Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến TS Đoàn Văn Thược – giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – người tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới chị Dung, chị Bình, anh chị cao học, bạn Vóc, bạn Ninh, bạn, em sinh viên làm thí nghiệm mơn người thân, người động viên, khích lệ tơi nhiều thời gian vừa qua Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Người viết Vũ Hồng Vân Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân MỤC LỤC Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CDW (cell dry weight) : Khối lượng tế bào khô HA : Hydroxyalkanoate-Đơn phân cấu tạo nên PHA mcl (medium-chain-length) : Mạch trung bình OD (Optical Density) : Mật độ quang PHA : Polyhydroxyalkanoate PhaC : PHA synthase PhaP : Phasin protein PhaR : Protein điều hịa q trình sinh tổng hợp PHA PhaZ : PHA depolymerase PHB (hay P(3HB)) : Poly(3-hydroxybutyrate) phbA : Gen quy định enzyme β-ketoacyl-CoA thiolase phbB : Gen quy định enzyme acetoacetyl-CoA reductase phbC : Gen quy định enzyme PHB polymerase P(3HB-co-3HV) : Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (hay PHBHV) PHV (hay P(3HV)) : Poly(3-hydroxyvalerate) scl (short-chain-length) : Mạch ngắn UV (Untraviolet) : Tia tử ngoại %, w/v : Phần trăm khối lượng thể tích Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân MỞ ĐẦU Dầu mỏ nguồn nguyên liệu quan trọng xã hội đại, nhiên liệu đa số phương tiện giao thông vận tải Hơn nữa, dầu sử dụng để sản xuất chất dẻo (plastic) nhiều sản phẩm khác.Tuy nhiên, dầu mỏ nguồn ngun liệu khơng có khả tái tạo nên chắn cạn kiệt tương lai, sản phẩm từ dầu mỏ sau sử dụng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Ví dụ chất dẻo có nguồn gốc từ dầu mỏ mối nguy hại tiềm ẩn tới sức khỏe người mơi trường sinh thái có tác động học nhiệt phá hủy lại tạo nhiều chất độc hại đòi hỏi chi phí lớn, vượt qua giá thành tạo chúng Phát triển sử dụng polymer có khả phân hủy sinh học thay cho polymer hóa dầu hướng có nhiều triển vọng mà giới nói chung Việt Nam nói riêng cố gắng bước thực Trong số polymer sinh học biết polyhydroxyalkanoate (PHA) loại polymer quan tâm nghiên cứu sản xuất nhiều PHA tích lũy tế bào vi sinh vật đóng vai trị nguồn tích lũy cacbon lượng Sự tích lũy PHA xảy môi trường sống vi sinh vật dư thừa nguồn cacbon thiếu nguyên tố dinh dưỡng O, N, P, S hay Mg [ 28, 29] Có khoảng 150 loại PHA khác nhau, loại có tính chất đặc trưng riêng phù hợp với hướng ứng dụng khác nông nghiệp, cơng nghiệp y tế, Trong có loại PHA poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) poly (hydroxybutyrate-cohydroxyvalerate) (PHBV) sản xuất ứng dụng quy mô công nghiệp [28, 29] Điểm hạn chế ảnh hưởng đến tiềm ứng dụng PHA giá thành PHA đắt so với loại plastic có nguồn gốc từ mỏ sử dụng Rất nhiều yếu tố có khả ảnh hưởng đến giá PHA, ví dụ như: hiệu suất sản xuất PHA, hàm lượng PHA tích lũy tế bào, hiệu suất chuyển hóa nguồn cacbon thành PHA, giá nguyên liệu dùng lên men, giá quy trình tách chiết, tinh PHA [14] Chính việc lựa chọn chủng dùng cho sản xuất PHA qui mô công nghiệp cần phải ý đến nhiều yếu tố Ví dụ khả Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân sử dụng nguồn cacbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng