢ Nguyễn Kim Phỉ Phụng CÁC PHƯỚNG PHÁP CÔ LẬP HdP CHẤT H0U Cơ Chương KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH Hộp CHẤT Tự NHIÊN RA KHỎI CÂY Cỏ Hợp chất tự nhiên (natural Products), phân tử sinh học tự nhiên (biological molecule), chất biến dưỡng thứ cấp (secondary metabolite), có trọng lượng phân tử nhỏ (M < 1500 amu), tạo thể sinh vật Chất biến dưỡng thứ cấp cần thiết nhiều khơng cần thiết cho sống sinh vật, điều khác với nhữhg hợp chất đại phân tử protein, acid nucleic, polisacarid nhữtig hợp chất thiết cần phải có cho sống sinh vật Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất xếp thành nhóm (group) khác Việc phân loại hợp chất thành nhóm thường định nghĩa nhất, ranh giới nhóm thường khơng rõ ràng Người ta nhận thấy chất biến dưỡng thứ cấp thường hay diện lồi sinh vật đặc trưng Chất biến dưỡng thứ cấp đóng vai trị chất gây chán ăn (antifeedants), chất dẫn dụ giới tính (séx attractants), chất kháng sinh (antibiotic agents) để bảo vệ sinh vật khơng bị lồi khác làm hại , nhiều chất biến dưỡng thứ cấp khơng có hoạt tính sinh học có chưa biết đến Các chất biến dưỡng thứ câp thực vật thường thuộc nhóm sau: alcaloid, quinonoid, steroid, terpenoid (bao gồm tinh dầu terpen thấp), iridoid, ílavonoid, coumarin, glycosid Nếu nhữhg hợp châ't đại phân tử có trọng lượng phân tử lớn, tính chất hóa học tương đối đồng nhất, người ta đề xuất số qui trình CHƯƠNG tổng quát để chiết tách lập chúng, hợp chất tự nhiên có trọng lượng phân tử nhỏ, tính chất hóa học đa dạng, khác biệt, nên khơng thể có qui trình tổng quát cố thể áp dụng chung cho tất nhóm, mà loại nhóm phải cố số phương pháp khác nhau, cần phải khảo cụ thể Mục đích việc chiết tách, lập hợp chất tự nhiên Khi nhà hóa học chọn nghiên cứu lồi cây, người muốn hiểu biết số điều sau - Khảo sát thành phần hóa học mới, trước chưa có nghiên cứu xem chất có hoạt tính sinh học khơng? Muốn biết điều cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết > 95% khảo sát cấu trúc hóa học phương pháp quang phổ đại - Cần cố thêm lượng mẫu hợp chất biết rõ cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm hoạt tính sinh học chất Nếu việc thử nghiệm cho kết hấp dẫn xét xem tổng hợp hóa học để có sấ lượng nhiều - Tìm, hiểu hợp chất biết xem chất sản sinh từ phận sinh vật (sự sinh tổng hợp) - Tim hiểu khác biệt nhữhg chất biến dưỡng thứ câ'p sản sinh từ nguồn tự nhiên không điều kiện sinh thái: thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật họ (famiỉy), chi (genus), loài (species) mọc ỏ hai nơi có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác có chứa hợp chất tự nhiên chất cố hàm lượng hay không? Các nghiên cứu Hedyotis corymbosa L Hedyotìs dỉffusa L mọc Hồng Kông mọc Việt Nam cho biết hai lồi có chứa hợp chất giống hàm lượng phần trăm chất cố khác nhiều \ K Ỹ THUẬT CHIẾT TÁCH H ộ p CHẤT T ự NH IÊN H A KHỎI C  Y c ị Q TRÌNH KHẢO SÁT HĨA - THựC VẬT CỦA MỘT CÂY Q trình