i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang quan tâm, bảo giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tơi có kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin dành l ời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Thị Ngọc Thanh Thầy Nguyễn Văn Duy, B ộ môn Công nghệ Môi Trường, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang định hướng, dìu dắt tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán quản lý phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, tạo điều kiện thời gian, dụng cụ, máy móc để tơi hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên lớp 50CNMT, toàn thể bạn sinh viên thực tập phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện, động viên khích lệ để tơi vượt qua khó khăn trình học tập vừa qua Nha Trang, tháng năm 2012 Sinh viên Đặng Thị Thương ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ CÁ GIÒ 1.1 1.1.1 Tên gọi cá Giò 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Màu sắc kích thước 1.1.4 Nơi sống, sinh học nghề cá 1.1.5 Phân bố 1.1.6 Phân loại theo cấp bậc 1.1.7 Giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế .6 1.2 TÌNH HÌNH NI TRỒNG THỦY SẢN, CÁC VẤN ĐỀ TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 1.2.1 Tình hình ni trồng thủy sản Việt Nam giới .7 1.2.2 Các vấn đề phát sinh nuôi trồng thủy sản 13 1.2.2.1 Tình hình dịch bệnh ni trồng thủy sản 13 1.2.2.2 Các vấn đề môi trường nuôi trồng thủy sản 16 1.3 1.3.1 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 19 Khái niệm bacteriocin 19 iii 1.3.2 Phân loại bacteriocin 21 1.3.3 Một số tính chất bacteriocin 25 1.3.3.1 Phạm vi hoạt động Bacteriocins 27 1.3.3.2 Cơ chế hoạt động Bacteriocin 27 1.3.3.3 Kiểu hoạt động Bacteriocin 28 1.3.4 Lợi ích hạn chế bacteriocin 30 1.3.5 Tình hình nghiên cứu bacteriocin giới Việt Nam 32 1.3.6 Ứng dụng bacteriocin 36 1.3.6.1 Ứng dụng bacteriocin kiểm soát vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm 36 1.3.6.2 Ứng dụng bacteriocin ngành công nghiệp thủy sản chống lại hư hỏng dịch bệnh 38 TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC (PROBIOTICS) 42 1.4 1.4.1 Thành phần chế phẩm sinh học 43 1.4.2 Cơ chế tác động chế phẩm sinh học 44 1.4.3 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học giới Việt Nam 46 1.4.4 Ứng dụng chế phẩm sinh học 48 1.4.4.1 Ứng dụng nuôi trồng thủy sản 48 1.4.4.2 Ứng dụng xử lý môi trường 51 1.4.4.3 Một số ứng dụng khác 52 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 54 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 2.2.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 54 2.2.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 55 iv 2.2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn tổng số 55 2.2.2.2 Phương pháp bảo quản giữ giống 57 2.2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 58 2.2.2.4 Phương pháp xác định đặc điểm sinh học định danh chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 61 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 64 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN TỔNG SỐ TỪ RUỘT CÁ GIÒ 65 3.2 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN 68 3.2.1 Kết tuyển chọn sơ chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 68 3.2.2 Kết kiểm tra chất protein dịch bacteriocin thô với enzym protease K 72 3.3 