tốc độ tổng hợp PHA, hàm lượng PHA có khả tích lũy tế bào [14] Sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học có diesel sinh học nhằm thay dầu mỏ lĩnh vực nhiên liệu định hướng phát triển nước giới Quá trình sản xuất diesel sinh học tạo lượng glycerol lớn (khoảng 10% (w/w)) [15] Cùng với phát triển ngành sản xuất diesel sinh học lượng glycerol tạo ngày nhiều Làm để sử dụng hiệu nguồn glycerol câu hỏi mà nhiều nhà khoa học tìm câu trả lời Một hướng nghiên cứu chuyển hóa glycerol thành polyhydroxyalkanoate Với lý trên,chúng tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa glycerol thành polyhydroxyalkanoate (PHA) nhờ số chủng vi khuẩn phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh” Mục tiêu Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa hiệu glycerol thành PHA Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tích lũy PHA mơi trường có nguồn carbon glycerol Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn, xác định loại PHA tích lũy chủng tuyển chọn Nghiên cứu khả chuyển hóa glycerol thành PHA điều kiện nuôi cấy thành phần dinh dưỡng khác Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Polyhydroxyalkanoate (PHA) Polyhydroxyalkanoate (PHA) polyester hydroxyalkanoate (HA) (hình 1.1) tích lũy tế bào nhiều vi sinh vật điều kiện môi trường sống dư thừa nguồn cacbon thiếu hụt vài nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu O, N, P, S, Mg,… PHA polymer khoảng 103 đến 104 monomer, chúng tồn dạng hạt riêng biệt tế bào, có khoảng từ đến 13 hạt tế bào, hạt có kích thước khoảng từ 0.2 đến 0.5 µm [18, 19, 26] Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo polyhydroxyalkanoates R H gốc alkyl có số lượng C dao động từ 1-13, x = 1-4, n = 100-30000 phân tử [28] Bảng 1.1 Một số loại PHA thường vi khuẩn tổng hợp [30] R X Tên gọi Viết tắt H Poly(3-hydroxypropionate) P(3HP) CH3 Poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB) C2H5 Poly(3-hydroxyvalerate P(3HV) C3H7 Poly(3-hydroxyhexanoate) P(3HHx) H Poly(4-hydroxybutyrate) P(4HB) CH3 Poly(4-hydroxyvalerate) P(4HV) 1.1.1 Sinh tổng hợp PHA tế bào vi khuẩn PHA tổng hợp nhiều thể sống, vi khuẩn thực vật hai đối tượng đáng quan tâm Tế bào thực vật tổng hợp PHA từ nguồn carbon CO2 nhiên hàm lượng PHA tích lũy thấp (nhỏ 10% khối lượng tế bào khô) Trong số trường hợp, thực vật tích lũy hàm lượng PHA cao (từ 10-40% khối lượng tế bào khô) điều lại gây ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng phát triển chúng nhà khoa học chưa tìm biện pháp để khắc phục nhược điểm Trong tế bào vi khuẩn PHA tích lũy tới 90% khối lượng khơ tế bào [30] Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân Tích lũy PHA cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ carbon lượng hàm lượng nguyên tố dinh dưỡng mơi trường sống cân Việc polymer hóa phân tử chất tan thành hạt PHA không tan không làm thay đổi áp suất thẩm thấu tế bào, ngược lại điều giúp ngăn cản thất hợp chất có giá trị Chúng dự trữ để trì tồn tế bào [30] Loại PHA nhà khoa học phát loại PHA nghiên cứu chi tiết thời điểm poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) [30] Những nghiên cứu chủng Cupriavidus necator cho thấy trình sinh tổng hợp PHB chịu chi