khảo sát hố - thực vật loài thường theo giai đoạn sau 1.1 Lựa chọn nghiên cứu loài (của họ)[1] Các nhà nghiên cứu định làm việc loài họ tuỳ vào mục đích lựa chọn trước Việc lựa chọn tuỳ thuộc nhiều vào tài liệu tham khảo phương tiện sẵn có liên kết phịng thí nghiệm Các tài liệu tham khảo liệu tin học NAPRALERT (phần mềm phải mua) cho biết thơng tin hóathực vật, đặc điểm thực vật, hoạt tính sinh học hợp chất cụ thể, tất thơng tin cố thể có vùng địa phương, tùng quốc gia Luôn cần phải có thơng tin từ Chemical Abstracts (Viết tắt C.A.) cho biết tổng quát nghiên cứu giới Tuy nhiên, thơng tin CA cho biết tóm tắt kết báo, sau đọc, nhận thây thơng tin cần thiết người đọc cần tìm báo gốc để có đầy đủ chi tiết (CA cho biết báo gốc đăng tạp chí nào) Thơng thường sau nghiên cứu ưên tài liệu mà nhận thấy chọn khảo sát chưa có tác giả ưên giới nghiên cứu, nghĩa hồn tồn khơng có thơng tin thành phần hóa học nên tra khảo thành phần hóa học khác chi với khảo sát Các nghiên cứu cho thấy có đặc điểm “Hóa - Thực vật” (Chemotaxonomy) nghĩa chi (hoặc họ) chứa hợp chất giống hợp chất có loại khung sườn Thí dụ chi Hedyotis, thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) thường chứa hợp chất acid triterpen với khung sườn ursan oleanan Các thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Táo (Rhamnaceae), họ Cà phê (Rubiaceae) thường chứa hợp chất antraqúinon cần biết antraquinon có tính thăng hoa Họ Cúc (Asteraceae) thường chứa hợp chất sesquiterpen lacton CHƯƠNG Sau chọn làm việc lồi đó, cần phải thu thập mẫu 1.2 Xác định tên khoa học cho Rất nhiều trường hợp với loài nhưtig lại có nhiều tên gọi khác tùy theo địa phương Một lồi có nhiều tên địa phương khác có tên khoa học (một số có hai tên khoa học) Thí dụ Cúc thiên Elephantopus scaber L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) cịn có tên khác c ỏ lưỡi mèo, Chân voi nhám; trước thu hái mẫu cần phải nhờ nhà thực vật nhiều kinh nghiệm xác định tên khoa học cho Muốn cần phải cung cấp cho nhà thực vật mẫu tươi, nguyên, với đầy đủ phận hoa, lá, thân, rễ, nhiều cần phải khảo sát hết tất phận cây, phận hoa, rễ, xác định tên khoa học cho Các nghiên cứu cho thấy tất thay đổi cao độ vùng mọc, tuổi cây, khí hậu, thổ nhưỡng có ảnh hưỏng đẹn hàm lượng hợp chất cây, vài trường hợp có ảnh hưởng đến loại hợp chất sinh tổng hợp Điều truyền tụng từ lâu dân gian qua câu “Cây cam trồng Giang Nam ngọt, đem trồng Giang Bắc chua” Mỗi phận chứa nhũng chất biến dưỡng thứ cấp khác nhau, thí dụ ílavonoid thường diện hoa số loài Các aỉcaỉoid tropan diện rễ, sesquiterpen lacton tinh dầu thường diện hạch tiết lá, vỏ thân (Cho dù giả sử có tài liệu cho biết trước phận chứa loại hợp chất nên có khảo sát sơ phận riêng biệt hoa, lá, thân, r ễ để so sánh định tính / định lượng diện hợp chất để chọn phận phù hợp cho nghiên cứu) Do lý nêu trên, viết báo cáo cần ghi rõ thu hái địa phương nào, vùng mọc có cao độ bao