Đang tải... (xem toàn văn)
1. Mục tiêu Nắm được an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm nghiên cứu về sinh sản động vật Nắm được nguyên lý và sử dụng được một số máy móc, thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu sinh sản vật nuôi ở mức độ in vitro và in vivo Nắm được nguyên lý của các loại dung dịch pha và bảo quản tinh trùng, thực hiện được cân, đong các loại hoá chất kết hợp sử dụng các dụng cụ cần thiết để pha chế được môi trường pha loãng tinh vật nuôi theo các công thức khác nhau 2. Chuẩn bị máy móc, thiết bị, dụng cụ, hoá chất Cân phân tích (sai số 0,0001g) Cân kỹ thuật (sai số 0,01g) Thìa xúc hoá chất Giấy cân hoá chất Găng tay Khẩu trang Glucose.H2O Trisodium citrate DisodiumEDTA Sodium bicarbonate KCl Nước cất hoặc nước deionized Ống đong 1 lít Ống đong 250ml Ống đong 100ml Máy khuấy từ Cục từ Tuýp nhựa 50ml Máy dập tuýp Tủ lạnh 28 độ Bình xịt đựng cồn 70 độ 3. Tiến hành Chia lớp thực hành thành các tốp 5 sinh viên Phân công mỗi tốp một loại công thức môi trường pha tinh lợn Mỗi sinh viên cân ít nhất một loại hoá chất Mỗi nhóm pha 100ml môi trường pha tinh lợn theo công thức được phân công Chia môi trường vào 2 tuýp nhựa dung tích 50ml, dập kín miệng tuýp, ghi nhãn theo quy định sau: THSS1_LỚP LT....__NHÓM TH...._TỐP ....._NGÀY TH....._GIỜ KẾT THÚC CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG BTS Glucose.H2O: 3,7g Trisodium citrate: 0,6g DisodiumEDTA: 0,17g Sodium bicarbonate: 0,13g KCl: 0,08g CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG KIEV Glucose.H2O: 6g Trisodium citrate: 0,37g DisodiumEDTA: 0,37g Sodium bicarbonate: 0,12g CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG IVT Glucose.H2O: 0,3g Trisodium citrate: 0,24g Sodium bicarbonate: 0,24g KCl: 0,04g Một số điểm cần lưu ý Sinh viên thực hiện nghiêm ngặt theo hướng dẫn và phân công của giảng viên và cán bộ hỗ trợ Sinh viên mặc áo blouse, đeo găng tay và khẩu trang trong suốt quá trình thực hành Xúc hoá chất từng ít một, tuyệt đối không xúc thừa, nếu xúc thừa thì không được đổ trở lại hộp đựng hoá chất Sinh viên phải học cách rửa dụng cụ và thực hiện rửa dụng cụ theo đúng nguyên tắc của phòng thí nghiệm Nếu rơi vỡ hoặc làm hỏng thiết bị dụng cụ thì phải đền bù theo giá trị của tài sản bị hư hỏng Lau chùi máy móc, thiết bị, mặt bàn, ghế ngồi, xếp ngay ngắn bàn ghế trở về vị trí cũ Đưa máy móc thiết bị về đúng vị trí ban đầu trước khi thực hành Trưởng nhóm báo cáo tình trạng của buổi thực hành với Giảng viên hướng dẫn và Cán bộ hỗ trợ trước khi ra về Toàn bộ sinh viên chỉ được ra về sau khi mọi việc đã hoàn tất và được sự đồng ý của Giảng viên và Cán bộ hỗ trợ BÀI 2. THỰC HÀNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH VÀ PHA LOÃNG, BẢO QUẢN TINH GIA SÚC 1. Mục tiêu Thực hiện được các kỹ thuật, thao tác và đánh giá chất lượng tinh dịch của vật nuôi gốm: thể tích tinh dịch (Vml), nồng độ tinh trùng (Ctriệu tinh trùngml), chỉ tiêu vận động của tinh trùng (tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng vận động tại chỗ và tỷ lệ tinh trùng không vận động %), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K%), sức kháng của tinh trùng (Rđơn vị sức kháng) Đối với tinh nguyên: Xác định được bội số pha loãng tinh, Thực hiện được việc pha loãng và bảo quản tinh trùng sử dụng môi trường pha loãng tinh do sinh viên tự pha chế Đối với tinh bảo quản (đã chia liều): Thực hiện được việc ly tâm loại bỏ tinh thanh và môi trường cũ và tái pha loãng mẫu tinh bằng môi trường do sinh viên tự pha chế Thực hiện được việc đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của mẫu tinh do sinh viên thực hiện bảo quản (đánh giá hoạt lực tinh trùng của tinh pha loãng sau 60 phút pha loãng trong môi trường mới và chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của mẫu tinh sau khi bảo quản từ 37ngày), thông qua đó đánh giá và so sánh được hiệu quả bảo quản tinh của các loại môi trường do sinh viên thực hiện, kiểm tra được kỹ năng, thao tác của sinh viên 2. