BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC- MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG LỚP 09MT112 NHÓM - TỔ 2: NGUYỄN TĂNG CƯỜNG NGUYỄN VĂN CƯỜNG DƯƠNG THỊ QUỲNH CHÂU NGUYỄN VĂN ĐÔ GVHD: VƯU NGỌC DUNG BÀI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM I Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh a Pha môi trường: +môi trường lỏng: Cân, đong chất cho hịa tan vào nước cất +mơi trường đặc: cân agar hóa chất cho vào bình tam giác hay becher hòa tan nước, đun bếp hay hấp autoclave b Chuẩn bị môi trường(làm thạch petri): Đun thạch chảy lỏng, để nguội 50 – 60 oc Tay phải cầm bình mơi trường chảy lỏng, giữ nghiêng, dùng tay trái xoay rút nút bơng ra, vơ khuẩn miệng bình đèn cồn Dùng tay trái mở nắp hộp vừa phải nhanh tay rót vào hộp lượng mơi trường thích hợp Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ bàn để thạch dàn thành lớp đáy hộp không xoay mạnh làm thạch bắn lên Hé mở nắp hộp để yên lúc thạch đặc hoàn toàn Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên Môi trường Sabouraud ( để nuôi cấy nấm mốc nấm men) - Pepton : 2g - Glucose : 4g - Agar : 1,8g - Nước cất : 100ml (Khử khuấn nồi áp suất 121 độ c , áp suất 1atm , thời gian 30 phút ) Môi trường thạch bán lỏng di động - Nutrient borth : 1,3g - Agar : 0.5g - Nước cất : 100ml - pH: 7,2 Pha chế: Đem thành phần môi trường hòa tan nước cất Đun cất thủy cho agar hòa tan Phân vào ống nghiệm 16 x 120mm, ống khoảng 5ml Đem hấp khử khuẩn 1210C(1atm)/ 15-20 phút Lấy để đứng cho môi trường đông lại 3.Môi trường nutrient Agar (NA) - Nutrient borth : 1.3g - Agar : 1.8g - Nước cất : 100ml (Khử khuấn nồi áp suất 121 độ c , áp suất 1atm , thời gian 30 phút ) 4.Môi trường Nutrient Borth (NB) - pepton: 15 g - muối : g - nước : 1000 ml (hấp khử trùng 121 độ c, áp suất atm, thời gian 25-30 phút) Môi trường Plate count agar (PCA) (g/l): - Trypton: g - Yeast extract: 2,5 g - Glucose: g - Agar: 15 g vào lít nước cất Sau hấp khử trùng 121oC, 1atm, thời gian 30 phút II Chuẩn bị mẫu - Chuẩn bị bình nón có dung tích 250ml + Bình chứa 90ml nước cất vơ trùng + bình vơ trùng khơng chứa - Cân 1g mẫu đất cho vào bình rối đổ tồn nước bình vào - Lắc phút , để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy thập phân III.Tiến hành thí nghiệm Ni cấy nấm - Dùng cồn rửa tay( gần hết cách tay ) không gian xung quanh chỗ làm việc - Môi trường sabouraud sau vô trùng , lấy để nguội khoảng 45-50 độ C - Hút 0.1ml mẫu vào ống mơi trường , đậy nút lại lắc trịn quanh trục ống nghiệm - Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa petri đậy thật nhanh nắp lại cho mặt nắp mơi trường khơng cịn khơng khí - Tất thao tác trình làm phải làm gần lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn - Kết : sau 24h ta thấy sợi đen chấm nhỏ li ti Đó nấm mốc bào tử Ni cấy vi sinh hiếu khí - Dùng cồn rửa sach tay ( gần hết cách tay ) khử trùng không gian xung quanh nơi làm việc - Môi trường thạch sau hấp khử trùng mang để nguội khoảng 45-50 độ C - Đổ môi trường vào 1/3 đĩa petri , để môi trường đông đặc lại - Dùng pipet lấy 0.1ml mẫu cho vào đĩa petri , dùng que trang khử trùng trang mẫu mặt môi trường - Đậy nắp đĩa petri lại úp ngược đĩa petri lại để tránh vi khuẩn hô hấp đọng nước mặt đĩa , rớt xuống môi trường bị nhiễm khuẩn - Tất thao tác trình làm phải làm gần lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn - Kết : sau 24h thấy chấm trắng nhỏ đĩa petri , khuẩn lạc Ni cấy E.coli Coliform - Cách tiến hành - Định lượng e.coli colifom phương pháp MPN gọi phương pháp pha loãng tới hạn Phương pháp định lượng dưa