Bộ khoa học công nghệ Viện ứng dụng Công nghƯ Trung t©m sinh häc thùc nghiƯm C6 Thanh Xu©n Bắc, Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm bảo quản số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản TS.Hoàng Thị Kim HOa 6123 25/9/2006 Hà nội, 12-2005 Bản quyền 2005 thuộc TTSHTN Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Giám đốc TTSHTN trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Thông tin đề tài Tên đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm bảo quản số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản Chủ nhiệm Điện thoại (CQ) : TS Hoàng Thị Kim Hoa : 8549438 Địa quan : C6- Thanh xuân bắc - Đống ®a – Hµ Néi Thêi gian thùc hiƯn : 12 tháng (từ tháng 1/2005 đến tháng 12/ 2005) 4.Cơ quan chủ trì thực : Trung tâm Sinh học Thực nghiệm Cơ quan chủ quản : Viện ứng dụng công nghệ Tên tổ chức KH & CN: Trung t©m Sinh häc Thùc nghiƯm Kinh phÝ Tỉng số : 218.000.000 đ (Hai trăm mời tám triệu đồng) Từ ngân sách SNKH : 218.000.000 đ (Hai trăm mời tám triệu đồng) Cán thực đề tài Chủ nhiệm đề tài: TS Hoàng Thị Kim Hoa, Trung tâm Sinh học thực nghiệm Các cán thực chính: - CN Trần Bảo Trâm - Trung tâm Sinh häc thùc nghiƯm - Ths Ngun Tr©m Anh- Trung t©m Sinh häc thùc nghiƯm - CN Ngun Thanh Mai- Trung tâm Sinh học thực nghiệm - CN Nguyễn Thị Huyền - Trung tâm Sinh học thực nghiệm Mục tiêu: - Đa qui trình phân lập làm bảo quản giống vi tảo có giá trị dinh dỡng cao ứng dụng nhân giống thuỷ sản Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris - Từng bớc xây dựng tập đoàn giống tảo có chất lợng tốt để cung cấp cho sở sản xuất giống thuỷ sản Nội dung: - Nghiên cứu qui trình bỏ tảo lạ động vật phù du tạo giống tảo (Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris) - Nghiên cứu ảnh hởng số loại kháng sinh lên sinh trởng tảo vi sinh vật - Nghiên cứu bảo quản thử giống tảo kĩ thuật làm bất động - Đề xuất qui trình phân lập làm bảo quản giống tảo Chữ viết tắt TA Ký hiệu kháng sinh thuộc nhóm carbonhydrat NĐKS Nồng ®é kh¸ng sinh TN – ThÝ nghiƯm D salina – Dunaliella salina N oculata – Nannochloropsis oculata T chuii – Tetraselmis chuii Ch vulgaris – Chlorella vulgaris I galbana – Isochrysis galbana EPA – Eicosapentaenoic acid DHA – Docosahexanenoic acid Lời mở đầu Trong số công trình nghiên cứu trớc đà giới thiệu giá trị dinh dỡng vi tảo biển cần thiết sử dụng tảo làm thức ăn cho giống nuôi trồng nhân giống nhân tạo loài hải sản Do loài vi tảo biển có giá trị dinh dỡng cao, giàu chất có hoạt tính sinh học phù hợp cho động vật biển giai đoạn non nên nớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển, vấn đề sản xuất tảo trại giống đợc trọng Kinh phí đầu t cho viƯc s¶n xt t¶o chiÕm tíi 50% kinh phÝ trại giống nớc ta, năm gần loài vi tảo biển đà đợc nuôi trồng phục vụ nhân giống hải sản nhiều trại giống Tuy nhiên việc sản xuất tảo trại giống hải sản gặp nhiều khó khăn cha có nguồn giống ổn định Thực tế cho thấy giống tảo sau thời gian ngắn nuôi trồng bị nhiễm tạp loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm động vật phù du, làm giảm suất chất lợng tảo, ảnh hởng đến trình sản xuất giống hải sản Vì cần có nguồn giống tốt để thờng xuyên cung cấp cho sản xuất Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm bảo quản lâu dài số giống tảo có giá trị kinh tÕ cao ®Ĩ cung cÊp gièng chđ ®éng, ỉn định, kịp thời cho việc sản xuất giống thuỷ sản trại giống cần thiết Phần I: Tổng quan tài liệu Các loài vi tảo biển có kích thớc bé, giàu dinh dỡng, giàu chất có hoạt tính sinh học phù hợp để sử dụng cho động vật biển giai đoạn non Vì vi tảo đợc sử dụng nuôi trồng thuỷ sản nh nguồn thức ăn tơi sống thiết yếu động vật thân mềm mảnh vỏ ( sò, điệp, ngao, vẹm, trai .), ấu trùng bào ng, tôm, số loài cá động vật phù du sử dụng dây chuyền thức ăn phục vụ nuôi trồng thuỷ sản Trong bốn thập kỷ qua hàng trăm loài tảo