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc, hoá chất và nguyên vật liệu Mẫu tinh nguyên của lợn hoặc các liều tinh lợn đã pha loãng Kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100x, 400x và 900x Lam kính Lamen Giấy lau kính Buồng đếm hồng cầu (Neu Bauer chamber) Ống đong hoặc cốc đong nhựathủy tinh dung tích 500ml Ống eppendof dung tích 250, 500, 1000 microlit Ống falcon dung tích 15ml Máy ly tâm ống falcon 15ml (12 vị trí, tốc độ tối đa 4000 vòngphút, nhiệt độ phòng) Bể ổn nhiệt Pipet 100 1000 microlit, 10200 microlit, 110 microlit Hộp đựng đầu côn dung tích 1000 microlit Hộp đựng đầu côn dung tích 100 microlit Hộp đựng đầu côn dung tích 10 microlit Đầu côn dung tích 1000 microlit Đầu côn dung tích 100 microlit Đầu côn dung tích 10 microlit Dung dịch NaCl 1% Dung dich NaCl 3% Dung dịch Formol citrate 4% Nước cất Đũa thủy tinh Các loại môi trường pha tinh 3. Tiến hành 3.1. Đánh giá chất lượng và pha loãng tinh nguyên của lợn: 3.1.1. Đánh giá chất lượng tinh nguyên của lợn Đánh giá chỉ tiêu thể tích tinh dịch: Nghiêng cốc đong (ống đong), rót toàn bộ mẫu tinh nguyên một cách nhẹ nhàng, từ từ lên thành của cốc đong, để cốc đong lên mặt phẳng nằm ngang vuông góc tuyệt đối với mặt đất, đặt mắt nhìn ngang bằng với mặt phẳng của mặt lớp tinh, ghi lại chỉ số thể tích của mẫu tinh Chuẩn bị sẵn sàng kính hiển vi, đưa vật kính 10 vào vị trí soi mẫu, bật đèn và điều chỉnh cho độ sáng đèn cao nhất, đóng tụ quang về gần vị trí mà tụ quang có độ mở hẹp nhất Đánh giá chỉ tiêu vận động của tinh trùng: Dùng đũa thủy tinh đảo cốc tinh một cách nhẹ nhàng cho đều từ 35 lần, dùng pipet và đầu côn 10 microlit, hút và bơm 3 giọt tinh nguyên mỗi giọt 3 microlit lên lam kính (hút ở độ sâu sâu nhất có thể của đầu côn và tránh không để tinh dính vào đầu pipet). Thao tác nhanh và chính xác để tránh sự chênh lệch thời gian giữa 3 giọt tinh Mắt nhìn vào thị kính đồng thời điều chỉnh ốc sơ cấp và vi cấp để nhìn rõ tinh trùng Dịch chuyển lam kính để quan sát và đánh giá tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng, tinh trùng vận động tại chỗ và tinh trùng không hoạt động của mỗi giọt tinh. Tính giá trị trung bình của các chỉ tiêu để làm kết quả đánh giá cho mẫu tinh nguyên Đánh giá chỉ tiêu nồng độ tinh trùng: Dùng pipet 1000 microlit hút chính xác 10ml dung dịch NaCl 3% bơm vào ống falcon dung tích 15ml Dùng pipet dung tích 200 microlit, sử dụng đầu côn dung tích 200 microlit hút bỏ 50 microlit dung dịch NaCl 3% ra khỏi ống falcon 15ml Tháo bỏ đầu côn dung tích 200 microlit thứ nhất, lắp đầu côn thứ hai (vô trùng) vào pipet, dùng đũa thuỷ tinh đảo nhẹ và đều cốc đựng tinh, hút 50 microlit ở lớp tinh sâu nhất có thể so với chiều dài của đầu côn mà không để dính vào pipet, hút lên hút xuống 3 lần trước khi chính thức hút ra, dùng giấy thấm vô trùng lau tinh dính ở mặt ngoài đầu côn rồi nhúng đầu côn vào dung dịch NaCl 3%, hút đẩy 35 lần để đảm bảo toàn bộ lượng tinh được bơm vào nước muối
TÀI LIỆU HỌC PHẦN THỰC HÀNH SINH SẢN GIA SÚC GIÀNH CHO SINH VIÊN NGÀNH THÚ Y HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Số tiết thực hành: 15 tiết Số buổi thực hành: buổi Số thực hành: Thời lượng: tiết/buổi BÀI GIỚI THIỆU PHỊNG THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU SINH SẢN GIA SÚC VÀ THỰC HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG BẢO QUẢN TINH GIA SÚC Mục tiêu - Nắm an toàn sinh học phịng thí nghiệm nghiên cứu sinh sản động vật - Nắm nguyên lý sử dụng số máy móc, thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu sinh sản vật nuôi mức độ in vitro in vivo - Nắm nguyên lý loại dung dịch pha bảo quản tinh trùng, thực cân, đong loại hoá chất kết hợp sử dụng dụng cụ cần thiết để pha chế mơi trường pha lỗng tinh vật ni theo công thức khác Chuẩn bị máy móc, thiết bị, dụng cụ, hố chất - Cân phân tích (sai số 0,0001g) - Cân kỹ thuật (sai số 0,01g) - Thìa xúc hố chất - Giấy cân hố chất - Găng tay - Khẩu trang - Glucose.H2O - Trisodium citrate - Disodium-EDTA - Sodium bicarbonate - KCl - Nước cất nước deionized - Ống đong lít - Ống đong 250ml - Ống đong 100ml - Máy khuấy từ - Cục từ - Tuýp nhựa 50ml - Máy dập tuýp - Tủ lạnh 2-8 độ - Bình xịt đựng cồn 70 độ Tiến hành - Chia lớp thực hành thành tốp sinh viên - Phân công tốp loại công thức môi trường pha tinh lợn - Mỗi sinh viên cân loại hố chất - Mỗi nhóm pha 100ml mơi trường pha tinh lợn theo công thức phân công - Chia mơi trường vào nhựa dung tích 50ml, dập kín miệng tuýp, ghi nhãn theo quy định sau: THSS1_LỚP LT NHÓM TH _TỐP ._NGÀY TH _GIỜ KẾT THÚC *CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG BTS - Glucose.H2O: 3,7g - Trisodium citrate: 0,6g - Disodium-EDTA: 0,17g - Sodium bicarbonate: 0,13g - KCl: 0,08g *CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG KIEV - Glucose.H2O: 6g - Trisodium citrate: 0,37g - Disodium-EDTA: 0,37g - Sodium