nhiêu, thời tiết loại đất nơi mọc, thời gian thu hái, độ tuổi Phải ghi rõ tên nhà thực vật (và quan mà nhà thực vật công tác) xác định tên khoa học cho cây; mẫu lưu giữ viện bảo tàng thực vật địa phương quán 10 PHỤ LỤC Hình 11: c íu trúc hóa học virut viêm gan c virut HIV Virut HIV có dạng hình cầu, gồm vỏ bao chung quanh nhân nang (capside) có dạng hình tù hình nón cụt nhân có RNA vịrut với phân tử cần thiết để bảo vệ để xúc tiến lây nhiễm Vỏ bao (envelope) virut: giống màng tế bào lipid, có mang nhiều “cây đinh”, v ỏ bao ký hiệu Pr gplỏo (env), tiền chất (precursor) glycoprotein vỏ bao Các protein vỏ bao đóng vai trị quan trọng trinh virut HIV gắn vào, thâm nhập vào bên tế bào chủ Theo qui ước, ký hiệu “gp” “p” để protein có gắn phân tử đường (glycqprotein) Con số ghi liền sau chữ gp chữ p để trọng lượng biểu kiến, tính kilodalton, protein ^ Pr gplóO (env), gồm Protẹin gpl20: phần đầu hình đinh, hướng bên vỏ bao Protein gp41: protein xuyên màng, gắn phần đầu đinh vào vỏ bao * P r p55 (gag): tiền chất protein gag pl7: protein bao bọc phía bên lớp vỏ p24: protein capside pl5, p7, p6: protein nucleocapsid liên kết chặc chẽ với với RNA virut 514 PHỤ LỤC Pr pl80 (gag-poỉ): tiền chất ỉà protein gag poỉ retrotranscríptase (p66-p51) integrase (p32) protease (pl2) Vậy, protein tìm thấy virut tạo thành từ tiền chất (polyprotein) Pr gplỏo (env), Pr p55 (gag) Pr pl80 (gag-poỉ); tiền chất bị protease cắt thành protein khác I ẽĩĩv I I gag I Ị~ pol X(PrgplôO ) (Pr pl 80) IEuĩSD gp120 pn p24 - 8P4-1 P.15 (Hyb) Tầ Protease (p l2 ) Reirotrans-criptase (p66-p51) Integrase (p32) 5.3 Thử nghiệm tổng quát để phát kháng thể Muốn chẩn đốn bệnh nhân có bị phơi nhiễm HIV, người ta tìm diện kháng thể máu 2-3 tháng (đôi thời gian lâu nữa) sau bị nghi bị sơ nhiễm Đó diện kháng thể chống lại protein khác virut, thường gen mã hoá từ gag, pol chủ yếu env Các thử nghiệm tổng quát để phát kháng thể: thử nghiệm enzym kháng thể dùng để phát huyết tương diện khầng thể kháng HIV khơng phân biệt loại kháng thể nào, thực sau Tác chất sử dụng thử nghiệm protein virut cho gắn lên hạt rắn siêu mịn (pha tĩnh rắn) Các protein virut cỏ thể có cách ỉấy từ mơi trường nuôi cấy tế bào tổng hợp gen tổng hợp hóa học PHỤ LỤC Huyết tương thử nghiệm (có chứa khơng chứa kháng thể) đặt vào mơi trường thử nghiệm, có chứa kháng thể đặc hiệu HỈV, kháng thể dính nối vào kháng ngun cố định Sau rửa đề loại bỏ kháng thể khơng dính nối, kháng thể thứ nhì cho thêm vào -đâv loại kháng thề kháng-kháng thể người, ghép cố định vào enzym Bấy giờ, tởi lượt gắn dính vào kháng thể-kháng HỈV cố định vào pha tĩnh rắn Sau rửa lần thứ nhì, hợp chất có khả tạo màu cho thêm vào Enzym tác dụng với hợp chất có Ịchả tạo màu đ ể thành phức có màu Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ kháng thể diện huyết tương Có nhiều kỹ thuật khác nhau, chúng khác điểm như: cấu tạo pha tĩnh rắn, kháng nguyên cố định, kháng