MỤC LỤC Trang A B Giới thiệu kĩ thuật Fish Phương pháp thực Fish IQuy trình thực .3 1.1 Tóm tắt quy trình thực .3 1.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang 1.3 Chuẩn bị mẫu xử lý sơ 1.4 Lai đầu dị trình tự đích đặc hiệu 1.5 Quan sát xử lý tín hiệu .10 IINhững trở ngại kĩ thuật Fish 12 2.1 Kết không xác 12 2.1.1 chất tự phát huỳnh quang………………………………… 12 2.1.2 Đầu dị thiếu tính đặc hiệu……………………………………… 13 2.2 Kết âm tính .13 2.2.2 Do cấu trúc phức tạp đầu dị hay trình tự đích…… 13 2.2.3 Hàm lượng ARN thấp ………………………………………… 14 2.3.4 Ảnh chụp bị màu…………………………………………….14 III- Biện pháp khắc phục…………………………………………………… 15 C Ứng dụng kĩ thuật Fish…………………………………… ………………16 I Hệ vi sinh vật nước thải………………………………………… …16 II Vi khuẩn cộng sinh…………………………………………………………17 III Trong Y học…………………………………………………………… …18 III.1 Các quần thể vi khuẩn phức tạp…………………………………… 18 III.2 Phát mầm bệnh mô cấy dụng cụ vô trùng……… 22 III.3 Nấm……………… ……………………………………………… 23 III.4 Thuốc thú Y………………… …………………………………….24 III.5 Các mầm bệnh thực vật……………………………………………24 D.Triển vọng phát triển Fish…………… ……………………………….25 I Trên giới……………………………………………………………… 25 II Tại Việt Nam……………………………………………………………….29 E Tài liệu tham khảo 31 A GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH FISH kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê định vị tế bào vi khuẩn FISH không cho phép nhận vi sinh vật quen thuộc, biết mơi trường ni cấy đặc hiệu mà cịn xác định vi sinh vật lạ, chưa biết rõ điều kiện môi trường nuôi cấy, FISH giúp biết rõ hệ thống phức tạp quần thể vi sinh vật FISH kết hợp xác kỹ thuật di truyền phân tử quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung nhận biết tế bào vi khuẩn môi trường tự nhiên hay mô bệnh Độ nhạy tốc độ thực đặc điểm bật giúp FISH trở thành công cụng hiến cứu hữu hiệu Trên giới, FISH sử dụng việc mô tả quần thể vi sinh vật môi trường tự nhiên, bật hệ vi sinh vật trầm tích biển Wadden, vịnh hẹp Na-uy, sinh vật phù du sông biển, tuyết hồ núi cao, đất bề mặt rễ thực vật FISH đặc biệt phổ biến y học, ngồi mục đích xác định mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH cịn sử dụng để chẩn đốn thường qui bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh sau sinh) thai nhi Ở Việt Nam nghiên cứu sử dụng FISH hạn chế, chủ yếu ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền Do việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật nước ta tương lai mở bước tiến việc nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển B PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH I QUY TRÌNH THỰC HIỆN 1.1 Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH FISH dị tìm phát trình tự acid nucleic loài vi sinh vật mong muốn cách dùng đầu dò đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với trình tự đích đặc hiệu bổ sung với bên tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào) Quy trình thực bao gồm bước sau: - Chuẩn bị mẫu đầu dò - Cố định mẫu - Lai đầu dò trình tự đích đặc hiệu nằm tế bào - Rửa mẫu để loại bỏ đầu dị khơng lai - Dị tìm mẫu (bước bỏ qua sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp) - Quan sát, hiển thị lưu trữ kết Hình 1: Các bước phương pháp FISH 1.