Đang tải... (xem toàn văn)
Với mục tiêu để chủ động phân tích hàm lượng cholesterol của các mẫu thực phẩm cũng như xem xét sự biến đổi của cholesterol trong quá trình lên men một số nguyên liệu, nên chúng tôi quyết đinh thực hiện đề tài: “Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng cholesterol thực phẩm được chiết bằng dung môi toluene trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao”.
MỤC LỤC PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 2.1 Tổng quan cholesterol 2.1.1 Tình trạng chất lượng cholesterol chất 2.1.2 Nhu cầu cholesterol người 2.1.3 Vai trò cholesterol thể 2.1.4 Giới hạn tối đa hàm lượng cholesterol thực phẩm 10 2.2 Giới thiệu phương pháp phân tích xác định cholesterol 10 2.2.1 Phương pháp sắc ký khí/ sắc ký khí - ion hóa lửa (GC / GC- FID) 10 2.2.2 Phương pháp enzym 11 2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .11 2.3 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 12 2.3.1 Khái niệm 12 2.3.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 12 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng phê duyệt phương pháp xác định hàm lượng cholesterol chất 14 2.4.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 14 2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 15 2.4.3 Giới hạn phát (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 17 2.4.4 Độ lặp lại và độ tái lặp .18 2.4.5 Độ 18 2.4.6 Độ không đảm bảo đo 18 PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 3.1 Đối tượng .20 3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 3.3 Thiết bị và dụng cụ .21 3.4 Nội dung nghiên cứu 21 i 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Xác định hàm lượng cholesterol mẫu .23 3.5.2 Phương pháp bớ trí thí nghiệm 25 3.5.3 Phê duyệt phương pháp phân tích hàm lượng cholesterol chất 26 PHẦN THỨ TƯ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 4.1 Xây dựng đường chuẩn hợp chất Cholesterol 34 4.2 Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc 35 4.3 LOD, LOQ, độ tái lặp, độ lặp lại 36 4.4 Độ lặp lại, độ tái lặp .38 4.4.1 Độ lặp lại 38 4.4.2 Độ tái lặp 39 4.5 Độ 40 4.6 Độ không đảm bảo đo 41 PHẦN THỨ NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1 Tài liệu tiếng Việt 6.2 Tài liệu tiếng anh PHỤ LỤC DANH MỤC BẢN YBảng 2.1 Hàm lượng cholesterol 100g thức ăn phổ biến từ động vật 10 Bảng 2.2 Loại phát hiện, giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát (LOD) phương pháp hiển thị 17 Bảng 3.1 Hố chất cần dùng cho thí nghiệm .20 Bảng 3.2.Dụng cụ và thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.3 Giới hạn chấp nhận độ lặp lại và độ tái lặp nồng độ khác 30 Bảng 4.1 Nồng độ và khoảng tuyến tính 34 Bảng 4.3 Độ lặp lại phương pháp phân tích Cholesterol 39 Bảng 4.5 Độ thu hồi cholesterol mẫu trứng 41 ii Bảng 4.6 Độ khơng đảm bảo đo phương pháp phân tích Cholesterol với mẫu trứng 42 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cholesterol thành phần quan trọng máu Hình 2.2 Cấu trúc phân tử cholesterol Hình 2.3 Sơ đồ cấu tạo chung hệ thống HPLC và detector UV-Vis 13 Hình 2.4 Sắc kí đồ chất chuẩn với pha động là acetonitrila: isopropanol (95:05), tốc độ dòng là 2μm/min, , m/min, , λ=210nm Đỉnh: (1) 6- cetocolestanol; (2) cholesterol 14 Hình 2.5 Sắc kí đồ chất chuẩn với pha động l à acetonitrila: isopropanol (85:15), tớc độ dịng là 2μm/min, , m/min, λ=210nm Đỉnh: (1) 6- cetocolestanol; (2) cholesterol .15 Hình 2.6 Sắc ký đồ tổng dòng ion cholesterol và dẫn xuất 5α-cholestan BSTFA 15 Hình 2.7 Đường chuẩn sử dụng để xác định lượng cholesterol mẫu thí nghiệm Hồi quy tuyến tính cho thấy mới tương quan tớt (y = 7,89 x + 13,47;R2 = 0,9981) 16 Hình 2.8 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích peak chuẩn