Biểu B1-2a-TMĐTCN 08/2017/TT-BKHCN THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CẤP QUỐC GIA1 I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài 1a Mã số (được cấp Hồ sơ trúng tuyển) Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin Thời gian thực hiện: 20 tháng (Từ tháng 04/2019 đến tháng 12/2020) Cấp quản lý Quốc gia Tổng kinh phí thực hiện: 8.547,38 triệu đồng, đó: Nguồn Kinh phí (triệu đồng) - Từ Ngân sách nhà nước - Từ nguồn ngân sách nhà nước Đề nghị phương thức khoán chi: Khoán đến sản phẩm cuối 0,0 Khoán phần, đó: - Kinh phí khốn: 5.185,49 triệu đồng - Kinh phí khơng khốn: 3361.89 triệu đồng Thuộc Chương trình (Ghi rõ tên chương trình, có): Nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng Mã số: KC.10/1620 Lĩnh vực khoa học Tự nhiên; Nông nghiệp; Kỹ thuật công nghệ; Y, dược Bản Thuyết minh đề tài dùng cho hoạt động nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ thuộc lĩnh vực khoa học nêu mục Thuyết minh Thuyết minh trình bày in khổ A4 Chủ nhiệm đề tài Họ tên: Nguyễn Văn Khải Ngày, tháng, năm sinh: 10/2/1967 Giới tính: Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị/ Trình độ chun mơn: Phó Giáo sư, Tiến sĩ, Bác sĩ Chức danh khoa học: Giảng viên Chức vụ: Hiệu trưởng, Trường Đại học Y Dược Hải Phịng, Bộ Y Tế Tên tổ chức cơng tác: Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng Địa tổ chức: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngơ Quyền, Hải Phịng Điện thoại: 0313 731 907 Fax: 031 733315 E-mail: nvkhai@hpmu.edu.vn Địa nhà riêng: số 9/102 Cát Bi, Hải An, Hải Phòng Mobile: 0912607957 Thư ký khoa học đề tài Họ tên: ThS Nguyễn Thị Minh Ngọc Ngày, tháng, năm sinh: 21/02/1978 Học hàm, học vị/ Trình độ chun mơn: Chức danh khoa học: Thạc sĩ Chức vụ: Giảng viên Tên tổ chức công tác: Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng Địa tổ chức: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngơ Quyền, Hải Phịng Điện thoại: 0313.733.434 Fax: 031 733315 E-mail: ntmngoc@hpmu.edu.vn Nhà riêng: 12/175 Nguyễn Đức Cảnh, Lê Chân, Hải Phòng Mobile: +84.934.433.789 10 Tổ chức chủ trì đề tài Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Điện thoại: 031.3731907 Fax: +84-31-3731525 E-mail: contact@hpmu.edu.vn Website: http://hpmu.edu.vn Địa chỉ: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngơ Quyền, Hải Phịng Họ tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Văn Khải Số tài khoản: 3713 cấp I, mã số sử dụng ngân sách: 1057278 Kho bạc Nhà nước: Hải Phòng Tên quan chủ quản đề tài: Bộ Y Tế 11 Các tổ chức phối hợp thực đề tài (nếu có) Tổ chức 1 : Học viện Quân y Tên quan chủ quản: Bộ Quốc phòng Điện thoại : 069566100 Fax : 04.6884779 Địa chỉ: 160 Phùng Hưng – Hà Đông – Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: Thiếu tướng, GS.TS Đỗ Quyết Số tài khoản: 931.02.001 Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Hà Đông Tổ chức 2 : Công ty Vắcxin Sinh phẩm số (VABIOTECH) Nam/ Nữ: Nữ Tên quan chủ quản : Bộ Y Tế Điện thoại: 04) 9717710 - 9717712 / # 104 Fax: (04) 9717711 Địa chỉ: Yersin, Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: TS Đỗ Tuấn Đạt Số tài khoản: 311.11.002381 Ngân hàng: TMCP Sài Gịn Thương Tín Ngân hàng: Khoa Bạc Nhà nước Hai Bà Trưng, Hà Nội 12 Cán thực đề tài (Ghi người có đóng góp khoa học thực nội dung thuộc tổ chức chủ trì tổ chức phối hợp tham gia thực đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ lập danh sách theo mẫu có xác nhận tổ chức chủ trì gửi kèm theo hồ sơ đăng ký) TT Họ tên, Chức danh thực đề học hàm học vị tài Tổ chức công tác PGS.TS Nguyễn Văn Khải