phối gen, điều hịa hoạt động operon có tên operon phbCAB gen mã hóa cho enzyme thực phản ứng tổng hợp (hình 1.3) Phản ứng biến đổi hai phân tử acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) thành phân tử acetoacetyl-CoA nhờ xúc tác β-ketoacyl-CoA thiolase (mã hóa gen phbA) Tiếp theo phản ứng khử acetoacetyl-CoA thành (R)-3-hydroxybutyryl-CoA nhờ xúc tác enzyme NADPdependent acetoacetyl-CoA reductase (mã hóa gen phbB) Cuối phân tử (R)-3-hydroxybutyryl - CoA polymer hóa thành poly(3hydroxybutyrate) (PHB) nhờ xác tác PHB polymerase (mã hóa gen phbC) [28] Trong trình sinh trưởng vi khuẩn, enzyme β-ketothiolase bị ức chế hàm lượng Coenzyme A tự giải phóng từ chu trình Krebs, tiếp nhận acetyl-CoA vào chu trình Krebs bị giới hạn (xảy môi trường sống bị hạn chế vài nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu, nguồn carbon dồi dào) lượng acetyl-CoA dư thừa chuyển vào đường sinh tổng hợp PHB [30] Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân Hình 1.3: Ba bước đường sinh tổng hợp PHB Một promoter nằm trước gen phbC đóng vai trị khởi động q trình sinh tổng hợp [28] Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hạt PHA [28] Trong tế bào, PHA tích lũy dạng thể ẩn nhập (hạt dự trữ) hình cầu, không tan nước, chứa chuỗi polyester, thường gọi hạt PHA Hạt PHA bao lớp màng có chất phospholipid “khảm” protein bám màng xuyên màng bao gồm enzyme PHA synthease (PhaC), protein phasing (PhaP), enzyme PHA depolymerase (PhaZ), protein điều hòa (PhaR) số protein khác chưa rõ chức [ 28] (hình 1.4) Kích thước hạt PHA tăng lên enzyme PHA synthase không ngừng tiếp xúc để liên kết monomer có tế bào chất, làm mạch polyester dài Khi tích lũy PHA đạt đến cực đại, hạt PHA chốn hết thể tích bên tế bào [28] Ngoài đường tổng hợp thể sống, PHA tổng hợp đường hóa học Con đường sinh tổng hợp tạo polymer có khối lượng phân tử lớn so với polymer tạo từ đường tổng hợp hóa học, nhiên đường tổng hợp sinh học khó điều khiển monomer cấu trúc tham gia kiến tạo PHA điều quy định loại PHA synthase đặc trưng tế bào [13] 1.1.2 Phân loại tích chất PHA PHA polymer loại monomer hai nhiều loại monomer PHA chia thành hai nhóm phụ thuộc vào số lượng phân tử carbon có đơn phân monomer: PHA dạng mạch ngắn (scl-PHAs) có khoảng 3-5 phân tử carbon monomer, PHA dạng mạch trung Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân bình (mcl-PHAs) có khoảng 6-16 phân tử bon monomer PHA mạch ngắn có tính chất giống với loại plastic thơng thường (giịn cứng), PHA có mạch trung bình mềm dẻo, có nhiệt độ sơi hàm lượng tinh thể thấp, có khả đàn hồi [22] Một số vi khuẩn có khả tổng hợp PHA có chứa hai loại mạch ngắn mạch trung bình [22] PHA trùng hợp từ loại monomer đồng trùng hợp từ hai hay nhiều loại monomer Dựa theo cách trùng hợp có hai loại polymer homopolymer (đồng polymer) heteropolymer (dị polymer) hay polymer hỗn hợp (co-polymer) Homopolymer điển hình polyhydroxybutyrate (PHB) tổng hợp từ loại monomer hydroxybutyrate Trong điều kiện môi trường thiếu hụt yếu tố dinh dưỡng dư thừa carbon, tế bào vi khuẩn thường chuyển hóa nguồn carbon thành monomer 3-hydroxybutyrate (3HB) tổng hợp nên PHB [15] PHA trùng hợp ngẫu nhiên từ hai hay nhiều loại monomer khác gọi co-polymer (polymer đồng trùng hợp) hay heteropolymer (dị polymer) Mặc dù homopolymer PHB loại tổng hợp phổ biến nhiều chủng vi khuẩn hạn chế tính chất vật lý khiến nhà khoa học quan tâm tới nhóm co-polymer PHB trở nên cứng giịn sau tách chiết từ tế bào vi khuẩn bảo quản điều kiện thường sau vài ngày, nhiệt độ nóng chảy PHB gần với nhiệt độ phân hủy (xấp xỉ 185 oC) nên trình chế tạo sản phẩm từ PHB gặp nhiều khó khăn Co-polymer khắc phục triệt để nhược điểm Khả chịu nhiệt tính chất vật lý đa dạng loại co-polymer khiến chúng đối tượng nhà khoa học quan tâm nghiên cứu sản xuất Sau tách chiết tinh sạch, PHA thể số tính chất đặc trưng bền nhiệt, khơng dẫn điện, cứng mềm dẻo (tùy loại PHA), không thấm nước, khơng cho khơng khí qua…[ 13] Khối lượng phân tử PHA dao động khoảng từ 2x105 đến 3x106 Dalton Các polymer sinh học có tính chất giống với polymer thơng thường polyethylene (PE) hay polypropylene (PP) (bảng 1.2) Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân Bảng 1.2: Bảng so sánh đặc tính vật lý nhiều loại PHA polypropylene [28] Polymmer P(3HB) P(4HB) P(3HB-co-3 mol% 3HV) P(3HB-co-14 mol% 3HV) P(3HB-co-20 mol% 3HV) P(3HB-co-25 mol% 3HV) P(3HB-co-16 mol% 4HB) P(3HB-co-64 mol% 4HB) P(3HB-co-90 mol% 4HB) P(3HB-co-6 mol% 3HA) P(3HB-co-10 mol% 3HHx) P(3HO-co-11 mol% 3HHx) Polypropylene Ghi chú: (1) Nhiệt độ hóa Tinh thể hóa lỏng (oC)(1) 175-179 53 169-170 150 145 137 150 50 50 133 127 61 176 (%)(2) 60-80 34 69 56 50 40 45 15 28 45 34 30 50-70 Độ đàn hồi (MPa)(3) 40 104 38 35 32 30 26 17 65 17 21 10 34.5-38 Tm (melting temperature) : nhiệt độ mà polymer chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái lỏng (2) Crystallinity: tỷ lệ tinh thể có tồn mẫu polymer (polymer = tinh thể + chất vô định hình) (3) Tensile strength: lực căng lớn mà polymer chịu (khơng bị rách, đứt gãy), tính megapascal (1Pa = 1N/m2 ; 1MPa = 106 Pa) Bên cạnh tính chất nêu trên, tính chất đặc trưng PHA khả phân hủy sinh học Các vi sinh vật tự nhiên phân hủy PHA cách sử dụng enzyme PHA hydrolase PHA depolymerase Hoạt động enzyme khác nhau, phụ thuộc vào thành phần cấu tạo polymer điều kiện môi trường Một mẫu PHB phân hủy hồn tồn sau vài tháng điều kiện yếm khí bể chứa nước thải sau vài năm mồi trường nước biển Tác động tia UV ánh sáng mặt trời có tác dụng đẩy nhanh q trình phân hủy Một điều đặc biệt PHA có tính tương thích sinh học, nghĩa chúng khơng gây tác động xấu đưa vào thể sống Trong mơ động vật có vú, PHA phân hủy chậm, sau tháng cấy ghép vào thể chuột thí nghiệm, lượng PHA hao mòn phân hủy nhỏ (nhỏ 1.6% khối lượng) [30] 1.2 Tình hình sản xuất, ứng dụng PHA giới Việt Nam 10 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân  Ở 35oC mơi trường MA có nguồn carbon glycerol sinh trưởng, phát triển chủng thể hình 3.2 Hình 3.2 Đồ thị thể khả sinh trưởng phát triển 17 chủng ni cấy mơi trường có nguồn carbon Glycerol 35°C Chúng nhận thấy chủng có khả sinh trưởng phát triển tích lũy PHA nhiệt độ 30oC (Hình 3.1) Các chủng 32, 56, 75 có khả sinh trưởng tốt khối lượng tế bào khô các chủng 3.38, 2.25, g/l Đồng thời khả sinh trưởng ba chủng 32, 56, 75 nhiệt độ 35oC chủng nhìn chung cao so với chủng khác 2.75, 2.63, 2.58 g/l Bên cạnh chủng có khả tích lũy PHBV 30 oC Trong cơng