bicarbonate: 0,12g *CÔNG THỨC PHA 100ML MÔI TRƯỜNG IVT - Glucose.H2O: 0,3g - Trisodium citrate: 0,24g - Sodium bicarbonate: 0,24g - KCl: 0,04g * Một số điểm cần lưu ý - Sinh viên thực nghiêm ngặt theo hướng dẫn phân công giảng viên cán hỗ trợ - Sinh viên mặc áo blouse, đeo găng tay trang suốt q trình thực hành - Xúc hố chất một, tuyệt đối khơng xúc thừa, xúc thừa khơng đổ trở lại hộp đựng hố chất - Sinh viên phải học cách rửa dụng cụ thực rửa dụng cụ theo nguyên tắc phòng thí nghiệm - Nếu rơi vỡ làm hỏng thiết bị dụng cụ phải đền bù theo giá trị tài sản bị hư hỏng - Lau chùi máy móc, thiết bị, mặt bàn, ghế ngồi, xếp ngắn bàn ghế trở vị trí cũ - Đưa máy móc thiết bị vị trí ban đầu trước thực hành - Trưởng nhóm báo cáo tình trạng buổi thực hành với Giảng viên hướng dẫn Cán hỗ trợ trước - Toàn sinh viên sau việc hoàn tất đồng ý Giảng viên Cán hỗ trợ BÀI THỰC HÀNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH VÀ PHA LOÃNG, BẢO QUẢN TINH GIA SÚC Mục tiêu - Thực kỹ thuật, thao tác đánh giá chất lượng tinh dịch vật ni gốm: thể tích tinh dịch (V-ml), nồng độ tinh trùng (C-triệu tinh trùng/ml), tiêu vận động tinh trùng (tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng vận động chỗ tỷ lệ tinh trùng không vận động - %), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K-%), sức kháng tinh trùng (R-đơn vị sức kháng) - Đối với tinh nguyên: Xác định bội số pha loãng tinh, Thực việc pha loãng bảo quản tinh trùng sử dụng mơi trường pha lỗng tinh sinh viên tự pha chế - Đối với tinh bảo quản (đã chia liều): Thực việc ly tâm loại bỏ tinh môi trường cũ tái pha lỗng mẫu tinh mơi trường sinh viên tự pha chế - Thực việc đánh giá tiêu chất lượng mẫu tinh sinh viên thực bảo quản (đánh giá hoạt lực tinh trùng tinh pha loãng sau 60 phút pha loãng môi trường tiêu hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình mẫu tinh sau bảo quản từ 3-7ngày), thơng qua đánh giá so sánh hiệu bảo quản tinh loại môi trường sinh viên thực hiện, kiểm tra kỹ năng, thao tác sinh viên Chuẩn bị dụng cụ, máy móc, hố chất nguyên vật liệu - Mẫu tinh nguyên lợn liều tinh lợn pha lỗng - Kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100x, 400x 900x - Lam kính - Lamen - Giấy lau kính - Buồng đếm hồng cầu (Neu Bauer chamber) - Ống đong cốc đong nhựa/thủy tinh dung tích 500ml - Ống eppendof dung tích 250, 500, 1000 microlit - Ống falcon dung tích 15ml - Máy ly tâm ống falcon 15ml (12 vị trí, tốc độ tối đa 4000 vịng/phút, nhiệt độ phòng) - Bể ổn nhiệt - Pipet 100 -1000 microlit, 10-200 microlit, 1-10 microlit - Hộp đựng đầu dung tích 1000 microlit - Hộp đựng đầu dung tích 100 microlit - Hộp đựng đầu dung tích 10 microlit - Đầu dung tích 1000 microlit - Đầu dung tích 100 microlit - Đầu dung tích 10 microlit - Dung dịch NaCl 1% - Dung dich NaCl 3% - Dung dịch Formol - citrate 4% - Nước cất - Đũa thủy tinh - Các loại môi trường pha tinh Tiến hành 3.1 Đánh giá chất lượng pha loãng tinh nguyên lợn: 3.1.1 Đánh giá chất lượng tinh nguyên lợn * Đánh giá tiêu thể tích tinh dịch: - Nghiêng cốc đong (ống đong), rót tồn mẫu tinh ngun cách nhẹ nhàng, từ từ lên thành cốc đong, để cốc đong lên mặt phẳng nằm ngang vuông góc tuyệt mặt đất, đặt mắt nhìn ngang với mặt phẳng mặt lớp tinh, ghi lại số thể tích mẫu tinh - Chuẩn bị sẵn sàng kính hiển vi, đưa vật kính 10 vào vị trí soi mẫu, bật đèn điều chỉnh cho độ sáng đèn cao nhất, đóng tụ quang gần vị trí mà tụ quang có độ mở hẹp * Đánh giá tiêu vận động tinh trùng: - Dùng đũa thủy tinh đảo cốc tinh cách nhẹ nhàng cho từ 3-5 lần, dùng pipet đầu côn 10 microlit, hút bơm giọt tinh nguyên giọt microlit lên lam kính (hút độ sâu sâu đầu tránh khơng để tinh dính vào đầu pipet) Thao tác nhanh xác để tránh chênh lệch thời gian giọt tinh - Mắt nhìn vào thị kính đồng thời điều chỉnh ốc sơ cấp vi cấp để nhìn rõ tinh trùng - Dịch chuyển lam kính để quan sát đánh giá tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng, tinh trùng vận động chỗ tinh trùng không hoạt động giọt tinh Tính giá trị trung bình tiêu để làm kết đánh giá cho mẫu tinh nguyên * Đánh giá tiêu nồng độ tinh trùng: - Dùng pipet 1000 microlit hút xác 10ml dung dịch NaCl 3% bơm vào ống falcon dung tích 15ml - Dùng pipet dung tích 200 microlit, sử dụng đầu dung tích 200 microlit hút bỏ 50 microlit dung dịch NaCl 3% khỏi ống falcon 15ml - Tháo bỏ đầu dung tích 200 microlit thứ nhất, lắp đầu côn thứ hai (vô trùng) vào pipet, dùng đũa thuỷ tinh đảo nhẹ cốc