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC 82 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substance BQTP Bảo quản thực phẩm ĐBSCL Đồng Sông Cửu Long ĐBSH Đồng Sông Hồng FAO Food and Agriculture Organization GLOBALGAP On-Farm Food Safety standard HACCP Hazard Analysis of Critical Control Points IHNV Infectious Hematopoietic Necrosis Virus LAB Lactic Acid Bacteria NNPTNT Nông nghiệp phát triển nông thôn NTTS Nuôi trồng thủy sản OMV Oncorhynchus Masou Virus PCR Polymerase Chain Reaction PTN-CNSH Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học SQF Safe – Quality - Food Program TSA Tryptone Soya Agar TSB Tryptone Soya Broth UBND Ủy ban Nhân Dân VACB Vườn – Ao – Chuồng - Biogas VK Vi khuẩn vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số lồi cá Giị mơi trường sống chúng Bảng 1.2 Phân loại theo cấp bậc cá Giò (Siganus canaliculatus ) Bảng 1.3 Sản lượng nuôi trồng thủy sản giới năm 2001 theo vùng nước Bảng 1.4 Sản lượng nuôi trồng thủy sản kim ngạch xuất thủy sản năm 2006 – 2010 10 Bảng 1.5 Diện tích mặt nước ni trồng thuỷ sản năm 2006–2010 10 Bảng 1.6 Tình hình khai thác ni trồng thủy sản từ năm 2007 đến tháng năm 2011 12 Bảng 1.7 Sản lượng thủy sản quý tháng 5/2012 tháng đầu năm 2012 13 Bảng 1.8 Một số tác nhân gây bệnh, bệnh cách điều trị 14 Bảng 1.9 Bacteriocin kháng sinh 20 Bảng 1.10 Phân loại bacteriocin 24 Bảng 1.11 Tính chất hóa lý số bacteriocin vi khuẩn Gram dương 26 Bảng 1.12 Một số bacteriocin từ vi khuẩn biển 34 Bảng 1.13 Ví dụ thử nghiệm bacteriocin sản phẩm thủy sản 41 Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn biển phân lập từ cá Giò 65 Bảng 3.2 Kết phân lập chủng vi khuẩn từ ruột cá Giò 66 Bảng 3.3 Kết tuyển chọn sơ chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ ruột cá Giò 69 Bảng 3.4 Kết kiểm tra với enzym protease K 72 Bảng 3.5 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Alcaligenes faecalis T20 với trình tự tương đồng Genbank công cụ BLAST 76 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá Giị (Siganus canaliculatus) Hình 1.2 Cấu trúc nisin 22 Hình 1.3 Kiểu hoạt động bacteriocin vi khuẩn lactic (LAB) 29 Hình 1.4 Số lượng báo nghiên cứu bacteriocin thời kỳ 10 năm từ 1950-2010 trích dẫn Pubmed 33 Hình 2.1 Sơ đồ cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 54 Hình 2.2 Quy trình thử hoạt tính kháng khuẩn dịch bacteriocin thô với chủng vi khuẩn thị 59 Hình 2.3 Hình ảnh minh họa bước nhuộm Gram 62 Hình 3.1 Khuẩn lạc mọc riêng rẽ đĩa thạch độ pha loãng 10-7 65 Hình 3.2 Hình ảnh cấy ria khiết khuẩn lạc 69 Hình 3.4 Vòng kháng chủng T20 chủng thị B1.1 V1.1 71 Hình 3.5 Kết kiểm tra với enzyme protease K T20 T22 72 Hình 3.6 Hình ảnh cấy điểm chủng T20 T22 sau 48 370C 73 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào chủng T22 (bên trái) T20 (bên phải) quan sát kính hiển vi độ phóng đại X-100 74 Hình 3.8 Khả chịu muối chủng vi khuẩn T20 74 Hình 3.9 Trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Alcaligenes faecalis T22 (1342 bp) 76 MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài 3.260 km, với diện tích vùng biển rộng triệu km2, gấp lần diện tích đất liền Tính đa dạng sinh học biển đánh giá lớn, chưa nghiên cứu đầy đủ Các hướng nghiên cứu quan tâm từ trước đến thường tập trung vào đa dạng động vật tảo biển Tuy nhiên, nghiên cứu vi khuẩn biển, tương quan với động vật chủ, tiềm ứng