đà đợc thử nghiệm đà chọn đợc vài chục loài có khả nhân nuôi sinh khối ứng dụng thuỷ sản Chúng thuộc ngành tảo lục (Chlorophycophyta), tảo khuê (Bacilariophyta) tảo roi cụt (Haptophyta) Theo tác giả Brown et al ( 1991, 1992, 1997, 1999), Renaud et al (1999), Knuckey et al (2002), loại tảo có kích thớc nhỏ, thành tế bào mỏng, dễ tiêu hoá, giàu dinh dỡng, hàm lợng protein, axit amin, lipít, cacbonhydrat vitamin cao, thích hợp cho sinh trởng ấu trùng động vật biển, đặc biệt loài vi tảo có hàm lợng a xít béo cao, có axit béo không no mạch dài (DHA, EPA) chiếm từ 49,7-77,9% tảo lục chroomonas, từ 19,852,6% tảo diatoms prymnesiophytes ) Các axít cần thiết cho sinh trởng phát triển động vật biển giai đoạn ấu trùng (inquiries@aquafauna.com) Vì trại giống trọng đến việc nuôi tảo Kinh phí để sản xuất tảo chiếm từ 15-50% kinh phí trại giống Để đảm bảo hiệu trình sản xuất hải sản, cần có nguồn thức ăn tảo với chất lợng cao, muốn nguồn giống tảo cho trình sản xuất sinh khối phải đạt chất lợng tốt Thờng giống tảo sau thời gian ngắn nuôi trồng bị nhiễm tạp loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm động vật phù du Để đáp ứng nguồn tảo giống cho trại sản xuất thờng xuyên phải cung cấp giống (sạch, tốt) từ tập đoàn giống gốc Vì vậy, giống cần đợc thờng xuyên phân lập bảo quản điều kiện thích hợp nớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển nh Mỹ, úc, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore có sở cung cấp giống tảo chất lợng cao dịch vụ kèm nhằm đảm bảo có giống tốt, cung cấp ổn định cho sản xuất Tuy nhiên việc phân lập tảo gặp nhiều khó khăn kích thớc tế bào tảo nhỏ, sống kết hợp với vi sinh vật loài ký sinh khác Vì việc tách vi khuẩn khỏi tảo khó Gerloff cộng (1950), Kbutko (1961) đà làm tảo lam cách sử dụng tia cực tím Tuy nhiên phơng pháp có nhợc điểm gây ®ét biÕn di trun Baccep vµ céng sù (1989) ®· sử dụng phơng pháp cấy tảo thạch Sau chọn khuẩn lạc mong muốn cấy tiếp vào môi trờng lỏng để tảo phát triển, tiếp tục lấy tảo từ môi trờng lỏng cấy tiếp vào môi trờng thạch Quá trình đợc lặp lại nhiều lần thu đợc tảo Cách phân lập đợc sử dụng phổ biến.Tuy nhiên với phơng pháp nh tốn nhiều thời gian không loại bỏ đợc vi khuẩn bám chặt vào lớp nhầy quanh tế bào tảo Stein (1973) cho thấy tảo nhận đợc cách rửa kỹ sử dụng nhiều loại kháng sinh để diệt khuẩn nhng không nêu sử dụng loại kháng sinh Để nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian phân lập, Alenkhina cộng (2001) đà sử dụng chất diệt khuẩn Methiolat để tách vi khuẩn khỏi tảo lam Kết cho thấy nồng độ Methiolat 2ppm có tác dụng diệt khuẩn nhng không làm ảnh hởng đến sinh trởng chủng tảo lam nghiên cứu Việc nghiên cứu làm khuẩn loài vi tảo biển nói chung chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrryis galbana, Tetraselmis chuii, Chlorella vulgaris đợc công bố Sau có đợc tảo sạch, vấn đề giữ giống quan trọng Thờng tảo đợc giữ điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thấp để hạn chế sinh trởng Tuy nhiên điều kiện giống giữ không đợc lâu, dễ nhiễm, chất lợng Vì vậy, vấn đề bảo quản giống trở nên xúc đợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Morris (1978), Fenwick vµ céng sù (1992), Pedro Canavate vµ céng sù (1995), Hong Quan Liu cộng (2004) đà nghiên cứu bảo quản số loài tảo kỹ thuật đông lạnh, phơng pháp đòi hỏi phải áp dụng số phơng thức đặc biệt nhằm hạn chế tổn thơng tế bào (Moris, 1987) nh dùng chất chống đóng băng, điều khiển tốc độ làm lạnh, tốc độ làm ấm, sử dụng yếu tố điều hoà nhiệt độ, nồng độ muối, Các tác giả cho thấy: Có hai phơng pháp đông lạnh đông lạnh bớc đông lạnh hai bớc Đông lạnh bớc tảo sau ủ, cho vào cọng rạ đa thẳng vào nitơ lỏng (-196 o C) (Tsuzu, 1973; Beu-Amotz Gilboa, 1980) Đông lạnh bớc tảo đợc đông lạnh điều kiện có kiểm soát nhằm giảm h hại trình tạo băng, sau a vào nitơ lỏng Kết nghiên cứu