Đang tải... (xem toàn văn)
Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật
TRƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHOA CÔNG NGHỆ KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM “Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen Thái Nguyên, 2014 Thái Nguyên, 2014 Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH • Đặt vấn đề • Nội dung • Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Đặt vấn đề Đặt vấn đề • Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó. Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen chuyển. • Để khẳng định ĐV có được chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật hay không. Phương pháp thường hay sử dụng đó là các kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Nouthern blot….) Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Hình ảnh một số động vật chuyển gene Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Hình ảnh một số động vật chuyển gene Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Nội dung Nội dung 1. Khái niệm về lai phân tử 2. Các phương pháp lai phân tử 3. Các phương pháp khác 4. Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử • Lịch sử: - 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic được phát triển. - Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid). Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử => Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử *Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA. Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết Hydro nối liền mạch. Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là lai phân tử. * Đặc điểm của lai phân tử: -Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung. -Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lại DNA-RNA. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử - Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA. - Ảnh hưởng của độ dài DNA - Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch). - Ảnh hưởng của môi trường phản ứng. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH [...]... và mô *Ứng dụng: - Trong đối tượng nghiên cứu phức tạp bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ - Xác định mối tương quan giữa các hoạt động phiên mã và dịch mã của cùng một gen Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 4.Kết luận • Những phần trên đã trình bày về kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen • Các phương pháp lai phân tử rất có ý nghĩa trong việc kiểm. .. 2.2 Lai trên pha rắn * Nguyên tắc: - Giống với nguyên tắc lai trên pha lỏng - Khác ở chỗ một trong 2 trình tự bổ sung được cố định trên một giá thể rắn *Ưu điểm: -Dễ dàng trong thao tác tách các trình tự không lai ra khỏi các phân tử -ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng 1 phân tử *Nhược điểm: -Phân tích và định lượng các phân tử lai kém chính xác và hiệu quả lai thấp -Vận tốc lai kém so với lai. .. • • Lai tại chỗ Lai khuẩn lạc Lai trên NST Lai trên tế bào và mô Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.1 Lai tại chỗ *Định nghĩa: + Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô + Lai tại chỗ được sử dụng để định vị những đoạn acid nucleic bổ sung với mẫu dò được đánh dấu đặc thù trên NST trong tế bào sinh vật nhận thật hoặc tế bào vi khuẩn *Nguyên tắc: ... 43CNSH 2 Phân loại - Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S1 , sắc kí trên hydroxylapatite) - Lai trên pha rắn ( thường sử dụng hơn) : + Southern blot +Nouthern blot +Western blot +Dot ( slot ) blot Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1 Lai trong pha lỏng Nguyên tắc: +Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm +Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động. .. Southern blot Nguyên tắc: Màng lai nitrocelluse có khả nagw tiếp nhậ DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứ lai nucleic acid khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960 Các bước tiến hành: • Cắt DNA bằng enzyme giới hạn • Điện di sản phẩm cắt trên gel • Làm biến tính DNA • Chuyển DNA lên màng lai • Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu • Định vị các phân tử lai DNA-mẫu... điểm: Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên mà mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Do t hay 1 khe_Slot) Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manif old) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai. .. của kháng nguyên- kháng thể để phát hiện protein điện di trên gel SDS-PAGE và chuyển lên màng lai • Phương pháp này cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau * Các bước thực hiện: • Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE • Các pr được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel • Ủ màng lai với... hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 dịch huyền nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.3 Lai trên NTS Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.4 Lai trên tế bào và mô *Mục đích: Nghiên cứu chức năng và sự... 43CNSH 3.2 Lai khuẩn lạc *Mục đích: Dùng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen *Các bước tiến hành: - Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai - Màng lai sau đó sẽ được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA - Việc cố định trên màng lai và thao tác lai diễn biến theo các bước tương tự như ở các phương pháp lai trên... màng lai trong hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme • Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các Nhóm SVTH : điểm sáng phát ra do enzyme Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.3 Phương pháp Western blot Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.4 Dot và slot blot Mục đích: Định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Phương pháp này có thể sử dụng . dung 1. Khái niệm về lai phân tử 2. Các phương pháp lai phân tử 3. Các phương pháp khác 4. Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử • Lịch. 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử => Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai DNA như 1 kỹ thuật. đồng giữa chúng Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái 1.Khái niệm về lai phân tử niệm về lai phân tử *Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA. Khi 1 phân tử DNA mạch