dụng lĩnh vực nuôi trồng hải sản, cịn hạn chế Ni trồng thủy sản lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nước ta Tuy nhiên, dịch bệnh thường xuyên xảy gây thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹ năm Trong số tác nhân gây bệnh vi khuẩn điển hình lồi Vibrio, coi nguyên nhân Hơn nữa, với tượng biến đổi khí hậu tồn cầu, quan ngại đối vi khuẩn gây bệnh ngày tăng lên, nhiệt độ cao khả gây bệnh truyền nhiễm tăng theo Chất kháng sinh nuôi trồng thủy sản dường hiệu việc lạm dụng mức Việc sử dụng chất kháng sinh không làm tăng khả kháng bệnh vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thường gây tượng cân vi sinh mà cịn làm tích lũy gốc kháng sinh sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, giải pháp thay thân thiện với môi trường sử dụng vaccine, chất kháng sinh hệ hay probiotic đề xuất (Corripio-Myar et al., 2007; Smith, 2007) Tuy nhiên, sử dụng vaccine thường tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân cơng gây stress mạnh cho động vật nuôi Do vậy, sử dụng vi khuẩn sinh bacteriocin giải pháp thay phù hợp với vai trị kép bacteriocin chất kháng sinh hệ an toàn thân thiện với sức khỏe người môi trường, vi khuẩn đóng vai trị probiotic Trong nhiều năm qua bacteriocin thường thu nhận từ vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ loại thực phẩm nhằm ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, để ứng dụng phòng trừ dịch bệnh cho lĩnh vực nuôi trồng hải sản, vi khuẩn sinh bacteriocin cần phân lập từ sinh vật biển hay môi trường nước biển để thích nghi với thay đổi nhiệt độ độ mặn điều kiện ni Vì vậy, vi khuẩn sống bám động vật biển nguồn thích hợp để phân lập tuyển chọn chủng sinh bacteriocin Hơn nữa, loài động vật hải sản địa phương nguồn mẫu tốt cho việc phát loài vi khuẩn với loại bacteriocin Việc đánh giá đa dạng sinh học vi khuẩn sinh bacteriocin góp phần cung cấp hiểu biết đặc điểm sinh lý- sinh thái- tiến hóa vi sinh vật biển mối tương tác với động vật chủ với vi khuẩn đích gây bệnh Hơn nữa, bacteriocin hay BLIS ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm hay làm thuốc phòng trừ bệnh vi khuẩn cho người, gia súc, gia cầm hay động vật biển Đặc biệt, ứng dụng tiềm từ kết đề tài việc phát triển chất kháng sinh hệ probiotic dẫn tới giảm thiểu dịch bệnh nuôi trồng hải sản Sự thành công đề tài chắn đóng góp tích cực vào phát triển bền vững nghề nuôi trồng hải sản cung cấp cho ngư dân địa phương giải pháp để giảm thiểu thiệt hại, nâng cao chất lượng sống bảo vệ môi trường khu vực Việc thực đề tài cấp thiết phù hợp cho hoạt động nuôi trồng hải sản nước, khơng khía cạnh khoa học mà cịn ứng dụng thực tiễn Vì chọn đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ ruột cá Giò nhằm định hướng ứng dụng nuôi trồng thủy sản bền vững.” Nội dung đề tài: - Thu mẫu động vật (Cá Giò) vùng vịnh Nha Trang – Khánh Hòa - Phân lập vi khuẩn tổng số từ ruột cá Giò - Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin sống ruột cá Giị - Thử hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn sống ruột cá Giò - Xác định đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn sinh bacteriocin CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ GIÒ 1.1.1 Tên gọi cá Giò Cá Giò tên gọi địa phương Còn tên khoa học theo tiếng Latinh lồi cá Giị nghiên cứu Siganus canaliculatus Lồi cá Giị có tên gọi khác