Chủ nhiệm đề tài ThS Nguyễn Thị Minh Ngọc Thư ký đề tài GS.TS Phạm Văn Thức Thành viên PGS.TS Phạm Minh Khuê Thành viên ThS Nguyễn Thị Thanh Bình Thành viên TS Phạm Thị Thu Trang Thành viên TS Nguyễn Bảo Trân Thành viên TS Nguyễn Thị Thu Thảo Thành viên Trường ĐH Y Dược Hải Phịng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng Trường ĐH Y Dược Hải Phòng TS.BS Nguyễn Văn Chuyên Thành viên Học viện Quân y 10 PGS TS Hồ Anh Sơn Thành viên Học viện Quân y 11 ThS Nguyễn Thế Anh Thành viên 12 TS Phùng Thị Thủy Thành viên Học viện Quân y Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Theo quy định bảng Điểm b Khoản Điều thông tư liên tịch số 55/2015/TTLT-BTC-BKHCN ngày 22/4/2015 hướng dẫn định mức xây dựng, phân bổ dự tốn tốn kinh phí nhiệm vụ KH&CN có sử dụng ngân sách nhà nước 13 TS Lê Quang Hịa Thành viên 14 ThS Mạc Văn Trọng Thành viên 15 CN Phạm Hà Thu Thành viên Viện Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Công ty Vắcxin Sinh phẩm số (VABIOTECH) Công ty Vắcxin Sinh phẩm số (VABIOTECH) II MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 13 Mục tiêu đề tài (Bám sát cụ thể hoá định hướng mục tiêu theo đặt hàng) Xác định đặc điểm dịch tễ học bệnh dại dịch tễ học phân tử vi rút dại Đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin Phạm vi nghiên cứu: Do thời gian nghiên cứu ngắn (không đủ cho quá trình cố định, thích ứng chủng phân lập tự nhiên) với yêu cầu khắt khe mặt kỹ thuật việc lấy mẫu, bảo quản mẫu bệnh phẩm bệnh nhân dại, phạm vi nghiên cứu đề tài này, nhóm nghiên cứu tập trung nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại số đặc điểm sinh học phân tử các chủng vi rút dại hiện lưu hành tại Việt Nam để từ đó đề xuất chọn chủng vi rút dại sản xuất vắc xin từ tập hợp các chủng vi rút được WHO khuyến cáo sử dụng Việc lựa chọn chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin: phạm vi nghiên cứu đề tài, nhóm nghiên cứu tập trung lựa chọn chủng WHO khuyến cáo sử dụng để sản xuất vắc xin chủng vi rút PV PM Cơ sở của việc lựa chọn chủng ngoài việc dựa phân tích kiểu gen bằng gen N (mã hóa Nucleoprotein của vi rút) còn dựa việc đánh giá sự biến động của các vùng quyết định tính kháng nguyên glycoprotein G ở các chủng vi rút phát hiện được Căn kết so sánh tương đồng axít amin chủng vi rút dại Việt Nam (từ kết nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử chủng phân lập được) so với chủng sản xuất vắc xin (PM, PV) để chọn chủng phù hợp phục vụ sản xuất thử nghiệm vắc xin dại Từ chủng đã được lựa chọn, nhóm nghiên cứu tiến hành sản xuất thử nghiệm vắc xin phòng bệnh dại công nghệ nuôi cấy tế bào Vero Kết thử nghiệm vắc xin dại sẽ cho phép khẳng định phù hợp chủng vi rút lựa chọn tiền đề để tiến hành sản xuất vắc xin phịng bệnh dại ở quy mơ lớn tương lai gần 14 Tình trạng đề tài Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu nhóm tác giả Kế tiếp nghiên cứu người khác 15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VỀ VI RÚT DẠI VÀ BỆNH DẠI 1.1 Cấu trúc phân tử virus dại Vi rút dại có hình viên đạn đầu trịn mợt đầu dẹt, có chiều dài trung bình 180 nm (dao động khoảng 130–250 nm), đường kính trung bình 75 nm (dao động từ 60–110 nm) (Hình 1) Hình Cấu trúc hạt vi rút dại Thuộc chi Lyssavirus họ Rhabdoviridae, vi rút dại có hệ gen mợt sợi RNA đơn âm có độ dài khoảng 12 Kb vi rút dại khơng có khả tồn bên vật chủ, bị bất hoạt ánh nắng, nhiệt độ phơi khô (Leung et al., 2007) Hình Cấu trúc hệ gen vi rút dại Hệ gen vi rút dại (Hình 2) chứa đoạn ORF có tính bảo tồn cao phiên mã riêng biệt để tạo protein: nucleoprotein