thể thứ nhì, hợp chất có khả tạo màu Để đạt độ tin cậy cao, cần phải thực qua hai thử nghiệm với hai loại tác chất khác Từ năm 1987, người ta sử dụng loại thử nghiệm phát đồng thời phơi nhiễm HIV-1 HIV-2 Tác chất sử dụng thử nghiệm (các kháng nguyên) peptid tổng hợp, tương ứhg với vùng ngắn gp41 (mã hoá từ env) Đây phản ứng tổng quát, kết âm tính, ngưng giai đoạn này, kết dương tính, cần thực thêm với thử nghiệm Westem-blot 5.4 Thử nghiệm Western-blot_(thử nghiệm khẳng định) Thử nghiệm xác đặc hiệu cho thấy diện khậ^ìg thể khác Trước tiên, protein virut (sử dụng tác chất) tách điện di gel tuỳ vào trọng lượng phân tử chúng Tiếp theo, thực chuyển điện di (electrotransíer) để chuyển protein dãy gel sang nitrocellulose Huyết tương cỏa người thử nghiệm áp dụng lên nitrocellulose Sự kết dính khảng thể có huyết tương người với kháng nguyên có dãy cellulose phát phản ứng enzym tạo phức có màu trình bày phần 5.3 Kết thử nghiệm trình bày ký hiệu: (-) (+) (++) Thí dụ với HIV-1 cần có diện protein: gplỏo, gpl20, p66, p55, p51, gp41, p32, p24, pl7 Một kết chắn dương tính tất 16 PHỤ LỤC dãy nêu xuất Tùy theo tổ chức quốc tế mà tiêu chuẩn để xem dương tính có thay đổi Theo trung tâm kiểm sốt bệnh Atlanta, huyết tương dương tính phải chứa phải có dãy băng gpl60.120 gp41 kết hợp với dãy băng đặc trưng protein env, gag, pol (Như thế, nghĩa phải có dãy gpl60.120 dãy p24) Các kết thực đơi khó xác định dương tính miễn dịch bệnh nhân, bệnh nhân mắc phải SIDA phải trãi qua nhiều giai đoạn mà có giai đoạn khó xác định, cần phải có xác định quan chuyên ngành Có dãy băng xác định kháng thể kháng HIV-1 có dãy băng khác xác định kháng thể kháng HIY-2 T iề n c h ấ t Proteịịi cấu trúc P ro te in enzym P r g p 160 -m m g p !2 p66 P r p55 p51 gp41 p32 p24 p !7 H ình 12: Westem'blot: Các proỉein vỉrut, sử dụng tác chất, õược tách diện di gạl tuỳ vào trọng lượng phân tử chúng Các dãy màu đen quan sát trẽn gel tương ứng với kháng thể (cố huyết tương thử nghiỆm) nhận dược protein antlgen HIV Ký hiệu: Pr: tiền chất, p: protein, gp: glycoprotein Các số sau chữp, gp trọng lượng phân tử biểu kiến tính lcĐa 517 MỤC LỤC Trang Chương 1: KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH Hộp CHẤT Tự NHIÊN RA KHỎI CÂY C ỏ Q trình khảo sát hố-thực vột cùa c ầ y II Lựa chọn nghiên cứu loài họ ! Xác định tên khoa học cho 10 1.3 Xử lý mẫu sau thu h i 12 Dung môi để chiết tách hợp chất khỏi mẫu c â y .14 1.5 Lựa chọn qui trình để chiết tách hợpl chất khỏi mẫu c â y 20 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất khỏi c â y 28 2.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng 28 2.