cá Dìa Chúng thuộc họ cá Giị Siganidae, họ theo Fishbase có hai chi 25 loài Chúng sống vùng Ấn độ – Thái Bình Dương Biển Địa Trung Hải Bảng 1.1 Một số lồi cá Giị mơi trường sống chúng Loài S argenteus S canaliculatus S corralinus S fuscescens S guttatus S javus S lineatus S luridus S punctatus S puellus S rivulatus S vermiculatus Môi trường sống Cá con: bãi cỏ rạn san hô Cá trưởng thành: vùng nước mở Cá con: bãi cỏ; rừng ngập mặn Cá trưởng thành: chủ yếu sống bãi cỏ, ngồi sống rạn san hơ rừng ngập mặn Rạn san hô Rạn san hô, thảm thực vật đáy vùng nước nông, nước ven bờ Cá con: Trong rễ vùng bóng rừng ngập mặn, vịnh nông, cửa sông Cá trưởng thành: ven biển trước sau cửa sông Biển, vùng nước lợ, nước ngọt, cửa sơng, hồ bến cảng Cá con: rừng ngập mặn, dọc theo bờ bến tàu Cá trưởng thành: rạn san hô, bãi cỏ, dọc theo bờ bến tàu Các rạn san hô ngầm Các rạn san hô ngầm Các rạn san hô ngầm, vùng cỏ biển Vùng nước nông cảng, bãi cát hồ đá Rừng ngập mặn Nguồn [4] Trong lồi cá Giị lồi cá Giị chấm trắng (Siganus canaliculatus) chọn để nghiên cứu đề tài 72 kháng VK Gram (-) Gram (+) gây bệnh cho vật nuôi nâng cao hiệu NTTS 3.2.2 Kết kiểm tra chất protein dịch bacteriocin thô với enzym protease K Chúng tiến hành kiểm tra với enzym proteinase K với chủng T20 T22 để kiểm tra chất protein dịch bacteriocin thô Bảng 3.4 Kết kiểm tra với enzym protease K Các chủng Đường kính vịng phân giải (mm) vi khuẩn Enzym Enzym Mẫu đối biển kiểm STT protease K catalase chứng tra T20 T22 0 20 12 20 22 Kết Bacillus B1.1 Vibrio V1.1 + + - (+ khơng có vịng kháng khuẩn; - có vịng kháng khuẩn) Hình 3.5 Kết kiểm tra với enzyme protease K T20 T22 Giếng số 1,2: Dịch ngoại bào để điều kiện bình thường(2-40C); Giếng C-pK: Giếng xử lý enzym Catalase+Proteinase K; Giếng C: Giếng xử lý catalase Nhận xét: Kết thí nghiệm cho thấy chủng VK T20 T22 thể kết dương tính loại enzym protease K Ở giếng có xử lý enzym, chủng T20 T22 khơng có vịng kháng Điều bacteriocin (thu từ dịch nuôi T20, T22) bị phân cắt enzyme protease K khiến bacteriocin hoạt tính kháng khuẩn Như vậy, dịch bacteriocin chủng T20, T22 có chất 73 protein Do đó, chọn chủng T20, T22 để tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh 3.3 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN Đặc điểm hình thái chủng T20 T22 Sau tuyển chọn chủng VK sinh bacteriocin, tiến hành cấy điểm chủng môi trường TSA để quan sát mơ tả hình thái khuẩn lạc cách rõ ràng Sau tiến hành cấy điểm chủng T20 T22 ta mơ tả cách rõ ràng hình thái khuẩn lạc chủng VK sau: Khuẩn lạc T20: Hình trịn, bề mặt nhám, nhân lồi màu Vàng đậm, khuẩn lạc có màu vàng Khuẩn lạc T22: Hình trịn, bề mặt nhám, có nhân lồi, màu trắng sữa ngả vàng nhạt Hình 3.6 Hình ảnh cấy điểm chủng T20 T22 sau 48 370C Kết nhuộm Gram Đối với chủng T20, T22 thể tính kháng mạnh với chủng Bacillus B1.1 chủng Vibrio V1.1 Khi tiến hành nhuộm Gram tế bào chủng này, nhìn kính hiển vi ta thấy khuẩn lạc chủng T20 có màu hồng, khuẩn lạc chủng T22 có màu tím Kết chủng T20 VK Gram (-), T22 vi khuẩn Gram (+) 74 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào chủng T20 (bên trái) T22 (bên phải) quan sát kính hiển vi độ phóng đại X-100 Kết khả chịu muối chủng T20 Hình 3.8 Khả chịu muối chủng vi khuẩn T20 75 Mỗi lồi VK có khả chịu đựng nồng độ muối khác VK phân lập VK từ vi sinh vật biển nên khả chịu muối tương đối