Pedro canavate cộng (1995) cho thấy: Tuỳ theo phơng pháp làm lạnh, nồng độ chất chống đóng băng, nồng độ muối, môi trờng đặc điểm giống nên khả sống tảo sau bảo quản khác Đối với Chaetoceros glacilis, tỉ lệ sống đạt 2,9-7,3%; Rodomonas baltica 2,2-3,1%; Isochrysis galbana tõ 9,3-25,8%, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis gaditana Nannochloropsis atomus không bị ảnh hởng trình làm lạnh Theo nhận xét nhiều tác giả: bảo quản kĩ thuật đông lạnh phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố Ngoài trình đông lạnh, hình thành băng đột ngột xảy làm h hại tế bào (Moris, 1987), việc sử dụng hoá chất chống lạnh gây độc tế bào làm ảnh hởng đến khả sống tảo Điều đà đợc mô tả tảo Chlorella (Moris.1976), tảo khuê (Mclellan, 1989) vµ Tetraselmis suecica (Fenwiek and Day, 1992) Ngoµi ra, sử dụng kĩ thuật đông lạnh đòi hỏi số thiết bị đặc chủng, chi phí cao, khó thực Vì vậy, công nghệ bảo quản mang tính u việt hơn: phức tạp, chi phí thấp, phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm sở sản xuất đợc nhà khoa học nghiên cứu áp dụng Đó bảo quản tảo cách làm bất ®éng (immobilization) (Tamponet vµ céng sù ,1985; Hertherg and Jensen, 1989; Susana Romo and Carmen Berer-Martiner ,1997; YeanChang-Chen, 2001,2003) KÕt nghiên cứu Tamponnet cộng (1985) Hertzberg and Jensen (1989) cho thấy giống tảo khuê đợc làm bất động gel trì đợc cấu trúc nguyên vẹn hoạt tính sinh lí số tháng, điều gợi ý sử dụng kĩ thuật bảo quản giống tảo Tuy nhiên tác giả lu ý giống tảo thí nghiệm có giống tảo Phaeodactylum tricornutam Skeletonema costatum cho kết tốt Tác giả Susana Romo and Carmen Perez Martinez (1997) đà thử nghiệm kĩ thuật làm bất động để bảo quản giống tảo lam Pseudanabaena galeata Bocher (cyanobacteria) đánh giá khả sống, đặc điểm sinh lí, sinh hoá cấu trúc chúng sau thời gian bảo quản 14-18 tháng Kết cho thấy tảo sau đợc bảo quản tỉ lệ sống đạt 93%, sinh trởng tốt, khác biệt cấu trúc tế bào, sinh hoá tốc độ sinh trởng tảo thí nghiệm tảo đối chứng Các tác giả nhận xét việc xử lí dờng nh ảnh hởng đến khả sinh trởng chức tảo Pseudanabaena galeata, hàm lợng C, H, N P tế bào tảo đợc bảo quản tế bào tảo đối chứng khác biệt đáng tin cậy Tảo sau bảo quản đợc đa vào môi trờng thích hợp để sinh trởng Tác giả Yean-Chang-Chen (2001) đà nghiên cứu kĩ thuật làm bất động Scenedesmus quadricauda hạt gel để bảo quản tảo lâu dài Tảo đợc cố định kĩ thuật làm bất động giữ đợc hoạt tính sinh lí sau năm bảo quản điều kiện tối hoàn toàn nhiệt độ 4o C, kh«ng cã m«i tr−êng dinh d−ìng Sau cho vào môi trờng thích hợp tuần, số lợng tảo đà tăng lên 40 lần Kết quan sát cho thấy sau trình bảo quản dài ngày, số quan tử (pyrenoids) Scenedesmus quadricauda bị tiêu huỷ Tuy nhiên quan tử phục hồi đa vào điều kiện nuôi thích hợp dinh dỡng ánh sáng Kết nghiên cứu Yean Chang - Chen (2003) tảo Haptophyta; Laz E de Bashan công (2002) tảo Chlorella Azospirillum cho thấy giống tảo sau bảo quản phơng pháp làm bất động có độ nảy mầm cao, sinh trởng tốt đặc biệt chi phÝ b¶o qu¶n thÊp Gièng cã thĨ b¶o qu¶n đợc năm đảm bảo chất lợng tốt Qua kết thu đợc, tác giả nhận xét sử dụng kĩ thuật làm bất động để bảo quản tảo lâu dài phòng thí nghiệm ứng dụng vào thực tế sản xuất nuôi trồng thuỷ sản nhằm giảm chi phí sản xuất so với phơng pháp truyền thống nớc ta năm gần đây, tảo đà đợc sử dụng làm thức ăn tơi sống phục vụ nhân giống hải sản (tôm, cá, bào ng, ngao, sò, động vật hai mảnh vỏ ) Hiện nhu cầu tảo trại giống lớn Nhng để sản xuất tảo mang lại hiệu nh mong muốn, vấn đề giống khâu đặc biệt quan trọng Các sở nhân giống thuỷ sản lớn nh: Trạm nhân giống thuỷ sản nớc mặn Cát Bà, trạm nghiên cứu nhân giống thuỷ sản nớc lợ Quí Kim Đồ Sơn Hải Phòng, số sở nuôi trồng thuỷ sản Miền Trung (Nha Trang, Khánh Hoà, Cửu Hội, Nghệ An) có phận nhân nuôi tảo phục vụ ơm nuôi giống Tuy nhiên giống tảo sử dụng