N, non-structural protein NS (phosphoprotein P), matrix protein M, glycoprotein G polymerase protein L (Yousaf et al., 2012) Giữa đoạn ORF nói trình tự vùng IR (intergenic region) có độ dài khác Trình tự IR dài nằm gen G L, gọi pseudogene (Tordo et al., 1986) Vùng trình tự có tốc độ tiến hóa cao sử dụng để đánh giá dịch tễ học phân tử vi rút dại (Sacramento et al., 1991) Gen N (1350 bp) mã hóa cho nucleoprotein (450 axit amin (aa)), thành phần thiết yếu cho protein capsid vi rút; đóng vai trị quan trọng bước đóng gói hệ gen vi rút ORF NS (978 bp) L (6381 bp) mã hóa cho protein phi cấu trúc phosphoprotein transcriptase Hai protein tạo phức hợp với RNA, thực trình phiên mã nhân vi rút Protein M (202 aa) giúp gập lõi nucleocapsid vi rút thành cấu trúc xoắn gọn Lõi vi rút được bao bọc một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ Trên lớp màng có glycoprotein G protein xuyên màng Vùng ngoại bào protein G có chức tương tác bám vào tế bào cơ, thần kinh tế bào hạt tuyến nước bọt vật chủ (Cox et al., 1977) Bất thay đổi axit amin vùng epitope protein G gây nên thay đổi khả gây bệnh, khả gây đáp ứng miễn dịch đặc điểm miễn dịch khác vi rút dại Hiện nay, vắc xin tái tổ hợp phịng dại có chất protein G tái tổ hợp (Ramya et al., 2018) kháng nguyên chủ đạo có khả cảm ứng tạo đáp ứng miễn dịch phòng ngừa vi rút dại vi rút sử dụng với liều cao mơ hình động vật (Cox et al., 1977) Gen G dài 1572 nucleotide, mã hóa cho protein dài 524 axit amin (65 kDa) bao gồm vùng sau (Benjathummarak et al., 2016) - từ axit amin (aa) đến 19 vùng peptit tín hiệu dẫn đường (sẽ loại bỏ khỏi protein trưởng thành màng tế bào); - từ aa 20 đến 459 vùng nằm bề mặt virion (vốn định đặc tính kháng nguyên chủng vi rút dại); - từ aa 460 đến 480 vùng xuyên màng; - từ aa 481 đến 524 vùng nằm virion Glycoprotein G tồn dạng trimer protein diện bề mặt hạt virion (Hình 3) Chức chủ yếu protein tương tác với thụ thể, thực trình nhập bào Đây protein tạo phản ứng miễn dịch sau xâm nhiễm Trimer hóa q trình cần thiết để glycoprotein G thực đầy đủ chức Ngồi ra, trimer hóa ảnh hưởng trực tiếp đến cảm ứng sinh kháng thể trung hòa tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ khỏi lây nhiễm vi rút dại (Astray et al., 2017) Quá trình glycosyl hóa protein G (tại vị trí asparagine 56, 223, 338) ảnh hưởng lớn đến khả sinh đáp ứng miễn dịch vi rút dại Các yếu tố định kháng nguyên (epitope) protein G xác định bao gồm (Buthelezi et al., 2016; Evans et al., 2018) - vùng từ aa 34–42 (IIb) (trình tự GCTNLSGFS) 198–200 (IIa) (trình tự KRA), tồn dạng không gian - vùng từ aa 226 – 231 (trình tự KLCGVL) tồn dạng tuyến tính dạng khơng gian - axit amin vị trí 251 (T) - vùng từ aa 261 – 264 (trình tự HDFR) - vùng từ aa 330 đến 338 (trình tự KSVSFRRLS) - vùng aa 342 343 (trình tự KL) Hình Cấu trúc trimer glycoprotein G vi rút dại (Astray et al., 2017) Các thay đổi trình tự axit amin vùng định kháng nguyên làm giảm vơ hiệu hóa bắt cặp kháng thể trung hòa với protein G, vậy, ảnh hưởng xấu đến hiệu bảo vệ vắc xin(Koprowski et al., 1985) Do vậy, cần theo dõi biến đổi trình tự axit amin vùng định kháng nguyên protein G chủng vi rút dại tự nhiên để lựa chọn chủng vi rút sản xuất vắc xin phù hợp 1.2 Con đường lây nhiễm Từ hệ thần kinh trung ương, virus dại di chuyển đến tuyến nước bọt thông qua dây thần kinh hộp sọ tiết nước bọt động vật mắc bệnh Từ đây, virus dại tiếp tục lây nhiễm sang vật chủ qua vết cắn vết cào xuyên da động vật mắc bệnh Động vật trung gian thường gây bệnh dại người chó mèo chúng thú nuôi thân thiết người (Chhabra and Ichhpujani 