nghệ lên men việc tăng nhiệt độ môi trường thường dễ dàng đỡ tốn so với việc giảm nhiệt độ mơi trường, người ta thường chọn chủng phát triển tốt nhiệt độ 35-40oC Chính chúng tơi lựa chọn chủng 32, 56, 75 để tiến hành thí nghiệm 25 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào a B Hình 3.2.1 a, b Khuẩn lạc chủng 32 A B Hình 3.2.2 a,b Khuẩn lạc chủng 75 A 26 B Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân Hình 3.2.3 a,b Khuẩn lạc chủng 56  Khuẩn lạc chủng 32, 56, 75 có hình trịn nhỏ, trắng đục, lồi tâm, bề mặt trơn nhẵn, bóng đồng (A) (B) (C) Hình 3.2.4 (A), (B), (C) Ảnh nhuộm Gram tế bào chủng 32, 75, 56 kính hiển vi quang học  Kết nhuộm Gram cho thấy chủng 32, 56,75 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm  Hình ảnh tế bào vi khuẩn tích lũy PHA (A) (B) (C) Hình 3.2.5 (A), (B), (C) Hình ảnh kính hiển vi quang học cho thấy hạt PHA tích lũy tế bào vi khuẩn chủng 32, 56, 75 Hình 3.2.5 cho thấy tế bào vi khuẩn có hạt PHA tích lũy chốn gần hết tế bào ni cấy mơi trường có nguồn carbon glycerol 3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối tới sinh trưởng, phát triển chủng tuyển chọn Chủng tuyển chọn chủng vi khuẩn phân lập từ đất rừng ngập mặn – mơi trường sống có hàm lượng muối cao Hàm lượng NaCl môi trường nhiều khả ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển chủng Do chúng tơi tiến 27 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NaCl đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn, thu kết sau: Hình 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng, phát triển chủng 32, 56, 75 Kết cho thấy khoảng nồng độ NaCl rộng (0% đến 15%) chủng có khả sinh trưởng, phát triển Chúng sinh trưởng tốt nồng độ 3% đến 5%.Trong môi trường MA nồng độ 4% NaCl nồng độ muối tốt cho sinh trưởng chủng 56,75 đồng thời không ảnh hưởng nhiều tới sinh trưởng, phát triển chủng 32 lựa chọn nồng độ NaCl cho nghiên cứu 3.4 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng, phát triển chủng tuyển chọn pH môi trường ảnh hưởng đến phân ly ion, đến cấu trúc hoạt tính protein nên có ý nghĩa định đến sinh trưởng tổng hợp chất vi khuẩn [3] Xuất phát từ lý đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng pH đến chủng 32, 56, 75, kết thể hình 3.4 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng, phát triển chủng 32, 56, 75 Kết cho thấy chủng tuyển chọn sinh trưởng, phát triển tất pH mà nghiên cứu tiến hành (5.5 đến 8) Tuy nhiên, sinh trưởng đạt tốt pH - 7.5, chứng tỏ chủng thuộc nhóm vi sinh vật ưa trung tính Căn vào kết thực nghiệm, chọn pH để tiến hành nghiên cứu 3.5 Ảnh hưởng nguồn Nitơ tới sinh trưởng, phát triển tích lũy PHA chủng tuyển chọn Trong môi trường phân lập vi khuẩn môi trường thu sinh khối sử dụng cao nấm men nguồn nitơ.Tuy nhiên theo Jorge cộng [ 23] có mặt cao nấm men giúp vi sinh vật sinh trưởng tốt lại ảnh hưởng tới khả tích lũy PHA đa số vi sinh vật tích lũy hàm lượng PHA cao môi trường dư thừa carbon thiếu vài nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu, có nitơ Chính cơng nghệ lên men phải xác định điều chỉnh 28 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân chất với tỷ lệ phù hợp, tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tích lũy