trại giống chủ yếu nhập từ nớc ngoài, trình sử dụng giống thờng bị nhiễm dẫn đến giảm chất lợng Các sở có điều kiện phân lập làm Vì vấn đề sản xuất tảo nhân nuôi giống gặp nhiều khó khăn Ngoài ra, việc giữ giống thờng đợc thực cách nuôi tảo môi trờng lỏng, tủ mát với nhiệt độ 15-17oC Trong điều kiện tảo phát triển nhanh dễ bị nhiễm tạp tảo lạ vi khuẩn Hiện công nghệ bảo quản kỹ thuật làm bất động Việt Nam cha đợc nghiên cứu áp dụng Vì việc nghiên cứu qui trình làm tảo (bao gồm phân lập, loại bỏ tảo lạ, động vật phù du làm khuẩn tiến tới xây dựng tập đoàn giống có chất lợng tốt nghiên cứu kỹ thuật nhằm bảo quản lâu dài giống tảo nhằm chủ động phục vụ sản xuất cần thiết Với mục đích đề xuất đề tài Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm bảo quản số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản Đối với tảo Ch.vulgaris, việc bổ sung kháng sinh TA vào môi trờng nuôi cấy từ đến 20àg /ml có tác dụng hạn chế phát triển vi khuẩn dịch tảo, nhng để loại bỏ đợc hoàn toàn vi khuẩn khỏi tảo cần bổ sung TA với nồng độ 20àg /ml, thời gian nuôi cấy ngày (bảng 31).Nếu sử dụng TA nồng độ cao (40àg /ml), thời gian nuôi cấy cần ngày đà thu đợc tảo khuẩn Tuy nhiên để xác định nồng độ TA thích hợp sử dụng cho tảo Ch.vulgaris cần xem xét ảnh hởng kháng sinh lên sinh trởng tảo Kết thí nghiệm đợc trình bày bảng 32 đồ thị cho thấy tảo Ch.vulgaris đợc bổ sung TA với nồng độ từ 1-40 àg /ml sinh trởng nhanh hơn, mật độ OD tảo công thức thí nghiệm cao nhiều so với công thức không đợc bổ sung TA Sau 14 ngày thí nghiệm công thøc cã bỉ sung TA 20µg /ml vµ 40µg /ml, mật độ OD tảo Ch.vulgaris 0.323 0.386 so với đối chứng 0.295 Bảng 32 : ảnh hởng TA lên sinh trởng tảo Ch.vulgaris Nồng ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 2.5 10 20 40 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 0.164 0.180 0.203 0.209 0.245 0.348 0.232 0.250 0.263 0.253 0.266 0.295 10 0.286 0.298 0.312 0.290 0.305 0.383 14 0.295 0.320 0.332 0.324 0.323 0.386 38 Đồ thị 7: ảnh hởng TA lên sinh trởng tảo Ch.vulgaris 0.45 Mật độ tế bào (OD) 0.4 0.35 µg/ml 0.3 µg/ml 0.25 2.5 µg/ml 0.2 10 µg/ml 0.15 20 µg/ml 0.1 40 µg/ml 0.05 10 14 Thời gian thí nghiệm (ngày) Từ kết thu đợc cho thấy sử dụng TA nồng độ 20àg /ml để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn dịch tảo Ch.vulgaris Nh TA có tác dụng tốt việc loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo để thu tảo khuẩn Nồng độ TA thích hợp với chủng tảo khác nhau: D.salina 1020µg /ml; N.oculata 2.5µg /ml; I.galbana 20µg /ml; T.chuii 10àg/ml Ch.vulgaris 20àg /ml III.3 Nghiên cứu bảo quản tảo kĩ thuật làm bất động Nguyên tắc phơng pháp cố định tảo gel dạng hạt bảo quản nhiệt độ thích hợp điều kiện ánh sáng Sau thời gian bảo quản, tế bào tảo đợc giải phóng cách hoà tan hạt gel nuôi điều kiện thích hợp để tảo sinh trởng Để tìm đợc phơng pháp bảo quản thích hợp chủng tảo nghiªn cøu: Dunaliella salina Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii Chlorella vulgaris, đà tiến hành thử nghiệm số phơng pháp sau: Sử dụng chất tạo gel nồng độ 3%(1), giải đông chất chứa phosphate(1) Sử dụng chất tạo gel nồng độ 1.5%(2), giải đông muối citrate(2) Kết thí nghiệm bảng 33 cho thấy công thức tảo Ch.vulgaris 39 đợc bảo quản chất tạo gel nồng độ 3% (1) sử dụng chất giải đông hợp chất chứa phosphate (1), hạt tảo đợc hoà tan chậm, sau lợng hạt hoà tan khoảng 90% 100% số hạt đợc hoà tan hết sau 45-50 gìơ Dịch tan dạng gel, sau dịch tảo bị đục, t¶o sinh tr−ëng kÐm B¶ng 33: KÕt qu¶ thư nghiƯm bảo quản giống tảo Công thức Ch.vulgaris Nồng độ chÊt b¶o qu¶n (1) Ch.vulgaris (2) (1) Ch.vulgaris (2) (2) Giống tảo Chất giải đông Nhận xét (1) Hạt tảo tan chậm (sau 45- 50 giờ) Dịch tảo đục, tảo sinh trởng Hạt tảo tan sau 4h, dịch tảo dạng gel, đục, tảo sinh trởng Hạt tảo tan nhanh (sau 28 phút) Dịch tảo trong, không xuất thể gel, tảo