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng 34 2.3 Các chất gây trở ngại cho việt chiết tách Chất giả tạ o 54 2.4 Một số thủ thuật cô lập hợp chất hữu 64 Phân tích sơ hóa-thực vật số cao chiết 70 3.1 Tìm hiểu số đặc điểm cao c h iế t .70 3.2 Phân tích hố-thực vật cao c h iế t 73 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NHẬN DANH CÁC LOẠI HỢP CHẤT _ Tự NHIÊN _ Alcaloid „80 1.1 Đại cương 80 1.2 Phương pháp định tính diện aỉkaỉoỉd bột 82 1.3 Các thuốc thử để định tính alkaloid 83 ] Phương pháp chiết tách alkaloid khỏi 85 Fiavonoid 91 2.1 Đại cương 9] 2.2 Các thuốc thử để định tính điện ílavonoid 93 519 2.3 Phương pháp chiết tách Aavorioid khỏi 95 Sesquiterpen lacton 98 3.1 Đại cương 98 3.2 Các thuốc thử đ ể định tính sesquiterpen ỉacton 99 3.3 Phương pháp chiết tách sesquiterpen lacton khỏi c â y 103 Terpenoid steroid 103 4.1 Đại cương 103 4.2 Các thuốc thử để định tính terpẹnoid, steroid 111 4.3 Phương pháp chiết tách terpenoid, steroid khỏi 113 Chất b é o 116 5.1 Đại cương 116 5.2 Các thuốc thử đ ể định tính diện chất b é o 122 5.3 Phương pháp chiết tách chất béò khỏi c â y 124 Hợp chất glycosid 125 Đại cương 125 6.2 Phương pháp chiết tách glycosid khỏi c â y 127 6.3 Phương pháp thủy giải glycosid để xác định phần đ n g 128 6.4 Các thuốc thử để định tính phần đường 132 6.5 Các thuốc thử để định tính saponin 135 6 Các thuốc thử để định tính glycosid tim 137 6.7 Các thuốc thử để định tính aglycon iridoid 138 Hợp chất phenol , 138 7.1 Đại cương 138 7.2 Các thuốc thử đ ể định tính diện phenol 145 7.3 Phương pháp chiết tách phenol khỏi 147 Chường 3: SẮC KÝ CỘT _ _ Các nguyên tắc kỹ thuật sắc k ỷ 151 l I Phân loại sắc ký theo chẳ't hai pha sử dụng 153 20 1.2 Phân loại sắc ký theo chất tượng xảy trình tách c h ẩ t 154 1.3 Phân loại sắc ký theo cấu h ình 159 Các loại pha tĩnh sử dụng sắc ký 165 2.1 Silica g e l 166 2.2 A lum ina 172 2.3 Kieselguhr-Celite .•••• 173 2-4 Bột giây 174 2.5 G e l 175 Sắc ký cột h .160 3.1 Lựa chọn chất hấp thu dung môi khởiđầu giải ly 181 3.2 Tỉ lệ lượng mẫu chất cần tách đốivới kích thước c ộ t 183 3.3 Nạp chất hấp thu vào cột 185 3.4 Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký 187 3.5 Các kỹ thuật giải ly chất khỏi cộ t 189 3.6 Dung môi giải ly kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung mơi giải ly 191 3.7 Vận tốc giải ly c ộ t 194 3!8 Theo dõi trình giải ly cột 3.9 195 Tổng kết trình sắc ký cột 196 3.10 Các phương pháp xác định câu trúc hoá học hợp chất 200 Một vài kỹ thuật sắc ký cột khác 202 4.1 Sắc ký cột k h í 203 4.2 Sắc ký chớp nhoáng 204 4.3 Sắc ký nhanh-cột k h ô 206 Chường 4: SẮC KỶ LỚP MÒNG Kiến thức tổng quát sắc kỷ lớp mỏng 213 l I So sánh sắc ký lớp mỏng với kỹ thuật sắc ký k h c 214 1.2 Sắc ký hấp thu j |5 216 Các chất hấp thu dùng sẩc ký lớp m ỏng 219 1.4 Chất cho thèm v o 224 1.5 Dung môi giải l y 224 Các chuẩn bị trước sắc ký Iđp mỏng 228 2.1 Chuẩn bị vi q u ả n 228 2.2 Châm mẫu lên m ỏ n g 229 2.3 Giải ly m ỏ n g 231 Thực hành tráng sắc kỷ lóp mỏng 234 3.1 Chuẩn bị tráng m ỏ n g 324 3.2 Các kỹ thuật tráng m ỏ n g 235 3.3 Hoạt hoá chất hấp th u 238 3.4 Hiện hình vết sau giải l y 239 Các công dụng sắc ký lớp mỏng 244 4.1 Để công bố