cao, chủng VK T20 có khả sống sót mơi trường có nồng độ muối nhỏ 6% Điều thể chỗ đường cấy ria VK mơi trường TSB có nồng độ muối từ 26% VK mọc lên Kết định danh vi khuẩn biển sinh bacteriocin Sau kiểm tra chất protein dịch bacteriocin, chủng sinh bacteriocin đem định danh nhờ kỹ thuật PCR Chủng T20 sau kiểm tra chất protein thấy tính kháng thể rõ nên đưa định danh Kết định danh trình bày sau đây:  Kết giải trình tự đoạn gen 16S rDNA vi khuẩn phân lập T20 sau : CTCTCTTGGT GGCGAGTGGC GGACGGGTGA GTAATATATC GGAACGTGCC 50 51 CAGTAGCGGG GGATAACTAC TCGAAAGAGT GGCTAATACC GCATACGCCC 100 101 TACGGGGGAA AGGGGGGGAT CGCAAGACCT CTCACTATTG GAGCGGCCGA 150 151 TATCGGATTA GCTAGTTGGT GGGGTAAAGG CTCACCAAGG CAACGATCCG 200 201 TAGCTGGTTT GAGAGGACGA CCAGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA 250 251 GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATT TTGGACAATG GGGGAAACCC 300 301 TGATCCAGCC ATCCCGCGTG TATGATGAAG GCCTTCGGGT TGTAAAGTAC 350 351 TTTTGGCAGA GAAGAAAAGG CATCCCCTAA TACGGGATGC TGCTGACGGT 400 401 ATCTGCAGAA TAAGCACCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC 450 451 GTAGGGTGCA AGCGTTAATC GGAATTACTG GGCGTAAAGC GTGTGTAGGC 500 501 GGTTCGGAAA GAAAGATGTG AAATCCCAGG GCTCAACCTT GGAACTGCAT 550 551 TTTTAACTGC CGAGCTAGAG TATGTCAGAG GGGGGTAGAA TTCCACGTGT 600 601 AGCAGTGAAA TGCGTAGATA TGTGGAGGAA TACCGATGGC GAAGGCAGCC 650 651 CCCTGGGATA ATACTGACGC TCAGACACGA AAGCGTGGGG AGCAAACAGG 700 701 ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCCTAAA CGATGTCAAC TAGCTGTTGG 750 751 GGCCGTTAGG CCTTAGTAGC GCAGCTAACG CGTGAAGTTG ACCGCCTGGG 800 76 801 GAGTACGGTC GCAAGATTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GACCCGCACA 850 851 AGCGGTGGAT GATGTGGATT AATTCGATGC AACGCGAAAA ACCTTACCTA 900 901 CCCTTGACAT GTCTGGAAAG CCGAAGAGAT TTGGCCGTGC TCGCAAGAGA 950 951 ACCGGAACAC AGGTGCTGCA TGGCTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT 1000 1001 TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT TGTCATTAGT TGCTACGCAA 1050 1051 GAGCACTCTA ATGAGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGA 1100 1101 CGTCAAGTCC TCATGGCCCT TATGGGTAGG GCTTCACACG TCATACAATG 1150 1151 GTCGGGACAG AGGGTCGCCA ACCCGCGAGG GGGAGCCAAT CTCAGAAACC 1200 1201 CGATCGTAGT CCGGATCGCA GTCTGCAACT CGACTGCGTG AAGTCGGAAT 1250 1251 CGCTAGTAAT CGCGGATCAG AATGTCGCGG TGAATACGTT CCCGGGTCTT 1300 1301 GTACACACCG CCCGTCACAC CATGGGAGTG GGTTTCACCA GA 1342 Hình 3.9 Trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Alcaligenes faecalis T20 (1342 bp) Các trình tự phân tích, chỉnh sửa phần mềm BioEdit 7.1.3.0 Genious Pro 5.5.7, so sánh với trình tự nucleotide tương đồng Genbank chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) Kết so sánh điểm tương đồng xuất Bảng 3.5 Bảng 3.5 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Alcaligenes faecalis T20 với trình tự tương đồng Genbank công cụ BLAST Tỉ lệ Mức ý che phủ nghĩa Độ tương đồng Alcaligenes faecalis strain NR_043445.1 IAM12369 16S ribosomal RNA, complete sequence 100% 0.0 99% Alcaligenes faecalis subsp parafaecalis strain G 16S NR_025357.1 ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99% Kí hiệu gen Mô tả 77 Alcaligenes faecalis subsp phenolicus strain J 16S NR_042830.1 ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 97% Pusillimonas noertemannii NR_043129.1 strain BN9 16S ribosomal RNA, complete sequence 99% 0.0 