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang Lựa chọn đầu dò: Như đề cập từ trước, trình tự đích sử dụng phổ biến FISH rRNA 16S chúng ổn định mặt di truyền, số lượng nhiều cấu trúc bán bảo tồn Các đầu dò oligonucleotide ứng với cấp độ phân loại, loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, chi lồi cụ thể thiết kế dựa theo kích thước rRNA đích Với tăng lên nhanh chóng đoạn thơng tin di truyền sở liệu chung thương mại, đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết định danh loài vi sinh vật trở nên dễ dàng xác Điều đặc biệt có ý nghĩa tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay sinh vật chưa nuôi cấy đặc hiệu Số lượng lớn rRNA 16S lần chép trình hoạt động trao đổi chất tế bào cung cấp đủ số lượng trình tự đích để hiển thị dòng tế bào cụ thể, oligonucleotide gắn nhãn huỳnh quang thí nghiệm FISH Việc lựa chọn vị trí trình tự đích q trình thiết kế đầu dị phải tiến hành với thận trọng cao Gần đây, trình tự đích khác rRNA 23S, rRNA 18S mà gần mRNA xác định thành cơng thí nghiệm FISH Việc lựa chọn đầu dị để sử dụng FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ nhạy khả xâm nhập vào tế bào Một đầu dị oligonucleotide điển hình có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, tạo thiết bị tổng hợp tự động Các đầu dị ngắn dễ dàng tiếp cận với trình tự đích, chúng lại mang trình tự đánh dấu Trong FISH, trình tự đích thơng dụng rRNA 16S chúng ổn định mặt di truyền, cấu trúc bán bảo tồn, số lượng nhiều Do đó, đầu dò lựa chọn thường oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo liên kết bổ sung đạt hiệu cao trình lai Các đầu dị oligonucleotide huỳnh quang ngày có số sản phẩm thương mại hóa Chúng lưu trữ ở-20OC tối khoảng vài tháng Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ dễ dàng thực chúng khơng địi hỏi phải tiến hành bước dị tìm sau q trình lai Một nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết trực tiếp với oligonucleotide suốt trình tổng hợp thông qua liên kết amino đầu 5’ đầu dò, sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ đầu dị Ngồi ra, số thuốc nhuộm Flourescein-Isothiocyanate (FITC) gắn vào oligonucleotide theo dải đệm 18 carbon làm tăng cường độ tín hiệu so với đầu dị đánh dấu trực tiếp Sự tăng lên tín hiệu huỳnh quang biểu đầu dò gắn nhãn chất huỳnh quang hai đầu, phân tử đầu 3’ phân tử đầu 5’ sử dụng miếng đệm thích hợp để ngăn chặn che khuất lẫn tín hiệu huỳnh quang Trong số trường hợp, việc dị tìm theo cách gián tiếp có hiệu Người ta thấy rằng, tăng độ nhạy thí nghiệm FISH lên cách kết hợp đầu dò với chất thị Digoxygenin (DIG), sau chúng dị tìm thơng qua chất phản huỳnh quang Độ nhạy FISH cịn tăng lên đáng kể sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu Phương pháp phát triển Kagiyama cộng (1993) nghiên cứu di truyền học tế bào, sau Yamaguchi cộng thay đổi để áp dụng vào định danh vi khuẩn (1996) Ban đầu, oligonucleotide đánh dấu digoxygenin trên, sau dị tìm thể kháng digoxygenin, kháng thể tiếp tục liên kết với enzyme phosphatase kiềm Enzyme chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thểnày tạo màu huỳnh quang đỏ sáng kết hợp với Fast Red TR Tín hiệu huỳnh quang thu theo cách thực có cường độ mạnh lần so với tín hiệu oligonucleotide gắn nhãn huỳnh quang Phương pháp khuếch đại tín hiệu enzym ngày cải tiến tốt nhờ vào kỹ thuật gọi “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA) Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần Tuy nhiên, số lượng tế bào lai thành công giảm cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dị thơng thường đánh dấu chất huỳnh quang Điều xảy trình xâm nhập chất cao phân tử bào tế bào vi khuẩn bị hạn chế chất nhuộm thông thường Mặc dù enzyme lysozyme giúp cải thiện tính thấm đầu dị vào tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu nâng cao, phương pháp dường không áp dụng với số loài vi khuẩn Gram dương, phương