hồi phục nhanh công thức 2, tảo đợc bảo quản chất tạo gel nồng độ 1,5%(2), sau đợc giải đông hợp chất chứa phosphate (1) tảo tan hết sau 4h, dịch tảo dạng gel, đục Tiếp tục theo dõi sinh trởng tảo sau giải đông cho thấy tảo hồi phục chậm, sinh trởng công thức tảo đợc bảo quản chất tạo gel nồng độ 1.5%(2), sau bảo quản, hạt tảo đợc hoà tan muối citrate (2) Kết cho thấy sau 28 phút, toàn số hạt tảo hoà tan hết, dịch trong, không xuất hịên thể gel, tảo phục hồi tốt Tiếp tục thử nghiệm với chủng tảo Dunaliella salina, Nanochloropsis oculata, Isochrrysis galbana vµ Tetraselmis chuii, chóng thu đợc kết tơng tự 40 Qua kết thu đợc cho thấy sử dụng chất tạo gel nồng độ 3% 1,5% tạo hạt tảo có kích thớc độ cứng đạt yêu cầu (ảnh 6) Tuy nhiên giải đông để giải phóng tế bào tảo, dùng muối citrate tốt muối phosphate, dịch tảo thu đợc sau đợc giải đông không bị đục, tảo phục hồi nhanh Kết thử nghiệm cho thấy nồng độ chất tạo gel 3% 1.5% ảnh hởng đáng kể đến thời gian hoà tan hạt tảo giải đông Tuy nhiên với nồng độ chất tạo gel 1.5%, dịch tảo sau giải đông hơn, thuận lợi cho sinh trởng tảo Vì nên sử dụng chất tạo gel nồng độ 1.5% để bảo quản tảo Sau bảo quản hoà tan hạt tảo muối citrate Hạt tảo sau hoà tan đợc bổ sung môi trờng dinh dỡng đặt tảo dới ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp để tảo sinh trởng, sau kiểm tra trạng thái tế bào hoạt động sinh lÝ cđa t¶o KÕt qu¶ cho thÊy sau b¶o qu¶n, tế bào tảo nguyên vẹn, kích thớc tế bào tảo nhỏ tế bào đối chứng, lục lạp quan tử lệch phía (ảnh 4, trang 44 ), t¶o Ýt di chun TiÕp tơc kiểm tra trạng thái tế bào tảo sau hoà tan nuôi điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp ngày Kết cho thấy: tảo có màu xanh hơn, kích thớc tế bào to dần, phần lớn số tế bào tảo có dạng đặc trng, tế bào tảo trở lại trạng thái bình thờng, chuyển động nhanh Sau 10-15 ngày, tế bào tảo phục hồi bắt đầu sinh trởng tốt Tuy nhiên nhận thấy kết thí nghiệm lần lặp lại không giống phơ thc rÊt nhiỊu ®iỊu kiƯn thÝ nghiƯm nh−: mËt độ tảo đa vào bảo quản, điều kiện gây nuôi sau bảo quản (ánh sáng, nhiệt độ môi trờng, dinh dỡng ).Vì việc nghiên cứu điều kiện gây nuôi tảo sau bảo quản cần thiết III.4.ảnh hởng số điều kiện lên sinh tr−ëng cđa t¶o sau b¶o qu¶n III.4.1 ¶nh hởng mật độ tảo lên kết bảo quản Chúng đà tiến hành thí nghiệm để tìm hiểu ảnh hởng mật độ tảo đa vào bảo quản lên sinh trởng phát triển tảo sau bảo quản Kết 41 cho thấy mật độ tảo đa vào bảo quản có vai trò quan trọng sinh trởng tảo sau bảo quản.ở công thức có mật độ tảo môi trờng bảo quản 102, 103 tế bào/ml, sau giải đông tảo thờng bị vàng, sinh trởng chết công thức có mật độ tảo bảo quản đạt 105, 106 tế bào/ml; sau bảo quản, tảo phục hồi nhanh, sinh trởng tốt Vì để thu đựoc giống tảo có chất lợng tốt, mật độ tảo đa vào bảo quản cần đạt 105, 106 tế bào/ml III.4.2.Nghiên cứu ảnh hởng điều kiện nuôi cấy lên sinh trởng tảo sau bảo quản Nhằm tìm hiểu điều kiện thích hợp, đà tiến hành thử nghiệm gây nuôi tảo sau bảo quản điều kiện nh sau: T1: Nuôi ®iỊu kiƯn nhiƯt ®é 15-17oC, ¸nh s¸ng 1000 - 15000 lux, thời gian chiếu sáng 24/24h T2: Nuôi điều kiện nhiệt độ 25-28oC, cờng độ ánh sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 8/24h Kết bảng 34 cho thấy: công thức T1, tảo phục hồi nhanh, sau 10 ngày gây nuôi điều kiện nhiệt độ thấp 15-17oC, cờng độ chiếu sáng 10001500 lux, hình thái tế bào trở lại trạng thái bình thờng, tảo sinh trởng tốt công thức T2, tảo sau bảo quản đợc gây nuôi điều kiện nhiệt độ 2528oC, cờng độ chiếu sáng 3000 lux Khả hồi phục tảo chậm Sau 20 ngày nuôi cấy điều kiện nói trên, chủng tảo phát triển kém, dịch tảo xuất tủa, tảo nhạt màu dần chết Từ kết thu đợc cho thấy việc trì nhiệt độ thấp (15-17oC) điều kiện tối cần thiết để phục hồi khả sinh trởng tốt tảo sau bảo quản Chúng đà tiến hành thử nghiệm ảnh hởng môi trờng dinh dỡng lên sinh tr−ëng