đặc điểm hợp chất vừa chiết tách cô lập 244 4.2 Đê’ kiểm tra xem hai hợp chất co giống 245 4.3 Để tìm hiểu sơ tính chất mẫu chất cần khảo sá t 247 4.4 Đê’ chuẩn bị cho việc sắc ký c ộ t 249 4.5 Để theo dõi diễn tiến phản ứng hoá h ọ c 251 Để kiểm tra biết hợp chất kem b ề n 252 4.7 Để cô lập hợp chất 252 Sắc ký lớp mỏng số hộp chất hữu 255 5.1 Sắc ký lớp mỏng amino acid 255 5.2 Sắc ký lớp mỏng peptid, protein 258 5.3 Sắc ký lớp mỏng carbohydrat 261 5.4 Sắc ký lớp mỏng lip id .266 5.5 Sắc ký lớp mỏng ílavonoid 272 5.6 Sắc ký lớp mỏng carotenoid 5.7 Sắc ký lớp mỏng clorophyl 279 5.8 Sắc ký lớp mỏng q u in o n 280 22 276 Chường 5: SẮC KÝ TRAO Đổl ION _ Các kiến thức sắc ký trao đổi ion 284 1.1 Các đặc điểm tổng quát nhựa trao đổi io n 284 1.2 Lý thuyết trao đổi io n 285 1.3 Các nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi io n 288 Một số kiến thức thực nghiệm nhựa trao đổi io n 293 2.1 Chọn loại nhựa trao đổi ion phù h ợ p 293 2.2 Thí nghiệm để biết số lượng nhựa cần th iế t 298 2.3 Chọn loại dung dịch đ ệ m 301 2.4 Làm trương nở nhựa trước thực nghiệm 302 2.5 Tái tạo nhựa Tồn trữ nhựa 304 Sắc kỷ trao đổi ion, sử dụng cột becher 305 3.1 Lựa chọn kích thước cột sắc ký 3.2 Nhồi nhựa vào cột Nạp mẫu chất vào đầu c ộ t 307 305 3.3 Giải ly cột trao đổi i o n 308 3.4 Vận tốc giải ly c ộ t 310 3.5 Sắc ký trao đổi ion sử dụng b e c h e r .310 Một số áp dụng sắc ký trao đổi ion 312 Các hợp chất anion 313 4.2 Các hợp chất cation 315 Chướng 6: SẮC KỶ GEL Nguyên tắc sắc ký g e f 323 Nguyên liệu làm thành hạt ge| 325 2.1 Gel dextran 326 2.2 Gel polyacrylamid 330 G e l s t y r a g e l 331 Các nguyên tắc thực hành sắc ký gel 332 Ị 523 3.1 Nhồi gel vào cột • 332 3.2 Nạp mẫu châ't vào đầu cột 333 3.3 Triển khai sắc k ý 334 3.4 Gel Sephadex L H -2 334 Sắc ký lớp mỏng vối kỹ thuật sắc kỷ gel 339 4.1 Kích thước tâm g e l 339 4.2 Lượng gel cần để tráng ! 4.3 Phương pháp triển khai mỏng g e l 340 339 Các ứng dụng sắc ký gèl 342 5.1 Đ ể xác định trọng lượng đại phân tử 342 5.2 Đ ể tách hỗn hợp thành nhóm hợp chất riêng rẽ 347 5.3 Đ ể loại bỏ muối khỏi hợp chất dung dịch 347 5.4 Đê’ loại bỏ chất m àu tạp bẩn khỏi hợp chất khảo sát 348 Chường 7: SẮC KỶ KHÍ (GC) _ _ Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu qùả tách chất sắc ký khí 356 1.1 Á p suất hợp ch ất 356 1.2 Đặc trưng loại cột sắc ký khí 359 1.3 Đ ộ phân g iả i ; 360 Các phận máy sắc ký k h í 363 2.1 Khí mang 363 2.2 B ộ phận đưa mẫu vào m áy 365 2.3 Cột sắc ký k h í 366 2.4 B ộ phận phát tín h i ệ u ! 