đựng tinh, hút 50 microlit lớp tinh sâu so với chiều dài đầu mà khơng để dính vào pipet, hút lên hút xuống lần trước thức hút ra, dùng giấy thấm vô trùng lau tinh dính mặt ngồi đầu nhúng đầu vào dung dịch NaCl 3%, hút đẩy 3-5 lần để đảm bảo toàn lượng tinh bơm vào nước muối - Đảo 10 lần ống nước muối đựng tinh Hệ số pha loãng tinh bước 10000:50 = 200 lần - Hà lên bề mặt buồng đếm hồng cầu đậy lamen lên bề mặt buồng đếm - Hút microlit dung dịch NaCl 3% chứa tinh vị trí sâu đầu dung tích 10 microlit tra vào khe buồng đếm, đảm bảo khơng có bọt khí buồng tra mẫu, thực bước lặp lại hai lần tương ứng hai phía buồng đếm - Quan sát kính hiển vi độ phóng đại 100x lên độ phóng đại 400x để thực việc đếm tinh trùng, ghi lại số liệu N1 N2 số tinh trùng đếm (theo nguyên tắc mô tả dưới) phía buồng đếm - Nguyên tắc đếm tinh trùng buồng đếm Neu Bauer Chamber + Mỗi phía buồng đếm có vùng đếm hình vng gồm 25 vng to (5 ô theo chiều ngang ô theo chiều dọc), ô to gồm 16 ô vuông nhỏ (4x4 ô) + Việc xác định nồng độ dựa số tinh trùng đếm thể tích (V) tính tổng diện tích (S) 80 vng nhỏ vùng đếm (với diện tích 0,0025mm²/ơ nhỏ x 80 ô) nhân với chiều cao (h) cột dung dịch (tương ứng với khoảng cách từ bề mặt vùng đếm đến mặt lamen) 0,1mm Ta có V = 0,0025 x 80 x 0,1 = 2,5 x 10-³ x x 10¹ x 10-¹ = 20 x 10-³ (mm³) = 20 x 10-⁶ (cm³) = 20 x 10-⁶ (ml) + 80 ô vuông nhỏ đếm tương ứng với ô vuông to, theo nguyên tắc lấy mẫu đảm bảo độ đồng gồm ô vuông to theo cạnh huyền tam giác vuông ô vuông to đỉnh tam giác vuông + Trong ô vuông to đếm tinh trùng đếm đầu tinh trùng mà không đếm đi, đếm theo hình zích zắc từ vng nhỏ bên trái di sang bên phải đến ô vng thứ tư hàng thứ sau dịch xuống ô thứ tư hàng thứ hai dịch sang bên trái ô hàng thứ hai, tiếp tục dịch ô hàng thứ ba dịch sang bên phải đến ô thứ tư hàng thứ ba, tiếp tục dịch xuống ô thứ hàng thứ dịch sang ô hàng thứ tư Kết thúc việc đếm tinh ô vuông to + Để đảm bảo độ xác: đếm đầu tinh trùng có lịng ô to đầu tinh trùng đè lên cạnh cạnh bên phải ô to, không đếm đầu tinh trùng cạnh phía cạnh bên trái ô to + Đếm vùng đếm phía buồng đếm ta N1 N2 tổng số tinh trùng đếm to phía Đối với tinh lợn, N1 khác N2 lớn tinh trùng chứng tỏ thao tác sai, làm lại từ đầu + Nếu N1, N2 chênh không chấp nhận kết nồng độ tinh trùng có dung dịch muối NaCl 3% là: [(N1 + N2)/2] / (20 x 10-⁶) = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ (tinh trùng/ml) + Cuối cùng, với tỷ lệ pha loãng tinh nguyên vào nước muối NaCl 3% 200 lần, ta có nồng độ tinh trùng mẫu tinh nguyên = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ x 200 = x (N1 + N2) x 10⁶ (tinh trùng/ml) = x (N1 + N2) (triệu tinh trùng/ml) Hình minh hoạ buồng đếm hồng cầu (Neu Bauer chamber) quy ước ô đếm cách đếm tinh trùng * Đánh giá tiêu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: - Dùng pipet dung tích 1000µl hút 1ml dung dịch formol citrate 4% cho vào ống eppendorf dung tích 1,5ml, dùng pipet dung tích 200µl hút bỏ 20µl dung dịch formol citrate 4% - Thay đầu côn pipet dung tích 200µl hút 20µl tinh ngun trộn vào dung dịch formol ống eppendorf, đảo (nếu khơng soi lưu trữ tủ lạnh 2-8 độ vòng tuần mà đảm bảo kết xác) - Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl hỗn hợp nhỏ lên lam kính, đậy lamen tránh bọt khí, quan sát kính hiển vi độ phóng đại 100, 400 900x Ở độ phóng đại 900x, phải nhỏ dầu soi kính Khi quan sát thấy tinh trùng khơng cịn trơi vi trường bắt đầu xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Di chuyển khay mẫu góc bên trái lamen tới vị trí soi kính, quan sát, đếm số tinh trùng, tích số tinh trùng dạng kỳ hình Di chuyển theo hình zíc zắc (từ góc bên trái di chuyển sang ngang đến góc bên phải sau dịch lui xuống hàng tinh trùng di chuyển sang trái sau lại dịch xuống hang di chuyển sang phải đếm đủ 200 tinh trùng tổng số) Việc di chuyển theo hình zíc zắc để tránh trùng lặp tinh trùng đếm xác định hình dạng - Tổng hợp số tinh trùng kỳ hình dạng số tinh trùng kỳ hình tổng số từ xác định tỷ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình * Đánh giá tiêu sức kháng tinh trùng - Thường xác định tinh nguyên, tinh lợn ngoại áp dụng phương pháp lọ - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 5ml dung dịch NaCl 1% cho vào ống falcon dung tích 15ml (lọ 1) - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 1ml NaCl 1% cho vào ống falcon dung tích 15ml (lọ 2) - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 