cđa t¶o sau b¶o qu¶n KÕt qu¶ cho thấy sau bảo quản, tảo đợc gây nuôi môi trờng F/2 thích hợp môi trờng G/3 42 Bảng 34: ảnh hởng điều kiện nuôi cấy lên sinh trởng tảo sau bảo quản (tảo Tetraselmis chuii) Thời gian nuôi sau bảo quản Sau giải đông T1 T2 Tế bào có kích thớc nhỏ tế bào bình thờng (không bảo quản), nguyên vẹn, nội bào quan bị lệch phía Tế bào có kích thớc nhỏ tế bào đối chứng (không bảo quản), trạng thái tế bào nguyên vẹn, nội bào quan lệch phía ngày Tế bào có kích thớc lớn hơn, nội Tế bào kích thớc nhỏ, nội bào bào quan không bị lệch quan vÉn lƯch ngµy TÕ bµo cã kÝch th−íc bình thờng, Tế bào có kích thớc nhỏ, nội xuất dạng tế bào đặc trng bào quan không bị lệch tảo T.chuii 10 ngày Phần lớn tế bào có kích thớc bình Tế bào có kích thớc nhỏ, thờng, có dạng đặc trng tảo nhân không bị lệch, cha có T chuii hình dạng đặc trng 20 ngày Tế bào tảo phát triển bình thờng, khác biệt so với tế bào đối chứng (không qua bảo quản) Phần lớn tế bào có kích thớc nhỏ, đà có hình dạng đặc trng tảo T.chuii, môi trờng bắt đầu bị đục Nh việc bảo quản chủng tảo nghiên cứu kĩ thuật cố định mẫu gel, sau giải đông nuôi điều kiện nhiệt độ 15-17oC ánh sáng 1000-2000 lux, sau thời gian từ 10-20 ngày, tế bào tảo phơc håi, sinh tr−ëng tèt (¶nh 5, ¶nh 7) ViƯc cố định mẫu kĩ thuật làm bất động bảo quản nhiệt độ 4oC trì đợc trạng thái nguyên vẹn tế bào hoạt động sinh lÝ cđa t¶o Tuy sau b¶o qu¶n mét số chủng tảo có kích thớc lớn nh T.chuii hình thái tế bào có số thay đổi so với đối chứng: hình dạng không đặc trng, nhân tế bào lệch bên Những thay đổi đợc phục hồi, tế bào sinh trởng phát triển bình thờng sau đợc nuôi điều kiện thích hợp ánh sáng nhiệt độ Đối với chủng tảo lại: D.salina, N.oculata, I.galbana, 43 Chlorella vulgaris, hình thái tế bào sau bảo quản khác biệt so với tảo đối chứng ảnh 4: Tế bào T.chuii sau giải đông ảnh 5: Tế bảo tảo T.chuii sau giải đông tuần ảnh 6: Tảo bảo quản dạng hạt 44 ảnh 7: Bình tảo đối chứng sau bảo quản (T.chuii) 1: Tảo đối chứng 2: Tảo đợc gây nuôi theo công thức T1 3: Tảo đợc gây nuôi theo công thức T2 Từ kết thu đợc cho thấy việc phân lập tảo thông qua công đoạn làm sơ ly tâm tách tảo đà giảm bớt thời gian phân lập nh việc tìm đợc loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo nhng không ảnh hởng đến sinh trởng tảo đà giúp thu đợc nguồn tảo khuẩn, đảm bảo chất lợng giống trình giữ giống nh nhân nuôi sinh khối, tránh tình trạng giống bị vón cục, lắng làm giảm suất, chất lợng tảo Các kháng sinh sử dụng thí nghiệm loại kháng sinh thông dụng: Tetracycline Peflacine kháng sinh thuộc nhóm quinon có tác động rộng, có hiệu chống lại nhiều loại vi khuẩn, gram âm, gram dơng Tuy nhiên dùng Tetracycline không thu đợc kết Tetracycline bị hấp thu nớc có độ cứng cao Ngoài Canxi Magiê môi trờng liên kết với Tetracycline làm cho kháng sinh hoạt tính Vì Tetracycline hiệu cho vào môi trờng lỏng nuôi tảo Mặt khác Tetracycline nhạy cảm với ánh sáng chuyển thành màu nâu bị phân huỷ, điều làm giảm chất lợng môi trờng Ngoài ra, để thu đợc kết thờng phải tăng 45 nồng độ kháng sinh lên mức cần thiết Điều dẫn đến số vi khuẩn kháng Tetracycline (Nusbawm and Shotts,1981) Erythromycine kháng sinh chống lại vi khuẩn gram dơng hiệu Tuy nhiên môi trờng nuôi tảo có sử dụng nớc biển, môi trờng thích hợp cho vi khuẩn gram âm phát triển Kết nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy đa số vi khuẩn biển vi khuẩn gram âm, 80% số loài tìm thấy vùng biển Nam Califonia gram âm Với khuẩn lạc phát triển đĩa thạch có chứa nớc biển phần lớn vi khuẩn gram âm (Zobll cộng sự,1994; Purushothaman A, 1999) Tác giả Nguyễn Thị Thu Hà (2002) nghiên cứu vi khuẩn dị dỡng phân lập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định cho thấy 80% số vi khuẩn phân lập đợc vi khuẩn gram âm Vì Erythromycine hiệu sử dụng với mục đích loại bỏ vi khuẩn chủng tảo thí nghiệm