PHA, cao nấm men nguồn chất tổng hợp không chứa nitơ mà chứa nguyên tố đa lượng, vi lượng khác xác định lượng xác hàm lượng chất có mơi trường nuôi cấy dung cao nấm men Hơn cao nấm men nguồn chất đắt tiền nên sử dụng làm tang giá thành sản phẩm, tiến hành thử nghiệm tìm kiếm nguồn nitơ xác định, rẻ tiền thay nguồn cao men nguồn nitơ khác thử nghiệm, kết sau: Hình 3.5 (A) Hình 3.5 (B) Hình 3.5 (C) Hình 3.5 (A), (B), (C) Ảnh hưởng nguồn Nitơ khác tới sinh trưởng, phát triển tích lũy PHA chủng 32, 56, 75 Kết cho thấy chủng tuyển chọn sinh trưởng tích lũy PHA mơi trường có nguồn nitơ chọn NH 4Cl, NH4SO4, NH4HCO3, KNO3, NaNO3, NH4NO3,Urê Trong nguồn nitơ có gốc nitrat KNO 3, NaNO3, Urê ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng, phát triển tích lũy PHA chủng tuyển chọn so với nguồn nitơ khác Nhận thấy điều kiện nuôi cấy với nguồn nitơ KNO3 thu chủng 75 khối lượng khô tế bào đạt giá trị 3.01 g/l sau 30h nuôi cấy chủng 32 56 khối lượng tế bào khô đạt giá trị 1.36, 1.88 g/l sau 30h ni cấy Bên cạnh đó, kết phân tích hàm lượng PHA tích lũy tế bào chủng tuyển chọn cho thấy chủng 75 có khả tích lũy PHA tốt so với chủng 32, 56 chọn chủng 75 lựa chọn nguồn nitơ KNO3 cho nghiên cứu 3.6 Động thái sinh trưởng hàm lượng PHA tích lũy tế bào chủng 75 Trong yếu tố ảnh hưởng tới sinh khối tế bào hàm lượng PHB tích lũy thời gian yếu tố quan trọng Trong q trình làm thí nghiệm chúng tơi nhận thấy thời điểm khác tốc độ sinh trưởng khả tích lũy PHB 29 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân chủng 75 khác Vì chúng tơi tiến hành thí nghiệm theo dõi sinh trưởng, phát triển tích lũy PHA chủng 75 thời điểm khác trình lên men Kết đồ thị động thái sinh trưởng thể hình 3.6 Hình 3.6 Đồ thị động thái sinh trưởng khả tích lũy PHB chủng 75 Kết cho thấy thời điểm 30-36h sau giống đưa vào môi trường lên men, quần thể vi khuẩn sinh trưởng đạt giá trị cực đại (6g/l sinh khối tế bào khô) đồng thời hàm lượng PHBV tích lũy tế bào đạt giá trị cao 17.44% Tại thời điểm 36h, thu sinh khối tế bào khơ 5.62 g/l, hàm lượng PHBV tích lũy 17,09% Kết hàm lượng PHBV tích lũy tế bào thấp, nồi lên men cung cấp đầy đủ chất để vi khuẩn sinh trưởng chưa bổ sung đủ hàm lượng nguồn carbon để chúng tích lũy PHB Điều cần nghiên cứu thêm để tối ưu hóa mơi trường lên men cho chủng 75 30 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I Kết luận Chúng phân lập 200 chủng vi khuẩn từ đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh Trong chủng tuyển chọn 17 chủng có khả tích lũy PHA để tiến hành nghiên cứu Ba chủng 32, 56, 75 có khả sinh trưởng, phát triển tích lũy tốt mơi trường có nguồn carbon glucose glycerol 30 oC 35oC chúng tơi chọn chủng để tiến hành nghiên cứu sâu Ba chủng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, ưa ấm trung bình, ưa pH trung tính, thích hợp với nồng độ muối 4% có khả tích lũy PHA mơi trường có nguồn carbon glycerol với nguồn nitơ thích hợp KNO Đặc biệt chủng 75 có khả sử dụng tốt nguồn KNO mơi trường có nguồn carbon glycerol, khối lượng khô tế bào đạt giá trị 3.01 g/l sau 30h ni cấy, % PHBV tích lũy 55.48% Khi lên men nồi lên men, thời điểm 30h sinh khối tế bào đại giá trị lớn g/l, đồng thời khả tích lũy cao so với thời điểm khác Như