19 biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA. Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngƣợc lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Các bƣớc để tiến hành kỹ thuật RFLP: Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu đƣợc với enzyme cắt Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp Xác định kích thƣớc của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện Southern blot và đƣa ra kết luận Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thƣớc rất khó phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không dễ gì phát hiện ra đƣợc sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận đƣợc hình ảnh là một dải liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng. 2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau: 20 Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình. Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp. Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra kết luận. 2.6 Các enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá cuối năm 1960, có khả năng cắt DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích gen. Ngƣời ta phân ra làm ba loại enzyme: Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự , nó sẽ di chuyển một đoạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Loại 2 là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử. Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide. Có hai kiểu cắt chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng: Kiểu cắt đầu bằng: Kiểu cắt đầu dính: …TGG CCA… …ACC GGT… …C GGCCG… …GCCGG C… Enzyme Eco52I …AG CT… …TC GA… Enzyme AluI Enzyme BalI 21 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1 Thời gian, địa điểm 3.1.1 Thời gian Khóa luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005. 3.1.2 Địa điểm Lấy mẫu máu, da tai tại trại giống Đông Á, huyện Dĩ An tỉnh Bình Dƣơng. Tiến hành xét nghiệm mẫu để phát hiện gen thụ thể prolactin tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống. 3.3 Nội dung thực hiện Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai. Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống. Phân tích kiểu gen của các heo giống Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm Vật liệu Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu máu và mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái tại trại giống Đông Á. Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đƣng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nƣớc đá, bình tam giác. 22 Các thiết bị, máy móc  Tủ cấy vô trùng  Bồn ổn nhiệt  Máy li tâm  Tủ định ôn  Tủ lạnh  Máy đo OD  Tủ sấy dụng cụ  Thiết bị điện di  Máy chụp gel  Lò vi sóng 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Thu thập mẫu Các mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên trên các heo nái giống Yorkshire. Các loại mẫu lấy bao gồm: Lấy máu từ tỉnh mạch tai Lấy mẫu da tai Mỗi con heo thì lấy đồng thời mẫu máu và mẫu da tai. Cách thu thập và bảo quản mẫu Mẫu máu: lấy khoảng 1-1.5 ml máu ở mỗi cá thể heo. Máu đƣợc cho vô ống nghiệm vô trùng chứa sẵn 4mg Na 2 ETDA. Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng. Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70 o C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20 o C. khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích. 23 3.4.2.2 Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu của Roe và ctv, 1998) 1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm 400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10 o C, lấy cặn. 2. Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở 10 o C, lấy cặn. Lặp lại bƣớc này cho đến khi phần cặn trở nên trắng. 3. Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS 10 %; 3 µl proteinase K (20 mg / ml), ủ hỗn hợp gần 1 giờ trong tủ ấm ở 55 o C. 4. Cho vào 60 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1.5 ml mới, sau đó cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ - 20 o C trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, bỏ phần nổi lấy phần cặn, làm ráo. 7. Cho vào 100 l TE 1X, vortex, ủ 55 o C trong 15 phút. 8. Cho vào 10 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 250 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20 o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 500 l ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55 o C. 11. Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55 o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20 o C hoặc sử dụng ngay. Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 đƣợc Lê Thị Thu Phƣơng (2004) điều chỉnh) 1. Cho khoảng 5 mm 3 da vào eppendorf 1.5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 24 2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS, pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml). Ủ hổn hợp ở 55 o C trong 1 giờ. 3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây. 4. Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20 o C trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, lấy cặn, làm ráo. 7. Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55 o C trong 15 phút. 8. Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều , ủ ở - 20 o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm 55 o C 11. Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55 o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20 o C hoặc sử dụng ngay. 3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Tiến hành đo sản phẩm DNA ly trích bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 – 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính bằng công thức: Nồng độ (ng / μl) = OD 260 nm *62,9 - OD 280 nm *36 DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. 3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn Xây dựng qui trình phản ứng PCR o Xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR 25 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version 2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer: Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’ Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’ Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng 4 o C. Vincent (1998) đã đƣa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này để thực hiện phản ứng PCR. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí nghiệm của nƣớc ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR Qui trình 1 Qui trình 2 Bƣớc Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) 1 2 3 4 5 93 93 60 72 72 180 30 60 60 3 93 93 62 72 72 180 30 60 60 3 Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại 35 lần  Ghi chú:  Qui trình 1 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong việc phát hiện gen PRLR (qui trình 2 trang 26)  Qui trình 2 là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR 26 Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer – dimer sẽ xuất hiện, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá ít. Do đó việc xác định tỉ lệ giữa nồng độ primer và DNA mẫu trong phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Để xác định nồng độ thích hợp của primer trong phản ứng PCR phát hiện gen PRLR chúng tôi tiến hành thực hiện ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ở (bảng 3.2) Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR theo qui trình nhiệt 2 Thành phần Nồng độ cuối Qui trình 1 Qui trình 2 Qui trình 3 PCR bufer 10X MgCl 2 (25 mM) dNTPs ( 2,5 mM / µl) Mồi xuôi (10 pmol / µl) Mồi ngƣợc (10 pmol / µl) Taq polymerase (5UI / µl) DNA khuôn 1 X 2 mM 1 mM 5 pmol 5 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 10 pmol 10 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 15 pmol 15 pmol 0,6 UI 20 ng Thể tích ( l) 25 25 25 Ghi chú:  Qui trình 2 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong công tác phân tích sự đa hình của gen PRLR  Qui trình 1, 3 là qui trình thí nghiệm xác định nồng độ primer thích hợp nhất Xác nồng độ các hoá chất cắt enzyme giới hạn AluI Thể tích của các chất tham gia trong việc xử lý enzyme giới hạn đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.3 sau: 27 Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI Thành phần Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 Thể tích (µl) Thể tích (µl) Thể tích (µl) Nƣớc cất RE 10X Buffer Acetylated BSA (10 µg / µl) DNA (*) Enzyme (10 UI / µl) 16,3 2 0,2 1 0.5 17,2 2 0,4 20 0,4 11,75 2,5 0,6 10 0,15 Tổng thể tích 20 40 25  Ghi chú:  (*) – Nồng độ DNA ở cả 3 qui trình khác nhau: ở qui trình 1 nồng độ DNA theo đề nghị của nhà sản xuất là 1 µg / µl; qui trình 2, 3 là sản phẩm PCR  Qui trình 1 là qui trình đề nghị của nhà sản xuất  Qui trình 2 đƣợc đề nghị bởi A.L. Vincent (1998)  Qui trình 3 là qui trình thí nghiệm Ủ hỗn hợp 3 - 12 giờ. 3.4.2.4.2 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích Chọn qui trình PCR và qui trình cắt enzyme giới hạn thích hợp nhất để phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Yêu cầu của các qui trình đƣợc áp dụng để phát hiện ra gen thụ thể prolactin nhƣ sau:  Qui trình PCR xem là thích hợp khi nó có tính ổn định cao, phát hiện ra sự hiện diện của gen thụ thể một cách chính xác không xuất hiện trƣờng hợp âm tính giả hoặc dƣơng tính giả. Các sản phẩm PCR thu đƣợc không xuất hiện các băng phụ mà chỉ hiện diện sản phẩm chính. . tai. Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống. Phân tích kiểu gen của các heo giống Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp. prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích Chọn qui trình PCR và qui trình cắt enzyme giới hạn thích hợp nhất để phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Yêu cầu của các qui. dụng để phát hiện ra gen thụ thể prolactin nhƣ sau:  Qui trình PCR xem là thích hợp khi nó có tính ổn định cao, phát hiện ra sự hiện diện của gen thụ thể một cách chính xác không xuất hiện