367 Nguyên liệu làm pha tĩnh trohg sắc kỷ kh í .368 3.1 Loại cột nhồi sắc ký khí-lỏng 368 3.2 Loại cột mao quản hỏ sắc ký k hí-lỏn g 373 3.3 Loại cột sắc ký khí-rắn 375 524 Các loại đầu đị máy sắc ký khí 380 4.1 Đầu đò dẫn nhiệt 380 4.2 Đầu dị ion hóa lửa 382 4.3 Đầu dò bắt điện t 384 4.4 Đầu dò nitrogen-phosphor - 387 4.5 Đầu dò trắc quang lử a 388 4.6 Đầu dò quang ion h o 389 4.7 GC-MS GC-IR 391 Chuẩn bị mẫu ỉrưổc phân tích sắc ký k h í 394 5.1 S ự s ily lh o 395 5.2 Sự acyl h o 5.3 Sự alkyl hóa, ester hơá ; .396 396 Các yếu tố ảnh hưdng đến việc tách mẫu .397 Lựa chọn loại cột 398 6.2 Lựa chọn nhiệt độ, chương trình nhiệt đ ộ .399 6.3 Một số vân đề thường gặp qụá trình sắc ký khí .400 Các ứng dụng sắc ký khí 402 ChƯdng 8: SẮC KỶ LÒNG HIỆU NĂNG CAO (HPỊ.C) _ Các phận máy H P LC 409 1.1 Bình chứa dung mơi giải ly cột 409 1.2 Máy bơm 412 1.3 Cột sắc k ý 412 mẫu vào máy 412 1.4 Bộ phận chích 1.5 Đầu d ị Các loại pha tĩnh để nhối cột sắc kỷ HPLC 413 2.1 Pha thường i 414 2.2 Pha tạo n ố i 416 Các loại đầu dò HPLC , 426 525 3.1 Đầu dò đo hấp thu tia tử n g o i 428 3.2 Đầu dò mạng diod q u a n g 429 3.3 Đầu dò phát huỳnh q u a n g 431 3.4 Đầu dị sơ' khúc x 432 3.5 Đầu dò đo độ dẫn đ iệ n 433 3.6 Đầu dò am per k ế .435 3.7 Đầu dò L C -IR .438 Đ ầ u đ ò L C -M S 439 3.8.1 Giao diện tia n h iệt 442 3.8.2 Giao diện ion hố áp suất:khí q u y ể n .442 3.8.3 Giao diện phun io n 444 38.4 Giao diện chùm tia h t 448 Điểu chế hợp chất phân tích thành chất dẫn xuất 448 4.1 Tạo dẫn xuất trước hợp chất vào cột sắc ký 449 4.2 Tạo dẫn xuất sau hợp chất khỏi cột sắc ký 450 Chường 9: ĐIỆN DI Các kiến thức điện d i 455 1.1 1.2 Căn vật lý điện d i 455 Các yếu tố ảnh hưởng lên vận tốc điện d i 458 1.2.1 Điện trường 458 1.2.2 Dung dịch đ ệ m 458 1.2.3 Môi trường châ't m a n g 459 1.3 Hiện hình gel điện d i 464 1.4 Điện di với pH liên tục Đ iện di với pH không liên tụ c 465 1.5 Cô lập hợp chất nhờ điện d i 468 Điện di làm biến tính mẫu phân tích .468 2.1 Điện di với g el SDS polyacrylamid 468 2.2 Điện di với gel SDS polyacrylamid điều kiện khử 471 Điện di hộí t ụ 473 3.1 Câu trúc chất điện ly lưỡng tính * 474 526 3.2 Điện di đo điểm đẳng đ iệ n 476 3.3 Sắc ký hội tụ 478 Điện di SD S-PA G E hai chiểu 480 4.1 Nguvên tắc SDS-PAGE hai chiều .481 4.2 Các thiết bị sử dụng SDS-PAGE hai chiều 481 Kỹ thuật diện th ấ m 482 5.1 Thiết bị sử dụng kỹ thuật điện thấm 483 5.2 Các ứng dụng kỹ thuật điện thấm 483 Điện di miễn dịch 484 6.1 Kỹ thuật Dot-blotting 485 6.2 Western blotting 488 Phụ lục 492 Mục ỉục 519 527 PHƯƠNG PHÁP CỘ LẬP HỢP CHAT HỮU c Nguyễn Kim Phi Phụng NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H CHÍ MINH Khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP HCM ĐT: 242 181,7 242 160 + (1421,1422, 1423, 1425,1426) Fax: 242 194 - Email: vnuhp@ vnuhcm.edu.vn *** Chịu trách nhiệm xuất PGS T S N G U Y Ễ N Q U A N G ĐlỂN Biên tập T R Ầ N VẶN T H Ắ N G Sửa in TH Ù Y D Ư ƠNG Trình bày bìa LÊ N G U Y Ễ N Đơn vị/Người liên kết Trường ĐH Khoa học tự nhiên r- ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh In 500 cuốn, khổ 16 X 24cm Sô' đăng ký kế hoạch xuất bản: 732-2006/CXB/47-72/ĐHQGTPHCM Quyết định xuất số: 448/QĐĐHQGTPHCM ngày 08/6/2007 In Xưởng in Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG TP HCM, nộp lưu chiểu tháng năm 2007