96% Achromobacter spanius strain LMG 5911 16S NR_025686.1 ribosomal RNA, partial sequence 99% 0.0 96% Kết luận : Theo kết giải trình tự nucleic đoạn gen 16S rDNA ta đưa so sánh đoạn gen với trình tự tương đồng Ngân hàng gen (Genbank) Theo kết so sánh Bảng 3.10 có tất chủng đạt yêu cầu bao gồm: NR_043445.1 (99%); NR_025357.1 (99%); NR_042830.1 (97%) tất chủng thuộc lồi lồi Căn vào ta thấy chủng vi khuẩn biển phân lập từ ruột cá Giị T20 thuộc chi Alcaligenes faecalis có độ tương đồng cao với chi Alcaligenes faecalis; Alcaligenes faecalis subsp parafaecalis 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, đưa rút số kết luận sau: 1) Qua lần lấy mẫu cá Giò phân lập 35 chủng VK từ ruột cá Giò tuyển chọn 11 chủng VK có hoạt tính bacteriocin thơ Các chủng VK thể tính kháng rõ rệt, đường kính vịng kháng khuẩn rộng, vịng kháng khuẩn tương đối Số lượng chủng VK có hoạt tính kháng khuẩn chiếm 31,42% so với tổng số VK phân lập 2) chủng có hoạt tính kháng khẩn mạnh T20 T22, với kích thước vịng phân giải chủng thị Bacillus B1.1 tương ứng 22mm 20mm, chủng thị Vibrio V1.1 tương ứng 10mm 20mm chọn nghiên cứu 3) Kết thử với enzyme protease K cho thấy chủng VK T20 T22 sau xử lý enzyme bị hoạt tính kháng khuẩn chủng thị B1.1 Như chủng VK chúng tơi nghiên cứu có khả sinh bacteriocin để kháng lại chủng VK gây bệnh tôm, cá NTTS 4) Sơ xác định nồng độ muối thích hợp để ni cấy chủng VK T20 từ 2-6% Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng VK T20 là: Khuẩn lạc có hình trịn, bề mặt nhám, nhân lồi màu vàng đậm, khuẩn lạc có màu vàng Hình thái khuẩn lạc chủng T22 là: hình trịn, bề mặt nhám, có nhân lồi, màu trắng sữa ngả vàng nhạt Bằng phương pháp nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào chủng T20, T22 Kết cho thấy chủng VK T20 VK Gram (-), chủng VK T22 VK Gram (+) 5) Chủng T20 có vịng kháng mạnh đưa định danh kỹ thuật PCR Kết giải trình tự nucleic đoạn gen 16S rARN ta đưa so sánh đoạn gen với trình tự tương đồng ngân hàng gen (Genbank) Căn vào ta thấy chủng VK biển phân lập từ ruột cá Giò T20 thuộc chi thuộc chi Alcaligenes faecalis có độ tương đồng cao với chi Alcaligenes faecalis; Alcaligenes faecalis subsp parafaecalis 79 KIẾN NGHỊ Vì điều kiện thời gian có hạn, chúng tơi tiến hành số thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng VK phân lập nên kết số hạn chế Vì tơi đề nghị số ý kiến sau: - Cần mở rộng địa điểm lấy mẫu số lượng khối lượng mẫu để tăng tính điển hình kết nghiên cứu - Tiến hành thí nghiệm xác định đặc điểm dịch bacteriocin chủng T20, T22 chủng tuyển chọn như: độ bền nhiệt, pH, thời gian ni cấy thích hợp … - Tiến hành thêm số thí nghiệm để xác định yếu tố ảnh hưởng điều kiện tối ưu để nuôi cấy VK phân lập như: xác định khả lên men loại đường, khả sinh hơi, khả di động, thời gian ni cấy, pH thích hợp, nhiệt độ ni cấy chủng VK có hoạt tính phân lập - Định danh, xác định đặc điểm sinh học, phân loại chủng VK lại tuyển chọn 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đa dạng sinh học, khả sinh bacteriocin tính chất probiotic hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa động vật (gà), Đề tài Khoa học 2004-2005, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, Mã số: 62 05 04 [2] Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh, 2004 Một số đặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Báo cáo Khoa học năm 