0,5ml NaCl 1% cho vào ống falcon dung tích 15ml (lọ 3) - Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl (0,01ml) tinh ngun cho vào lọ 1, đảo (tinh pha loãng 500 lần lọ 1) - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 1000 µl hỗn hợp lọ cho vào lọ 2, đảo (tinh nguyên pha loãng 1000 lần lọ 2) - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 500 µl hỗn hợp lọ chuyển sang lọ (tinh nguyên pha loãng 2000 lần lọ 3) - Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl tinh lọ nhỏ lên lam kính soi kính hiển vi độ phóng đại 100x, thấy tinh trùng hoạt động dùng pipet dung tích 200 µl hút 100 µl dung dịch NaCl 1% thêm vào lọ 3, đảo lặp lại việc kiểm tra hoạt động tinh trùng Cứ tiếp tục cho thêm 100 µl dung dịch NaCl 1% vào lọ soi kiểm tra tinh trùng không hoạt động dừng lại - Sức kháng tinh trùng tính theo cơng thức: R = ro + r x n Trong đó: R sức kháng tinh trùng mẫu tinh, r o độ pha loãng ban đầu trước thêm NaCl 1% (ro = 2000), r mức pha loãng sau lần thêm dung dịch NaCl 1% (r = 200), n số lần thêm 100 µl dung dịch NaCl 1% 3.1.2 Pha lỗng bảo quản tinh lợn (đối với mẫu tinh nguyên) - Chuẩn bị tốp người ống falcon dung tích 15 ml đựng dung dịch NaCl 3% (để xác định nồng độ tinh nguyên, cách làm mơ tả phần 3.1.1.) - Chuẩn bị nhóm thực hành ống tuýp đựng tinh dung tích 100ml - Bật bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ để nước bể ổn nhiệt đạt 34oC - Mỗi tốp sinh viên tự chuẩn bị môi trường pah tinh tốp thực ủ bể ổn nhiệt - Ủ tồn lượng mơi trường pha tinh tốp chuẩn bị từ buổi bể ổn nhiệt, đảm bảo tan hoàn tồn tồn đá nước có mơi trường môi trường phải đạt nhiệt độ 34oC trước pha với tinh nguyên - Mỗi nhóm cấp 10 ml tinh nguyên lợn (đựng tuýp tinh dung tích 100 ml, đóng kín, loại bỏ bọt khí, bọc túi nilon màu đen để tránh ánh sáng, bảo quản thùng xốp có đặt miếng đá khơ làm mát mẫu tinh) - Chuẩn bị ống đong cốc thuỷ tinh dung tích 100 ml - Đảo tuýp tinh nguyên cách nhẹ nhàng đến 10 lần - Cắt đầu tuýp tinh nguyên, chia vào ống đong cách nhẹ nhàng, ống 10 ml - Nhanh chóng dùng pipet dung tích 200 µl hút 50 ml tinh nguyên cho vào ống NaCl 3% - Pha 10 ml môi trường ủ bể ổn nhiệt đạt 34 oC vào cốc đựng tinh (tỷ lệ thể tích tinh : thể tích môi trường pha tinh) - Đảo ống dung dịch NaCl 3% chứa tinh, xác định nồng độ tinh trùng mẫu tinh ngun cách nhanh chóng xác - Xác định bội số pha lỗng (thể tích tinh ngun : thể tích mơi trường pha tinh) cho thể tích liều tinh 100 ml, tổng số tinh trùng liều tinh 2,5 tỷ tinh trùng (nồng độ tinh trùng liều tinh 25 triệu tinh trùng/ml) Sinh viên trình bày cách tính kết bội số pha loãng tinh xác định dựa nồng độ tinh trùng mẫu tinh nguyên xác định giấy nộp cho giảng viên cán hỗ trợ - Chia 10 ml tinh nguyên thành phần, phần ml cho tốp, tốp sinh viên, chia vào tuýp đựng tinh dung tích 100 ml - Tiến hành pha loãng tinh theo bội số pha loãng tinh xác định theo nguyên tắc: (i) pha môi trường vào tinh, không pha tinh vào môi trường, (ii) thêm môi trường vào tinh theo tỷ lệ thể tích mơi trường : thể tích tinh cho lần rót mơi trường cuối tích so với thể tích mẫu tinh pha lúc đó, (iii) rót môi trường nhẹ nhàng, từ từ theo thành ống đong cốc thuỷ tinh pha tinh, không đổ trực tiếp lên mặt mẫu tinh - Đảo nhẹ mẫu tinh đổ nhẹ nhàng toàn lượng tinh pha vào tuýp đựng tinh dung tích 100 ml - Dập tuýp tinh cho kín hồn tồn, đẩy tồn bọt khí đảm bảo khơng có bọt khí bên tinh - Đặt tuýp tinh nằm ngang so với mặt đất, mặt bàn phẳng, để chỗ mát, quấn khăn bọc túi nilon màu đen để tránh ánh sáng - Cân mẫu tinh nhiệt độ phòng 90 phút trước cho vào bảo quản tủ bảo ôn - Đặt tuýp tinh nằm ngang tủ bảo ôn 17oC, đảo tuýp tinh 1-2 lần/ngày (đảo tủ để tránh thay đổi nhiệt độ) - Tuỳ lực mơi trường bảo quản, tinh bảo quản từ đến 10 ngày khả thụ tinh cho hiệu tốt Hình minh hoạ dạng tinh trùng kỳ hình 3.2 Đánh giá chất lượng tái pha loãng bảo quản tinh đóng gói thành liều tinh phối 3.2.1 Đánh giá chất lượng liều tinh pha lỗng - Thơng thường liều tinh phối lợn ngoại có dung tích 100ml với tổng số tinh trùng tối thiểu/liều 2,5 tỷ tinh trùng, nhiên thực tế, lần khai thác tinh lợn ngoại, người bán tinh thường pha toàn lượng tinh (200-400ml) với 1000ml môi trường pha tinh đóng vào tới dung tích 80ml/tp bảo quản tủ bảo quản tinh 17oC - Mỗi tốp phát tuýp tinh, nhóm thực hành có tối đa tốp tương ứng với liều tinh * Đánh giá tiêu tinh trùng vận động tinh pha loãng - Bật bể ổn nhiệt trước tiến hành cài