2003; Blanton et al 2009) Tại hầu hết quốc gia giới, đặc biệt châu Á châu Phi, chó cắn nguyên nhân gây từ 85 đến 95  ca bệnh dại người (Tang et al., 2005; Fitzpatrick et al., 2012) Lây truyền xảy virus dại nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc tổn thương da nạn nhân nhiên tỷ lệ lây nhiễm theo đường thấp So với chủng virus dại từ chó, virus dại từ dơi có độc tính cao nhiều lần lây nhiễm theo đường tiếp xúc biểu mô Điều chủng virus dại từ dơi có khả nhân nhanh tế bào phi thần kinh nhiệt độ thấp (Singh et al., 2017) Tại số quốc gia toán bệnh dại người trung gian chó, dơi trở thành tác nhân truyền bệnh dại chủ yếu (Singh et al., 2017) Ngoài ra, số ca bệnh dại đơn lẻ ghi nhận hít phải chất tiết có chứa virus ghép tạng Tại Mỹ vào năm 2004, ghi nhận trường hợp mắc bệnh dại ghép tạng người chết bệnh dại (Krebs et al., 2005) Tại số nước châu Á (Trung Quốc, Campuchia, Hàn Quốc, Việt Nam Ấn Độ), lị giết mổ chó mèo đường lây nhiễm có nguy cao điều kiện vệ sinh thú y không đảm bảo (Rupert, 2002; Clifton, 2003; Tang et al., 2005) 1.3 Đặc điểm bệnh học Virus dại gây bệnh với tiến triển chậm không có triệu chứng lâm sàng ban đầu Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng xuất hiện, gần chắn dẫn đến tử vong Sau bị phơi nhiễm với virus, virus dại ở trạng thái ủ bệnh vị trí vết thương Thời gian kéo dài từ tuần tới năm (trung bình – tháng)tùy thuộc vào lượng virus ban đầu, vị trí vết thương mật độ dây thần kinh vị trí vết thương (Greene and Rupprecht, 2006) Thời gian ủ bệnh ngắn người bệnh bị cắn tay, cổ, mặt vùng đầu Tại vị trí phơi nhiễm, vi rút dại sẽ bám vào các tế bào đích (tế bào cơ, tế bào thần kinh cảm quan cảm giác, tế bào thần kinh vận động) thông qua tương tác của protein G với các thụ thể đặc hiệu Sau đó, virus dại sẽ dịch chuyển đến hệ thống thần kinh trung ươngbằng chế vận chuyển sợi trục ngược (retrograde axonal transport) (Hình 3) Tại đây, quá trình nhân bản virus sẽ diễn mạnh mẽ, gây tác động bệnh lý lên sinh lý tế bào thần kinh Sau đó, virus sẽ di chuyển từ hệ thần kinh trung ương qua dây thần kinh ngoại biên, đến các quan khác tuyến nước bọt Tại thời điểm khởi phát lâm sàng, virus dại đã phát tán rộng rãi khắp thể Lúc này, hệ thần kinh ngoại biên, tủy sống não người bệnh xuất dấu hiệu thối hóa, dẫn đến rối loạn chức tế bào thần kinh (Jackson, 2007) Ngoài tủy não giữa, quan sát thấy nhiều phản ứng viêm Ở thời kì cuối bệnh, virus theo dây thần kinh tới tuyến nước bọt để giải phóng ngồi (Hình 4) Hình Vịng đời virus dại vật chủ Biểu bệnh dại thường sốt nhẹ, đau dị cảm vết thương Khi virus lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển xuất triệu chứng sợ nước sợ gió, tăng động ngủ, co giật toàn thân, sau vài ngày bệnh nhân tử vong Bệnh dại gây liệt xảy 30% ca bệnh người, tiến triển chậm nhiên kết cục cuối tử vong Dạng bệnh dại thường bị chẩn đoán nhầm bệnh lý khác (Singh et al., 2017) 1.4 Chẩn đoán bệnh dại Hiện chưa có thử nghiệm sử dụng để chẩn đoán bệnh dại người trước bệnh khởi phát lâm sàng Do vậy, chẩn đoán bệnh dựa tiền sử bệnh, biểu triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh động vật Biểu bệnh dại thường sốt nhẹ, đau dị cảm vết thương sau xuất có triệu chứng đặc trưng sợ nước, sợ gió, tăng động ngủ, co giật toàn thân Đối với trường hợp có thời kỳ ủ bệnh dài, khơng rõ thời gian ủ bệnh tiền sử phơi nhiễm, người bị bệnh dại thể liệt khó chẩn đốn lâm sàng, dễ bị bỏ sót chẩn đoán nhầm sang bệnh viêm não khác Các phương pháp xét nghiệm thường quy (tỷ lệ bạch cầu đa nhân máu, bạch cầu niệu, chụp cắt lớp vi tính (CT Scan) cộng hưởng từ 10