cholesterol Hồi quy tuyến tính cho thấy mối tương quan tốt (y = 3591,19 x - 44462;R2= 0,9981) 17 Hình 4.1 Phương trình đường chuẩn cholesterol .35 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng anh tên khoa học Tiếng việt HPLC High performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà phân tích hóa học LOD Limit of detetion Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng HPTLC High-performance thin-layer chromatography Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao TCVN ISO Tiêu chuẩn Việt Nam International Organization for Standardization v Tiêu ch̉n hóa Q́c tế PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cholesterol là thành phần lipid máu, là thành phần tế bào màng đồng thời đóng vai trò quan trọng hầu hết hoạt động thể Cholesterol hình thành từ nguồn: từ thể tổng hợp từ thức ăn Khoảng 75% cholesterol máu sản xuất gan và quan khác thể, phần lại là từ thức ăn[ CITATION EMR95 \l 1033 ] Các loại thực phẩm có chứa cholesterol là loại thức ăn có nguồn gớc từ động vật thịt, sữa, lịng đỏ trứng, phủ tạng động vật Có loại cholesterol tốt là cholesterol tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein Cholesterol - HDL) và cholesterol xấu là cholesterol tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein cholesterol - LDL) Dư thừa cholesterol xấu là nguyên nhân gây tăng lipid máu, bệnh tim mạch và mạch máu não [ CITATION EMR95 \l 1033 ] Cholesterol là tiền chất hormone steroid, axit mật và vitamin D Mức độ bất thường cholesterol tiền chất quan sát thấy bệnh khác người, chẳng hạn bệnh tim, đột quỵ, tiểu đường loại II, bệnh não và nhiều bệnh khác Hiện tại, nhà sản xuất hướng đến việc sản xuất thực phẩm có hàm lượng cholesterol thấp Việc định lượng cholesterol thực phẩm là quan trọng Thông tin sai lệch hàm lượng cholesterol thực phẩm và tác động thực sự liên quan đến việc tiêu thụ dẫn đến việc giảm tiêu dùng sản phẩm động vật, gây bất lợi dinh dưỡng Do đó, việc định lượng xác cholesterol quan trọng đới với người có nguy mắc bệnh này Hiện nay, để phân tích cholesterol, sử dụng phương pháp phương pháp enzyme, phương pháp sắc ký (khí, lỏng khới phổ) Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng Phương pháp hóa học cổ điển tương đối đơn giản và không tốn quy trình gồm nhiều bước Phương pháp enzyme cho đánh giá cao mức cholesterol thực phẩm có chứa dầu thực vật Phương pháp sử dụng sắc ký phân tích đồng thời nhiều hợp chất, độ phân giải cao nhờ trình tách cột, độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò, thể tích mẫu phân tích nhỏ (11 100uL) tớn Hiện nhiều phịng thí nghiệm sử dụng sắc ký khí để phân tích cholesterol có tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12385:2018 hướng dẫn thực Ngoài ra, việc sử dụng dung môi xúc tác vô quan trọng q trình phân tích hàm lượng cholesterol Có nhiều loại dung mơi sử dụng để pha lỗng chất thí nghiệm là dung mơi chứa nhóm thơm, dạng mạch thẳng, gớc xeton, gớc alcohol (VD: methano, isopropanol, ) Tuy nhiên cholesterol tan dung môi hữu nên muốn chiết xuất cholesterol từ chất ta sử dụng dung mơi hữu là toluene (chứa nhân thơm), hexane (mạch thẳng), aceton nitril… Về ưu điểm: toluene chất lỏng khơng màu, cháy được, độ nhớt thấp, là dung mơi hịa tan tốt chất béo, dầu, nhựa thông, lưu huỳnh, photpho và iot, toluene tan nước, độ hịa tan vào nước 16°C là 0,047g/100ml 15°C là 0,4g/100ml Do chúng phù hợp làm dung mơi phân tích cholesterol Tuy nhiên toluene có nhược điểm là nhiệt độ bắt cháy toluene dưới 21°C nên toluene là loại chất lỏng nguy hiểm với nước Với áp suất bảo hòa là 2,9KPa 20°C, chúng bay tương đối nhanh và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe người Hiện phương pháp này chưa thử nghiệm thiết