đặt để nước bể ổn nhiệt đạt nhiệt độ 37oC - Đảo nhẹ nhàng cho tuýp tinh (5-10 lần đảo), cắt góc phần mép hàn tuýp tinh, dùng pipet dung tích 1000µl hút chuyển 3000 µl tinh cho vào ống falcon dung tích 15ml vặn chặt nắp - Ủ ống tinh vào bể ổn nhiệt 30 phút - Soi xác định tiêu vận động tinh trùng tương tự cách làm tinh nguyên (dùng pipet đầu côn 10 microlit, hút bơm giọt tinh, giọt microlit lên lam kính (hút độ sâu sâu đầu tránh khơng để tinh dính vào đầu pipet) Thao tác nhanh xác để tránh chênh lệch thời gian giọt tinh; mắt nhìn vào thị kính đồng thời điều chỉnh ốc sơ cấp vi cấp để nhìn rõ tinh trùng; dịch chuyển lam kính để quan sát đánh giá tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng, tinh trùng vận động chỗ tinh trùng không hoạt động giọt tinh Tính giá trị trung bình tiêu để làm kết đánh giá cho mẫu tinh) * Đánh giá tiêu nồng độ mẫu tinh pha: - Dùng pipet 1000 microlit hút xác 10ml dung dịch NaCl 3% bơm vào ống falcon dung tích 15ml, sau hút bỏ 300µl - Tháo bỏ đầu dung tích 1000 microlit cũ, lắp đầu thứ hai (vô trùng) vào pipet, hút 300 microlit ống falcon sau ủ bể ổn nhiệt để kiểm tra tiêu hoạt động tinh trùng vị trí lớp tinh, hút lên hút xuống lần trước thức hút ra, dùng giấy thấm vơ trùng lau tinh dính mặt ngồi đầu côn nhúng đầu côn vào dung dịch NaCl 3%, hút đẩy 3-5 lần để đảm bảo toàn lượng tinh bơm vào nước muối - Đảo 10 lần ống nước muối đựng tinh Hệ số pha loãng tinh bước 10000:300 = 10/3 lần - Hà lên bề mặt buồng đếm hồng cầu đậy lamen lên bề mặt buồng đếm - Hút microlit dung dịch NaCl 3% chứa tinh vị trí sâu đầu dung tích 10 microlit tra vào khe buồng đếm, đảm bảo khơng có bọt khí buồng tra mẫu, thực bước lặp lại hai lần tương ứng hai phía buồng đếm - Quan sát kính hiển vi độ phóng đại 100x lên độ phóng đại 400x để thực việc đếm tinh trùng, ghi lại số liệu N1 N2 số tinh trùng đếm (theo nguyên tắc mô tả dưới) phía buồng đếm - Nguyên tắc đếm tinh trùng buồng đếm Neu Bauer Chamber + Mỗi phía buồng đếm có vùng đếm hình vuông gồm 25 ô vuông to (5 ô theo chiều ngang ô theo chiều dọc), ô to gồm 16 ô vuông nhỏ (4x4 ô) + Việc xác định nồng độ dựa số tinh trùng đếm thể tích (V) tính tổng diện tích (S) 80 ô vuông nhỏ vùng đếm (với diện tích 0,0025mm²/ơ nhỏ x 80 ơ) nhân với chiều cao (h) cột dung dịch (tương ứng với khoảng cách từ bề mặt vùng đếm đến mặt lamen) 0,1mm Ta có V = 0,0025 x 80 x 0,1 = 2,5 x 10-³ x x 10¹ x 10-¹ = 20 x 10-³ (mm³) = 20 x 10-⁶ (cm³) = 20 x 10-⁶ (ml) + 80 ô vuông nhỏ đếm tương ứng với ô vuông to, theo nguyên tắc lấy mẫu đảm bảo độ đồng gồm vng to theo cạnh huyền tam giác vuông ô vuông to đỉnh tam giác vuông + Trong ô vuông to đếm tinh trùng đếm đầu tinh trùng mà khơng đếm đi, đếm theo hình zích zắc từ ô vuông nhỏ bên trái di sang bên phải đến ô vuông thứ tư hàng thứ sau dịch xuống thứ tư hàng thứ hai dịch sang bên trái ô hàng thứ hai, tiếp tục dịch ô hàng thứ ba dịch sang bên phải đến ô thứ tư hàng thứ ba, tiếp tục dịch xuống ô thứ hàng thứ dịch sang ô hàng thứ tư Kết thúc việc đếm tinh ô vuông to + Để đảm bảo độ xác: đếm đầu tinh trùng có lịng to đầu tinh trùng đè lên cạnh cạnh bên phải ô to, không đếm đầu tinh trùng cạnh phía cạnh bên trái to + Đếm vùng đếm phía buồng đếm ta N1 N2 tổng số tinh trùng đếm ô to phía Đối với tinh lợn, N1 khác N2 lớn tinh trùng chứng tỏ thao tác sai, làm lại từ đầu + Nếu N1, N2 chênh khơng q chấp nhận kết nồng độ tinh trùng có dung dịch muối NaCl 3% là: [(N1 + N2)/2] / (20 x 10-⁶) = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ (tinh trùng/ml) + Cuối cùng, với tỷ lệ pha loãng tuýp tinh pha vào nước muối NaCl 3% 10/3 lần, ta có nồng độ tinh trùng mẫu tinh nguyên = [(N1 + N2)/40] x 10⁶ x 10/3 = 400/3 x (N1 + N2) x 10⁶ (tinh trùng/ml) = 400/3 x (N1 + N2) (triệu tinh trùng/ml) * Đánh giá tiêu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: - Dùng pipet dung tích 1000µl hút 700µl dung dịch formol citrate 4% cho vào ống eppendorf dung tích 1,5ml - Thay đầu pipet dung tích 1000µl hút 300µl tinh pha (từ ống xác định tiêu vận động tinh trùng), trộn vào dung dịch formol ống eppendorf, đảo (nếu khơng soi lưu trữ tủ lạnh 2-8 độ vòng tuần mà đảm bảo kết xác) - Dùng pipet dung tích 10 µl hút 10 µl hỗn hợp nhỏ lên lam kính, đậy lamen tránh bọt khí, quan sát kính hiển vi độ phóng đại 100, 400 900x Ở độ phóng đại 900x, phải nhỏ dầu soi kính Khi quan sát thấy tinh trùng khơng cịn trơi vi trường bắt đầu xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Di