Trong kháng sinh đà nghiên cứu, kháng sinh kí hiệuTA có hiệu tốt Đây loại kháng sinh có phổ tác động rộng phù hợp cho việc loại bỏ vi khuẩn khỏi chủng tảo nghiên cứu để thu tảo khuẩn Việc nghiên cứu thành công phơng pháp bảo quản tảo kĩ thuật làm bất động chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris sÏ gióp ngời làm nghiên cứu tảo, nhân nuôi tảo trại giống nuôi trồng thuỷ sản chủ động đợc nguồn giống tảo, giảm đợc chi phí nhân công thời gian, giảm chi phí sản xuất.Việc giữ giống tảo trở nên đơn giản, hiệu quả, giảm nguy bị nhiễm bẩn, bảo toàn đợc giống với chất lợng tốt Giống bảo quản phơng pháp giữ đợc thời gian lâu dài mà không bị ảnh hởng đến chất lợng 46 Quy trình bảo quản phân lập tảo Thu mẫu tảo Lọc Ly tâm Pha lo·ng Pha lo·ng tiÕp (1 tÕ bµo/1 ml) o CÊy vào ống nghiệm để tảo sinh trởng 17-18oC, AS 1000-1500 lux Cấy lên đĩa thạch 17-18 C, AS 1000-1500 lux, thêi gian 15-20 ngµy KiĨm tra, chän èng nghiƯm cã tảo mong muốn Chọn khuẩn lạc mong muốn 17-18oC, AS 1500- 2000lux Cấy vào môi trờng lỏng Kiểm tra cấy lặp lại đĩa thạch đến thu đợc tảo Nhân sinh khối Xử lý kháng sinh Cố định mẫu, bảo quản oC, tối Giải đông Giữ giống thạch môi trờng lỏng Nhân sinh khối tảo Sản xuất tảo Nuôi giống 47 Phần IV: Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đợc đa số kết luận nh sau: Đà xác định đợc tốc độ thời gian ly tâm thích hợp chủng tảo nghiên cứu từ tiến hành làm sơ cách lọc ly tâm tách tảo Vì rút ngắn đợc thời gian phân lập so với trớc Phân lập đợc chủng tảo thuần: Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris §· nghiên cứu sử dụng số loại kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo Kết cho thấy Tetracycline Peflacine có hiệu việc loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo bổ sung vào môi trờng lỏng Vì nên sử dụng peflacine để bổ sung vào môi trờng thạch với nồng độ từ 20-40àg/ml để giữ giống tảo Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, với nồng độ 80àg/ml để giữu giống tảo Dunaliella salina Peflacine không thích hợp tảo Chlorella vullgaris Tetraselmis chuii Erythromycine tác dụng loại bỏ vi khuẩn khỏi chủng tảo nghiên cứu Mặt khác kháng sinh có ảnh hởng không tốt lên sinh trởng tảo Vì không nên sư dơng Erythromycine víi mơc ®Ých diƯt khn ®Ĩ thu đợc tảo khuẩn Đà xác định đợc loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo kí hiệu TA Nồng độ TA thích hợp chủng tảo khác nhau: Dunaliella salina: 10-20µg/ml; Nanochloropsis oculata: 2.5µg/ml; Isochrrysis galbana: 20µg/ml; Tetraselmis chuii: 10µg/ml vµ Chlorella vulgaris: 20µg/ml Thêi gian xư lÝ ngµy Đà nghiên cứu đa phơng pháp bảo quản kĩ thuật làm bất động gel chủng tảo nghiên cứu: -Xác định đợc nồng độ chất tạo gel thích hợp 1.5% Chất giải đông muối citrate - Mật độ tảo đa vào bảo quản thích hợp 106 tế bào/ml - Điều kiện thích hợp để gây nuôi tảo sau bảo quản nhiệt độ 15-17oC, ánh sáng 1000-2000 lux, môi trờng dinh dỡng thích hợp F/2 48 Tảo sau bảo quản gel nhiệt độ 4oC, điều kiện ánh sáng giữ đợc trạng thái nguyên vẹn đặc tính sinh lí, phục hồi sinh trởng tốt Kỹ thuật bảo quản tảo cách làm bất động lần đợc nghiên cứu ứng dụng Việt nam 49 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Hoàng Tích Huyền (2001) Hớng đẫn sử dụng kháng sinh Nhà xuất y học, tr 18-30 HoàngThị Kim Hoa cộng (2003) Nghiên cứu hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất số loài vi tảo (Duanaliella salina Tetraselmis chuii)phục vụ nhân nuôi số loài cá biển (các song, cá giò)tại Cát Bà Hải Phòng Báo cáo đề tài cấp Bộ Đặng Xuyến Nh, Hoàng Thị Kim Hoa cộng (1995) Nghiên cứu qui trình công nghệ tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ nguồn vi tảo để phục vụ dinh dỡng ngời động vật (1995) Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Nhà nớc (KC-08-12) thuộc chơng trình công nghệ sinh học Đặng Xuyến Nh cộng (1997) Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối u nhằm thu sinh khối tảo giàu -caroten Báo cáo đề tài cấp së Th«ng tin khoa häc c«ng nghƯ-kinh tÕ thđy sản 2/2004 Trang 13-16 Thông tin khoa học công nghƯ-kinh tÕ thđy s¶n 3/2004 Trang 29-30 TiÕng Anh Alekhina GP; Bukharin O.V; Nemseva N.V; Shabanov S.V (2001) Method of isolation of Microalgal axenic Culturre Patent number RU 2164940 date 10/4/2001 Aliza L.H and Johnston T.C (1999) Diversity of culturable heterotrophic aerobic bacteria in pristine bed sediment Canadian Journal of Microbiology, 45, pp.879-884 50 Brown, Mr (1991) The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae use in maricultur Journal of Experimental marine Biology and Ecology; 145: 79-99 Brown, Mr ; Miller K.A (1992) The ascorbic acid content of eleven species of microalgae used in mariculture Journal of Appiled Phycology, 4: 205 - 215 Brown Mr; Je-frey, S.W; Vikman, J.K, Dunstan, G.A (1997) Nutritional properties of microalgae for mariculture, Aquaculture, 151: 315-331 Brown et al (1999) The vitamin content of microalgae use in aquaculture Journal of Appiled Phycology, 11:247-255 Hong quan Liu et al (2004) Cryopreservation of protoplasts of the algal porphyza yezoensis by vitrification Plant science 166: 97-102 Gerllof GC; Fitzgerald GP; Skoog F (1950) The isolation purification and culture of blue-green Amer.J Vol 37 p.216 Gorbenko Lu A(1961) Naiboleic blogopriatnoie Kolichesvo "Succhovo pitatelnovo agara" Sredi dlia kuntivirovania morskich getherotrophnich microorganizmov Microbiologia, Kiev, T30, V.1 st: 168-172 10 Kbutko K.B (1961) Polytenhie culture otdelnic kletok chlorella 11 Knuckey, R.M et al (2002) Isolation of new nanoplanktonic diatom strains and they evalution as diets for the juvennile pacific oyster Aquaculture 12 Malcolm R Brown (1999) Nuritional Value and use of Microalgae in Aquacult Malcolm Brown@criro.au 13 Pedro Canavate, Luis M Lubinn (1995) Some aspects on the cryopresevation of microalgae use as food for marine species Aquaculture 136: 277-290 14 Purushothaman A(1999) Microbial diversity Cauter of Advanced study in Marine Biology Annamalai University, India, pp.6-20 15 Rheinheimer G(1985) Vi sinh vật học nguồn nớc (Kiều Hữu ảnh dịch), Nhà xuÊt b¶n khoa häc kÜ thuËt 51 16 Renaud, S.M et al (1999) The gross composition and fatty acid composition of 18 species of tropical Australian microalgae for possoble use marinculture Aquaculture 170: 147-155 17 Susana Romo and Carmen Peres Martiner (1997) The use immobilization in alginate beads for long term storage of pseudanabaena galeata (Cyanobacteria) in the laboratory J.phycol 33;1073-1076 18 Stein (1973) Handbook of phycological Methods Culture methods and growth measurements Cambridge university press 19 Tran Van Tran, Le Xan(2001) Some of studies results on reproductive charactieristies and Technology of seed production of Greasy-Back Shrimp (Metapenaeus Ensis de Haan 1844) In proceedings of Marine fisheries reseach VII.406-418 20 Yean Chan Chen (2003) Immobilized Haptophyta for long term srorage and application for feeds and water quality control in clam culture 21 Zobell C., Upham (1944) A list of marine bacteria includeing description of sixty new species Bull Scripps Inst,Oceanogr 52 ...Thông tin đề tài Tên đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm bảo quản số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản Chủ nhiệm Điện thoại (CQ) : TS Hoàng... xuất giống hải sản Vì cần có nguồn giống tốt để thờng xuyên cung cấp cho sản xuất Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm bảo quản lâu dài số giống tảo có giá trị kinh tế cao để cung cấp giống. .. phân lập, làm bảo quản số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản Phần II Đối tợng phơng pháp nghiên cứu II.1 Đối tợng nghiên cứu Đối tợng nghiên cứu t¶o Dunaliella