2004, Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam [3] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008) Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm Nhà xuất đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Duy Chinh Tổng quan nguồn lợi thủy sản, chiến lược sách phát triển ngành thủy sản Việt Nam Hà Nội, 2008 [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, 1972 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, Nxb KH & KT, Hà Nội [6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 2, Nxb KH & KT, Hà Nội [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập Nxb KH & KT, Hà Nội [8] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tỵ (2005) Vi sinh vật học Nxb KH & KT, Hà Nội [9] Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng Huỳnh Lê Tâm (2004) Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [10] Nguyễn Thị Bích Lân, 2011 Nghiên cứu phân lập số chủng VK có hoạt tính protease sống bám cá chim vây vàng Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang [11] Nguyễn Phong Hải (Đại Học Nha Trang, Tư Vấn IMOLA), Stefano Carboni (Đại Học Bách Khoa Marche, Tư Vấn IMOLA), Nhóm Khảo Sát Thuộc Chi Cục Khai Thác Và Quản Lí Nguồn Lợi Thủy Sản Thừa Thiên Huế Phân Loại Cá Ở Phá Tam Giang Cầu Hai I 81 [12] Trần Linh Thước, 2002 Phương pháp phân tích VSV nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục, Hà Nội [13] Tăng Thị Chính, Viện Công nghệ môi trường, Viện KH&CN Việt Nam Nghiên cứu, sản xuất probiotics ứng dụng chúng để xử lý ô nhiễm môi trường [14] Tổng cục Thủy sản - Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Hoạt động bảo vệ môi trường, lĩnh vực NTTS giai đoạn 2006-2010 Tài liệu tiếng Anh [15] Cotter PD, HillC, Ross PR, 2005 Bacteriocins: developing innate immunity for food Nat Rev Microbiol, 3(10):777-788 [16] Chen H, Hoover DG, 2003 Bacteriocins and their food applications Comp Rev Food Sci Food Safety, 2: 82-100 [17] Das S, Ward L, Burke C, 2008 Prospects of using marine actinobacteria as probiotics in aquaculture Appl Microbiol Biotechnol, 81: 419-429 [18] Desriac F, D Defer, N Bourgougnon, B Brillet, P Le Chevalier and Y Fleury, 2010 Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic Mar Drugs, 8:1153-1177 [19] M.N DuRay Biology and Culture of Siganids Aquaculture department southeast asian fisheries development center, April, 1998 [20] Nguyen Van Duy (2011): Marine bacteriocin as a new drug for aquaculture health Proceedings of the International Conference of Marine Biotechnology and Environment, Nha Trang 25/02/2011 [21] Suphan Bakkal, Sandra M Robinson and Margaret A Riley University of Massachusetts Amherst USA Bacteriocins of Aquatic Microorganisms and Their Potential Applications in the Seafood Industry 82 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Công thức môi trường sử dụng thí nghiệm A Mơi trường phân lập mơi trường thử hoạt tính VSV a Mơi trường:Tryptone Soya Broth (TSB) Thành phần môi trường TSB tổng hợp (trong 1000ml) STT Thành phần Trypticase pepton Phytone pepton NaCl K2HPO4 Khối lượng 17 g STT Khối lượng Thành phần Glucose 3g 5g 2,5 g Nước cất pH 1l 7,3 ± 0,2 2,5 g Hịa tan 30 g mơi trường TSB tổng hợp 1000 ml nước cất, điều chỉnh pH, sau đem rót mơi trường vào bình tam giác, làm nút giấy bạc, hấp khử trùng nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5atm, thời