chuyển khay mẫu góc bên trái lamen tới vị trí soi kính, quan sát, đếm số tinh trùng, tích số tinh trùng dạng kỳ hình Di chuyển theo hình zíc zắc (từ góc bên trái di chuyển sang ngang đến góc bên phải sau dịch lui xuống hàng tinh trùng di chuyển sang trái sau lại dịch xuống hang di chuyển sang phải đếm đủ 200 tinh trùng tổng số) Việc di chuyển theo hình zíc zắc để tránh trùng lặp tinh trùng đếm xác định hình dạng - Tổng hợp số tinh trùng kỳ hình dạng số tinh trùng kỳ hình tổng số từ xác định tỷ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình 3.1.2 Pha loãng bảo quản tinh lợn (đối với mẫu tinh nguyên) - Chuẩn bị ống falcon dung tích 15 ml đựng dung dịch NaCl 3% (để xác định nồng độ tinh pha lỗng, cách làm mơ tả phần 3.2.1.) - Chuẩn bị ống tuýp đựng tinh dung tích 100ml - Chuẩn bị 10 ống falcon dung tích 15 ml - Bật bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ để nước bể ổn nhiệt đạt 34oC - Mỗi tốp sinh viên tự chuẩn bị mơi trường pah tinh tốp thực ủ bể ổn nhiệt - Ủ tồn lượng mơi trường pha tinh tốp chuẩn bị từ buổi bể ổn nhiệt, đảm bảo tan hoàn toàn toàn đá nước có mơi trường mơi trường phải đạt nhiệt độ 34oC trước pha với tinh nguyên - Mỗi nhóm thực hành cấp liều tinh lợn dung tích 100 ml chưa xác định nồng độ tinh trùng (đựng tuýp tinh dung tích 100 ml, đóng kín, loại bỏ bọt khí, bọc túi nilon màu đen để tránh ánh sáng, bảo quản thùng xốp có đặt miếng đá khơ làm mát mẫu tinh) - Chuẩn bị ống đong cốc thuỷ tinh dung tích 100 ml - Đảo tuýp tinh cách nhẹ nhàng đến 10 lần - Cắt đầu nhọn tuýp tinh, rót nhẹ nhàng vào 10 ống falcon dung tích 15 ml, ống 10 ml tinh pha cấp - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút 300 µl tinh pha vào ống NaCl 3% chuẩn bị - Xác định nồng độ tinh trùng mẫu tinh pha cấp, tính tổng số tinh trùng có liều tinh, xác định bội số tái pha lỗng tinh (thể tích tinh : thể tích mơi trường pha tinh mới) cho thể tích liều tinh 100 ml, tổng số tinh trùng liều tinh 2,5 tỷ tinh trùng (nồng độ tinh trùng liều tinh 25 triệu tinh trùng/ml) Sinh viên ghi lại bước tính kết để nộp giảng viên cán hỗ trợ - Ly tâm tinh 10 phút, tốc độ 2500 vòng/phút nhiệt độ phòng (đặc biệt lưu ý nguyên tắc xếp ống máy ly tâm đảm bảo tuyệt đối cân máy) - Sau kết thúc ly tâm, dùng pitpet dung tích 1000 µl hút bỏ lớp dung dịch phía ống tinh, giữ lại xác ml cặn tinh với dung dịch cũ - Dùng pipet dung tích 1000 µl đảo cặn tinh tất ống ly tâm - Dùng pipet dung tích 1000 µl hút tồn tinh từ 10 ống ly tâm dồn vào ống cốc đong dung tích 100 ml - Dùng pipet dung tích 1000 µl (thay đầu côn mới) hút tra vào ống ly tâm 2ml mơi trường pha tinh tốp chuẩn bị, hút đảo lần chuyển tinh sang ống cốc đong dung tích 100 ml chứa tinh (đảm bảo không bị hao tinh trùng bước chuyển tinh) - Như vậy, lúc tổng thể tích tinh pha môi trường 40 ml (2ml x 10 ống + 2ml x 10 ống) Chia 40 ml tinh thành phần, phần ml, chia cho tốp, tốp sinh viên - Mỗi tốp sinh viên tự chuẩn bị ủ môi trường tốp chuẩn bị, pha thêm mơi trường vào ml chia đến thể tích cuối theo nguyên tắc: (i) pha môi trường vào tinh, không pha tinh vào môi trường, (ii) thêm môi trường vào tinh theo tỷ lệ thể tích mơi trường : thể tích tinh cho lần rót mơi trường cuối tích so với thể tích mẫu tinh pha lúc đó, (iii) rót môi trường nhẹ nhàng, từ từ theo thành ống đong cốc thuỷ tinh pha tinh, không đổ trực tiếp lên mặt mẫu tinh - Thể tích tinh pha cuối tính cho 100 ml tinh pha có 2,5 tỷ tinh trùng tương ứng 25 triệu tinh trùng/ml - Đảo nhẹ mẫu tinh đổ nhẹ nhàng toàn lượng tinh pha vào tuýp đựng tinh dung tích 100 ml - Dập tuýp tinh cho kín hồn tồn, đẩy tồn bọt khí đảm bảo khơng có bọt khí bên tinh - Đặt tinh nằm ngang so với mặt đất, mặt bàn phẳng, để chỗ mát, quấn khăn bọc túi nilon màu đen để tránh ánh sáng - Cân mẫu tinh nhiệt độ phòng 90 phút trước cho vào bảo quản tủ bảo ôn - Đặt tuýp tinh nằm ngang tủ bảo ôn 17oC, đảo tuýp tinh 1-2 lần/ngày (đảo tủ để tránh thay đổi nhiệt độ) - Trong điều kiện thực hành mơn học, với mục đích để sinh viên thực bước việc thu hồi tinh từ liều tinh cấp tái pha loãng theo yêu cầu thực hành, đồng thời, kiểm tra chất lượng lực bảo quản tinh loại môi trường sinh viên tự pha 1, theo đó, sau hồn thành việc đóng tinh sinh viên đặt tuýp tinh nằm ngang so với mặt đất, mặt bàn phẳng, để chỗ mát, quấn khăn bọc túi nilon màu đen để tránh ánh sáng Sau 60 phút, đảo liều tinh (5 đến 10 lần) nhúng vào bể ổn nhiệt cài sẵn để nước bể ổn nhiệt đạt 