loạt lặp lại thí nghiệm với pha loãng nồng độ khác Dùng cồn rửa tay ( gần hết cách tay) khử trùng xung quanh nơi làm việc -Lấy mẫu nước thải pha loãng theo nồng độ : 10-1 , 10-2, 10-3 Lấy đĩa petri , hút ml ống nghiệm pha loãng khác cho vào đĩa thạch, xoay nhẹ nhàng để trộn dung dịch Đậy nắp đĩa petri lại úp ngược lại để tránh bị nhiểm khuẩn Ủ ấm từ 35 – 370C sau 24 - Kết : sau 24h khuẩn lạc đặc trưng E.coli Coliform có màu đỏ tía , đường kính 0.5mm , bao quanh vùng đỏ mật kết tủa hình ảnh vi khuẩn e.coli coliform Pha loãng mẫu: Chuẩn bị số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng số ống hút (1ml) vô trùng Ta lấy 10ml nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm Lấy 0,1g đất cho vào ống nghiệm thứ lắc đất tan hoàn toàn Dùng ống hút hút 1ml nước ống nghiệm cho vào ống nghiệm lắc đều, sau lấy 1ml nước ống nghiệm cho vào ống nghiệm lắc Tùy theo số lượng vi sinh vật mẫu mà ta pha loãng nhiều hay Ở ta lấy 1ml nước mẫu tương đương với độ pha loãng 10-1 a Mẫu trạng thái lỏng : - Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Hình 5.1 : Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân b Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) - Chuẩn bị bình hình nón có dung tích 250 ml + Bình chứa 90ml nước cất vơ trùng + Bình vơ trùng khơng chứa - Khử trùng cối chày sứ cách cho cồn vào đốt lên Sau để nguội - Cân g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ nghiền nát mẫu - Dùng toàn nước bình để chuyển tồn mẫu sang bình - Lắc phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu mẫu trạng thí lỏng - Tuỳ theo ước đốn số lượng vi sinh vật mẫu mà pha loãng nhiều hay Hình 5.2 Phương pháp pha lỗng mẫu đất Phương pháp phân lập vi sinh vật: a Kỹ thuật hộp ria: - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống - Ria đường đĩa pêtri chứa mơi trường thích hợp (ria chữ T ria bốn góc) Sau đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria - Bao gói đĩa pêtri, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Hình 5.3 Kỹ thuật hộp ria b Kỹ thuật hộp trải: - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Nhúng đầu gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa - Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường - Rút gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Hình 5.4 Kỹ thuật hộp trãi IV Tính tốn: đĩa TVSVHK 30 TVNẤM 35 Ecoli & colyfom -3 (nồng độ pha loãng 10 , mẫu đất) đĩa 45 45 60 đĩa 50 60 40 Vi sinh vật hiếu khí : - Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát - Công thức : Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha lỗng CFU/g= ………………………………………… Thể tích mẫu (ml) * tính tốn: - độ pha lỗng: 103 - thể tích mẫu : 0,05 ml Số trung bình TVSVHK: (30+45+50)/3 = 42 CFU/g = ( 42 x 10 ) /0,05 = 840000 CFU CFUtb CFU/g đĩa 30 đĩa 45 (30+45+50)/3 = 42 (42 x 103)/0,05 = 840000 đĩa 50 Tổng vi nấm: - Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát - Công thức : Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng CFU/g=………………………………………… Thể tích mẫu (ml) *tính tốn: - độ pha lỗng: 103 - thể tích mẫu: 0,05 ml Số trung bình TVNẤM : (35+45+60)/3 = 47 CFU/g= (47 x 103)/0,05 = 940000 CFU CFUtb CFU/g Đĩa 35 Đĩa 45 (35+45+60)/3 = 47 (47 x 103)/0,05 = 940000 Đĩa 60 E.coli Coliform - Phương pháp MPN + Đây phương pháp định lượng dựa kết tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha lỗng khác + Thơng thường việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp + Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm + Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trinh bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu độ xác số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng - Kết : sau ngày ta có kết sau Đĩa Đĩa 60 Đĩa 40 - Theo bảng MPN số lương vi khuẩn 15MPN/100ml nhiên số lượng vi sinh vật ta cho 10ml mẫu vào hệ thống ống nghiệm Thực tế ta hút 0.1ml mẫu kết xác cho mẫu 15 x 10 = 150MPN/100ml mẫu hay 150000MPN/0.1ml mẫu V Phương pháp nhuộm Gram: Dụng cụ: - Mơi trường có vi khuẩn - tiêu phết kính - muối sinh lí - tím kết tinh - lugol - safranin O (fuchsin) - giấy thấm - dầu soi kính Các bước tiến hành: - Rửa lam kính thật sạch, lau khô hơ đèn cồn - Dùng bút lơng vẽ hình trịn nhỏ ghi tên người thí nghiệm - Lật mặt sau lam kính dùng que cấy nhúng vào nước thải lấy lượng vừa đủ cho vào hình trịn vẽ dàn đến vi sinh - Chờ cho khô hơ đèn cồn - Sau khô, ta nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi Crystal violet - Sau 1-2 phút rửa lại cồn 960 tiếp tục rửa nước cất Sau hơ khơ đèn cồn - Nhỏ tiếp iodine(lugol) - Để 1-2 phút rửa cồn nước cất - Cho giọt safranin sau để 1-2 phút rửa nước cất hơ khơ - Nhỏ giọt dầu soi lên phết kính dùng kính hiển vi quan sát vi khuẩn 3.Kết quả: - Dưới kính hiển vi quan sát thấy màu: màu tím – Gram( +) màu hồng – Gram (-).Hình thái tế bào: tụ cầu, cầu VI Câu hỏi ôn tập: Hỏi: Tại phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng tiệt trùng? Trả lời: vô trùng để tránh vi khuẩn có hại xâm nhập vào mơi trường ni cấy - có phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô nhiệt ẩm * phương pháp tiệt trùng nhiệt khô: sấy tủ sấy nhiệt độ 170 – 180 C * phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm: Được thực thiết bị tiệt trùng áp suất atm, 1210C thời gian 20-30 phút - phương pháp vơ trùng: *dùng hóa chất: cồn 700, iod, phenol * phương pháp vật lý: dùng nhiệt tia sóng điện tử Hỏi: Tại chuẩn bị môi trường thạch đĩa petri lại mở nắp? Trả lời: mở nắp để tránh q trình nước, nước đọng nắp điều kiện tốt cho vi khuẩn phát triển Hỏi: Tại phải điều chỉnh độ pH mơi trường? Trả lời: vi sinh vật sống phát triển nồng độ pH định Hỏi: Có loại mơi trường thạch ống nghiệm? nêu đặc trưng cho loại mơi trường? Trả lời: có loại môi trường thạch ống nghiệm: thạch đứng thạch nghiêng Hỏi: Tại phải pha loãng mẫu? bước pha loãng mẫu? Trả lời: pha loãng mẫu để dễ dàng quan sát số lượng vi sinh vật có mẫu Các bước pha lỗng (xem phần ) Hỏi: Vi sinh vật hiếu khí có đâu môi trường? ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn hiếu khí? Trả lời: vi sinh vật hiếu khí có khắp nơi có oxi.Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn hiếu khí để biết nơi có nhiễm hay không Hỏi: Tại phải khử trùng hay sát trùng tồn bộ: mơi trường, dụng cụ, tay q trình thao tác?Ý nghĩa việc khử trùng sát trùng? Trả lời: phải khử trùng hay sát trùng toàn để vi khuẩn có hại khơng xâm nhập lan truyền trình thao tác.Ý nghĩa việc khử trùng sát trùng đảm bảo môi trường vi sinh vật sống phát triển tốt ...BÀI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM I Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy vi sinh a Pha môi trường: +môi trường lỏng: Cân, đong chất cho hòa tan vào nước cất +mơi trường đặc: cân agar hóa chất cho vào... (xem phần ) Hỏi: Vi sinh vật hiếu khí có đâu mơi trường? ý nghĩa vi? ??c xác định tổng vi khuẩn hiếu khí? Trả lời: vi sinh vật hiếu khí có khắp nơi có oxi.Ý nghĩa vi? ??c xác định tổng vi khuẩn hiếu khí... cho vi khuẩn phát triển Hỏi: Tại phải điều chỉnh độ pH mơi trường? Trả lời: vi sinh vật sống phát triển nồng độ pH định Hỏi: Có loại mơi trường thạch ống nghiệm? nêu đặc trưng cho loại môi trường?