thời gian thu sinh khối tế bào tốt 30h sau bổ sung giống vào môi trường lên men II Đề xuất Các chủng tuyển chọn có khả tích lũy copolymer PHBV đồng thời chủng gram âm nên trình phá vỡ tế bào , thu polymer thuận lợi Đặc biệt chủng 75 có khả tích lũy hàm lượng PHB cao mơi trường có nguồn carbon glycerol nguồn nitơ KNO 3, cần có nghiên cứu kỹ lưỡng để tối ưu hóa quy trình lên men thu lượng copolymer lớn 31 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Bình (2011) Phân lập nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định Khóa luận tốt nghiệp Khoa sinh học Đại học sư phạm Hà Nội Nguyễn Thị Bình (2013), Nghiên cứu thành phần môi trường lên men điều kiện tách chiết, tinh polyhydroxyalkanoate (PHA) từ chủng vi khuẩn QN271 Luận văn thạc sĩ Khoa sinh học Đại học sư phạm Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Thành Đạt , Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh học NXB Giáo dục.Tr 143 Mai Thị Hằng, Sinh Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, Thực hành vi sinh vật học Nxb Đại học sư phạm, 2011 Lưu Thị Hồi (2012) Nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường lên men sinh tổng hợp PHB điều kiện tinh PHB từ chủng vi khuẩn Yangia sp NĐ 199 qui mơ phịng thí nghiệm Luận văn thạc sỹ Khoa sinh học Đại học sư phạm Hà Nội Đoàn Văn Thược, Nguyễn Thị Bình (2012) Đặc điểm chủng vi khuẩn NĐ153 sinh polyhydroxybultyrate (PHB) phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định Tạp chí Công nghệ học 10(1): 169-178 Tiếng anh Anderson AJ, Dawes EA (1990), Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates Microbiological Reviews 54:450- 472 Ashby RD,Solaiman, Strahan GD (2011), Efficent Utilization of Crude Glycerol as Fermentation Substrate in the Synthesis of Poly(3-hydroxyburate) Biopolymer.Journal of the American Oil Chemists’Society 88:949-959 10 Bormann EJ, Roth M (1999) The production of polyhydroxybutyrate by Methylobacterium rhodesianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates Biotechnology Letters 21:1059-63 32 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân 11 Cavalheiro JMBT, de Almeida MCMD, Grandils C, da Fonseca MMR (2009) Poly(3-hydroxybutyrate) production by Cupriavidus necator using waste glycerol Process Biochemistry 44:509-15 12 Chen GQ (2009), A polyhydroxylkanoates based bio- and materials industry Chemical Society Reviews 38:2434-2446 13 Chen GQ (2010), Plastic from Bacteria Springer Hidelberg Dordrecht London New Yrok P19-21, p23-24 14 Choi J, Lee SY (1998), Efficient and Economical Recovery of Poly(3 Hydroxybutyrate) from Recombinant Escherichia coli by Simple Digestion with Chemicals Biotechnology and Bioengineering 62:546-553 15 Fanxia Yang, Milford A Hanna, Runcang Sun (2012), Value-added uses for crude glycerol-a byproduct of biodiesel production Biotechnology for Biofules 5:13 16 Gervásio Paulo da Silva, 1Matthias Mack , Jonas Contieroc (2009), Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology Biotechnology Advances 27:30–39 17 Huijberts GNM, Vanderwal H, Wilkson C, Eggink G (1994) Gaschoromatographic analysis of poly(3-hydroxyalkanoates) in bacteria Biotechnol Technol 8-187 18 Lee SY (1996a), Bacterial polyhydroxyalkanoates