37oC, ủ tinh 30 phút, sau đảo tuýp tinh (5 đến 10 lần) cắt góc phía dán tuýp tinh, nhỏ giọt lên lam kính (hoặc dùng pipet dung tích 10µl hút 10 µl tinh giọt nhỏ lên lam kính) Soi ghi lại tiêu vận động tinh trùng quan sát giọt tinh Nộp kết cho giảng viên cán hỗ trợ BÀI THỰC HÀNH KHAI THÁC TINH VÀ THỤ TINH NHÂN TẠO GIA SÚC Mục tiêu - Nắm rõ nguyên lý, cấu tạo cách sử dụng âm đạo giả lấy tinh gia súc - Thực việc tháo lắp âm đạo giả khai thác tinh thỏ - Nắm rõ nguyên lý, cấu tạo sử dụng súng bắn tinh bò sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ - Thực kỹ thuật thụ tinh nhân tạo bò mẫu vật quan sinh sản thật bò Chuẩn bị máy móc, thiết bị, dụng cụ, hố chất mẫu vật - âm đạo giả lấy tinh thỏ - súng bắn tinh đông lạnh dạng cọng rạ bị dung tích 0,25 ml/cọng - cọng rạ dung tích 0,25 ml - 10 bao cao su người - thây thun - ống eppendorf dung tích ml - syring dung tích ml - kéo sắc - găng tay sản khoa - quan sinh sản bò Tiến hành * Cấu tạo âm đạo giả lấy tinh thỏ - Chất liệu nhựa, kèm van nhựa Hình âm đạo giả lấy tinh thỏ - Một ống thân âm đạo giả, đầu miệng rộng hướng dương vật thỏ đực, đầu đối diện miệng thu lại để lắp ống hứng tinh - Một lỗ nhỏ gần miệng nhỏ thành ống thân có nắp đậy, vị trí để bơm nước ấm vào lịng âm đạo giả thổi khí để làm căng vách âm đạo giả tạo độ ấm độ se khít tương tự âm đạo thỏ - Một túi cao su thủng hai đầu để lồng vào thành ống thân âm đạo giả tạo vách âm đạo giả tiếp xúc với dương vật thỏ đực tạo khoang chứa nước ấm bơm căng khí với thành ống thân * Thực hành tháo lắp âm đạo giả lấy tinh thỏ - Lấy bao cao su thứ khỏi bao gỡ hoàn toàn bao cao su ra, dùng kéo cắt phần đầu nhọn bao cao su vừa đủ miệng ống eppendorf dung tích 1,5 ml - Lồng phần vừa cắt bao cao su bao miệng ống eppendorf, dùng dây thun buộc chặt bao cao su vào rìa miệng ống eppendorf - Lấy bao cáo su thứ hai, dùng káo cắt toàn phần đầu nhọn bao cao su lồng vào mặt âm đạo giả - Lật mở hai đầu bao cao su để ôm lấy thành hai đầu thành âm đạo giả, dùng dây thun quấn chặt bao cao su vào thành âm đạo giả - Luồn phần miệng rộng bao cao su thứ vào thành ống thân âm đạo giả, luồn từ phần miệng hẹp lên phần miệng rộng ống âm đạo giả - Lật mở phần miệng rộng bao cao su thứ ôm lấy thành ống ấm đạo giả, đảm bảo đủ độ căng miệng ống eppendorf áp vào miệng hẹp ống âm đạo giả - Dùng syring dung tích ml hút nước bơm vào lịng âm đạo giả thơng qua lỗ bơm nước thành âm đạo giả (thực tế lấy tinh thỏ đực, nhiệt độ nước phải đạt 50 oC để đảm bảo kích thích thành cơng phản xạ phóng tinh thỏ đực) - Dùng miệng thổi căng lòng âm đạo giả nhanh tay đậy kín nắp để khí khơng lọt - Trong thực tế lấy tinh thỏ âm đạo giả, việc đảm bảo độ ấm độ khít thành âm đạo giả trước lấy tinh, bơi gel bơi trơn (ví dụ gel KY người) để giảm ma sát tránh gây tổn thương cho dương vật thỏ đực * Cấu tạo súng bắn tinh bò sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ 0,25 ml - Dụng cụ làm chất liệu thép không gỉ - Một ống ghen nhựa, dùng lần để bao toàn súng bắn tinh - Một ống thép bao súng bắn tinh để lắp cọng tinh - Một lõi thép để luồn bên ống súng bắn tinh đồng thời để đẩy nút bơng cọng tinh giúp đẩy tinh ngồi Hình súng bắn tinh bị Hình ống ghen phối giống cho bị Hình cọng rạ tinh đơng lạnh vật ni dung tích 0,25ml * Thực hành nạp cọng tinh vào súng bắn tinh sẵn sàng thụ tinh cho bò - Giả sử rã đông cọng tinh (lấy cọng tinh khỏi bình ni tơ trữ mẫu, nhúng vào nước ấm 37oC phút), lau khô cọng tinh giấy thấm vô trùng - Cắt phần đầu hàn cọng tinh - Nạp cọng tinh vào ống súng bắn tinh (đầu có bơng cọng rạ luồn vào ống súng, đầu cắt phía ngồi) - Lồng ống ghen bao súng - Lắp lõi súng bắn tinh đến thấy kích tay dừng lại * Thực hành thụ tinh nhân tạo cho bò mẫu vật sống quan sinh sản bị sử dụng tinh đơng lạnh dạng cọng rạ - Đeo găng tay sản khoa bên tay trái - Quan sát xác định quan sinh sản bị - Sờ khám (khơng nhìn vào mẫu vật) để xác định vị trí quan sinh dục bò gồm cổ tử cung, ngã ba sừng tử cung - Mắt nhìn vào mẫu vật để xác định vị trí âm mơi âm đạo, tay trái nắm lấy ống sinh dục vị trí cổ tử cung, tay phải đưa đầu súng bắn tinh vào âm đạo - Mắt khơng nhìn mẫu vật, tiếp tục luồn súng bắn tinh tới cổ tử cung vượt qua cổ tử cung (3 vòng cơ), tay trái cảm nhận vị trí đầu súng bắn tinh, định vị xác vị trí bắn tinh tiến hành bắn tinh - Tay trái giữ nguyên vị trí, tay phải rút súng bắn tinh khỏi đường sinh dục - Rút tay trái khỏi đường sinh dục cái, kết thúc trình bắn tinh