gian 15 phút b Môi trường: Trytone Soya Agar (TSA) Môi trường TSA pha từ mơi trường TSB có bổ sung thêm thạch agar Nếu pha môi trường TSA để thử hoạt tính bổ sung thêm 20 g agar/ 1000ml, khơng bổ sung muối sau rót vào bình tam giác 150 ml môi trường c Môi trường: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) STT Thành phần Peptone Cao nấm men Sucrose Sodium thiosulfate.75H20 Sidium citrate.72H20 Sodium cholate Oxgall Khối lượng 10 g 5g 20 g STT Thành phần Khối lượng 10 10g lg 0,04g 2,5 g 11 NaCl Ferric citrate Bromothymol blue Thymol blue 10g 12 Agar 15g 3g 5g 13 Nước cất lít 0,04g 83 Chuẩn bị bình tam giác tích lớn lần so với thể tích cần dùng Cho chất vào nước cất làm ấm đun nóng để hịa tan Chỉ để vừa sơi nhắc Không hấp khử trùng Để nguội đến 500C đổ đĩa B Môi trường tăng sinh: Ankaline Peptone Water (APW) Thành phần môi trường APW STT Thành phần Khối lượng Pepton 10 g NaCl 30 g Nước cất 1000ml pH 8.5 ± 0.2 Hoà tan thành phần, điều chỉnh pH theo yêu cầu chia vào bình tam giác có dung tích 100ml, bình 45 ml Đậy nút bơng, giấy bạc đem hấp nhiệt độ 121oC 1,5atm 15 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bị nhiễm, bay nước pH bị thay đổi Phụ lục 2: Hóa chất thuốc thử A Dung dịch Glycerol Dung dịch Glycerol giữ lọ tối màu bọc nắp giấy bạc cẩn thận, bảo quản tủ lạnh Trước giữ chủng cần hấp khử trùng 1210C, 1,5atm khoảng 15 phút B Thuốc thử dùng để nhuộm Gram  Thuốc nhuộm Tím Violet - Tím violet :1g - Rượu ethylic :1g - Phenol tinh thể : 2g -Nước cất : 100 ml  Pha chế -Hòa tan g tím Violet vào 10 ml cồn (dung dịch 1) -Hòa tan g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2) 84 -Trộn chung dung dịch dung dịch lại với ta có dung dịch thuốc nhuộm tím Violet  Thuốc nhuộm Liugol -Iod tinh thể -KI :1g :2g -Nước cất : 200 ml Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau cho KI vào, bảo quản lọ tối màu  Thuốc nhuộm Fuschin -Fuschink : 1g -Rượu ethylic 95% : 10 ml -Phenol tinh thể : 5g -Nước cất : 100 ml  Pha chế: -Hòa tan Fuschin vào 10 ml cồn 95% (dung dịch 1) -Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2) - Trộn dung dịch dung dịch đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin Phụ lục 3: Thiết bị chuyên dụng - Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam) - Kính hiển vi mắt ngắm có camera máy tính (Motic BA 300, Mỹ) - Máy lắc (GFL 3005, Đức) - Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy (Binder, Đức) - Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) - Lị vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc) - Máy Vortex - Máy dập mẫu 85 Phụ lục 4: Hoạt tính bacteriocin chủng phân lập 86 Phụ lục 5: Hình thái khuẩn lạc số chủng phân lập ... cạnh khoa học mà ứng dụng thực tiễn Vì chúng tơi chọn đề tài ? ?Phân lập tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ ruột cá Giị nhằm định hướng ứng dụng ni trồng thủy sản bền vững. ” Nội dung đề... vật (Cá Giò) vùng vịnh Nha Trang – Khánh Hòa - Phân lập vi khuẩn tổng số từ ruột cá Giò - Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin sống ruột cá Giò - Thử hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn. .. HÌNH NI TRỒNG THỦY SẢN, CÁC VẤN ĐỀ TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VI? ??T NAM VÀ THẾ GIỚI 1.2.1 Tình hình ni trồng thủy sản Vi? ??t Nam giới .7 1.2.2 Các vấn đề phát sinh nuôi trồng thủy sản