Biotechnol Bioeng 49:1-14 19 Lee SY (1996b), Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria Trends in Biotechnology 14:431-438 20 Mothes G, Schnorpfeil C, Ackermann JU (2007), Prodution of PHB from the crude glycerol Engineering in life Sciences 7:475-479 21 Peters V, Rehm BHA (2005), In vivo monitoring of PHA granule formation using GFP-labeled PHA synthases FEMS Microbiology Letters 248, 93-100 22 Philip S, Keshavarz T, Roy I (2007), Polyhydroxyalkanoates: biodegradable polymers with a range of applications Journal Chemical Technology and Biotechnology 82:233-247 23 Quillaguamán J, Van-Thuoc D, Guzmán H, Guzmán D, Martín J, Everest A, HattiKaul R (2008), Poly(3-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis in fed-batch culture Applied Microbiology Biotechnology 78:227-232 24 Solaiman DKY, Ashby RD, Foglia TA, Marmer WN (2006), Conversion of agricultural feedstock and coproducts into poly(hydroxyalkanoates) Applied Microbiology Biotechnology 71:783-9 33 Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân 25 Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbuchel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds Archives of Microbiology 171:73-80 26 Sudesh K, Abe H, Doi Y (2000) Sythesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoate: biological polyesters Progress in Polymer Science 25:1503-1555 27 Sujatha K, Shenbagarathai R (2006) Astudy on medium chain lenght polyhydroxyalkanoate accumulation in Escherichia coli harbouring phaC1 gene of indigenous Pseudomonas sp LDC-5 Letter in Applied Microbiology 43:607-14 28 Thuoc DV (2009) Production of poly(3-hydroxybutyrate) and ectoines using a halophilic bacterium Doctoral thesis Lund University, Lund, Sweden P13-15, p18-21, p36 29 Valappil SP, Peiris D, Langley GJ, Herniman JM, Boccaccini AR, Bucke C, Roy I (2007), Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis from structurallyunrelated carbon sources by a newly characterized Bacillus spp Journal of Biotechnology 127:475-487 30 Verlinden RAJ, Hill DJ, Kenward MA, Williams CD, Radecka I (2007), Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroalkanoates Journal of Applied Microbiology 102: 1437-1449 Webside 31 http://en.wikipedia.org/wiki/Glycerol 32 http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&langpair=en %7Cvi&rurl=translate.google.com.vn&u=http://mic.sgmjournals.org/content/14 5/11/3205.full&usg=ALkJrhhkimqTqeOLz1K9mWsnxTNX3tTNbw 33 http://sggp.org.vn/khoahoc_congnghe/2010/3/220038 34 http://www.vietnamchemtech.com.vn/chitietTT.asp?cate_id=4&news_id=473 34 ... phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh? ?? Mục tiêu Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa hiệu glycerol thành PHA Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng. .. Một hướng nghiên cứu chuyển hóa glycerol thành polyhydroxyalkanoate Với lý trên,chúng tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển hóa glycerol thành polyhydroxyalkanoate (PHA) nhờ số chủng vi khuẩn phân. .. luận Chúng phân lập 200 chủng vi khuẩn từ đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh Trong chủng chúng tơi tuyển chọn 17 chủng có khả tích lũy PHA để tiến hành nghiên cứu Ba chủng 32, 56,