bị Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Với mục tiêu để chủ động phân tích hàm lượng cholesterol mẫu thực phẩm xem xét sự biến đổi cholesterol q trình lên men sớ nguyên liệu, nên đinh thực đề tài: “Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng cholesterol thực phẩm chiết dung môi toluene hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao” 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chung Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng cholesterol trứng chiết dung môi hexane hệ thớng sắc kí lỏng hiệu cao tiến tới làm chủ và phát triển thành công phương pháp phân tích hàm lượng cholesterol cho kết có độ xác cao phục vụ cho sớ nghiên cứu để phát triển loại thực phẩm có hàm lượng cholesterol thấp, đáp ứng nhu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định khoảng tuyến tính, đường chuẩn; - Xác định tính đặc hiệu, chọn lọc; - Xác định giới hạn phát (LOD) hàm lượng Cholesterol mẫu trắng; - Xác định giới hạn định lượng (LOQ) hàm lượng Cholesterol mẫu trắng; - Xác định độ lặp lại hàm lượng Cholesterol mẫu thử; - Xác định độ tái lặp hàm lượng Cholesterol mẫu thử; - Xác định độ không đảm bảo đo hàm lượng Cholesterol mẫu thử PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cholesterol Cholesterol là phần chất béo steroid, mềm, màu vàng nhạt, có màng tế bào tất mô thể và vận chuyển huyết tương động vật (Steinberg, 2006) Cholesterol đóng vai trị quan trọng đới với sức khỏe người Thơng thường, cần thể để cách điện dây thần kinh tạo màng tế bào và sản xuất sớ kích thích tớ, vitamin D và chất hỗ trợ tiêu hóa Nó cần thiết cho việc xây dựng tế bào khỏe mạnh (Hongbao, 2004) Dư thừa cholesterol máu hình thành mảng bám động mạch tường Cholesterol và mảng bám tích tụ làm cho động mạch trở nên dày hơn, khó và đơi chặn dòng máu đến tim và quan quan trọng khác[ CITATION And031 \l 1033 ] Cholesterol hình thành từ nguồn là từ thể tổng hợp từ thức ăn Khoảng 75% cholesterol máu sản xuất gan và quan khác thể, phần lại là từ thức ăn[ CITATION EMR95 \l 1033 ] Các loại thực phẩm có chứa cholesterol là loại thức ăn có nguồn gớc từ động vật thịt, sữa, lịng đỏ trứng, nội tạng động vật, tất là thực phẩm quen thuộc và cần thiết cho sự phát triển người Nguồn: benhvienthucuc, 20171 Hình 2.1 Cholesterol thành phần quan trọng máu https://benhvienthucuc.vn/chi-so-cholesterol-la-gi/ 1.2.3 Tình trạng chất lượng cholesterol chất Cholesterol là chất béo steroid, tan nước tan nhiều mỡ và tạo este với axit béo, khơng thể tan và khơng di chuyển dạng tự máu Ngoài cholesterol tan dung môi hữu nên muốn chiết xuất cholesterol từ chất ta sử dụng dung môi hữu là toluene (chứa nhân thơm), hexane (mạch thẳng), aceton nitril…Ngoài Cholesterol tan nhiều dung mơi hữu Cholesterol có cơng thức cấu tạo sau: Nguồn megasun, 20152 Hình 2.2 Cấu trúc phân tử cholesterol Nhìn vào cơng thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cholesterol là nhân sterol tổng hợp từ phân tử axetyl - CoA và phần phân tử cholesterol là rượu cồn (alcohol) Cholesterol có nhiều loại thực phẩm khác nội tạng động vật, sữa tươi và đặc biệt trứng gà là loại thực phẩm có chứa nhiều cholesterol, chủ yếu là lịng đỏ trứng gà cịn lịng trắng khơng có ít[CITATION And031 \l 1033 ] Cholesterol là lipid bao gồm bốn vịng hydrocarbon gắn với hydroxyl-hydro gắn với nhóm oxy Cấu trúc bớn vịng làm cho cholesterol trở thành chất steroid, và nhóm hydroxyl mang lại cho tính chất amphipathic tính ưa nước và hydrophobic 1.2.4 Nhu cầu cholesterol người Cholesterol là chất béo steroid cần thiết cho thể, có màng tế bào tất mô thể và vận chuyển huyết tương động vật thể người[CITATION And031 \l 1033 ] Theo sớ nghiên cứu để http://www.mega-sun.vn/chi-tiet/146-87/cholesterol-la-gi.html