pháp chủ yếu dùng để phân tích quần thể vi khuẩn tạp Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dị polyribonucleotide (e)(Moter et al., 2000) Có lẽ phương pháp hiệu kết hợp việc sử dụng đầu dò polyribonucleotide, đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA) Kỹ thuật ứng dụng thành công dị tìm phát trực quan độc tố Listeria(Hình 2e) Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang có mức lượng kích thích phát xạ tối đa khác nên cho phép phát đồng thời hai nhiều vi sinh vật chỉlai lần Cùng với việc quan sát trực quan kính hiển vi đa màu FISH, lọc màng nhiều dải sử dụng Các chất huỳnh quang tổng hợp có điểm phát xạ sắc nét khác nên loại bỏ tượng phổ huỳnh quang chồng lên đầu dò, đồng thời hạn chế vấn đề màu dây, nhem màu Chất màu huỳnh quang có màu sáng bền quang học nên sử dụng để dị tìm trình tự đích mà lượng mẫu Bảng 1: Một số thuốc nhuộm sử dụng để dị tìm vi sinh vật phương pháp FISH Bước sóng thay đổi nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất Quang phổ phát xạ thay đổi dung mơi khác đặc tính mẫu *FITC : Fluorescein–isothiocyanate **FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester ***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate 1.3 Chuẩn bị mẫu xử lý sơ Trước tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật đầu dò phải ngâm hợp chất tạo tủa ethanol methanol, hợp chất tạo liên kết ngang aldehyde hỗn hợp chất để đầu dò huỳnh quang thấm vào bên tế bào bảo vệ rRNA khơng bị biến tính RNAse nội bào Các điều kiện phương pháp cố định mẫu khác tùy thuộc vào vi sinh vật đích loại mẫu Q trình cố định mẫu tối ưu đưa số lượng lớn đầu dò thấm vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản tồn vẹn cấu trúc tế bào hình thái chúng Cố định đầu dò vào mẫu hiệu ảnh hưởng tích cực đến kết FISH, việc cố định khó để tối ưu hóa Thơng thường lượng dung dịch formaldehyde paraformaldehyde 3-4% (v/v) phù hợp cho hầu hết loại vi khuẩn Gram âm Đối với vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn hợp ethanol/formalin (tỉlệ9:1 v/v) xử lý nhiệt biện pháp thơng dụng nhất; ngồi bổ sung thêm bước xử lý sơ để tăng tính thấm đầu dò Khi áp dụng phương pháp FISH mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, trình tiền xử lý bắt buộc phải áp dụng để tăng khả tiếp cận đầu dò trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế liên kết không đặc hiệu Gần đây, FISH áp dụng mẫu mô tế bào ngâm dung dịch keo lạnh Trong chất dẻo này, hiển thị vi khuẩn bảo vệ cấu trúc mô tế bào hồn chỉnh mà khơng có trình tiền xử lý 1.4 Lai đầu dị trình tự đích đặc hiệu Trước tiến hành lai, tế bào sau giai đoạn xử lý kể cố định vào mặt kính Để q trình gắn mẫu vào mặt kính tốt hơn, người ta khuyên nên xử lý bề mặt kính trước cách phủ lên mặt kính lớp chất tráng kính ngồi Các hóa chất sử dụng cho hiệu tốt gelatin , poly-L-lysine hay hợp chất tạo muối Quá trình lai phải thực điều kiện nghiêm ngặt nhằm kết hợp xác đầu dị đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng Đối với thao tác quan trọng thí nghiệm FISH, trình làm nóng sơ phân tử lai phải thực để đầu dò huỳnh quang kết hợp bổ sung với trình tự RNA đích tương ứng Sự xác bắt cặp bổ 10 II Vi khuẩn cộng sinh Hầu hết vi sinh vật cộng sinh bắt buộc chưa tiến hành nuôi cấy Sử dụng rRNA 16S, chúng định danh phân cấp phát sinh loài Việc khoanh vùng vi sinh vật phận khác vật chủ FISH chứng minh tính chất cộng sinh chúng, Amann cộng (1991) làm, người xác định vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi Holosporatrên lông Paramecium caudatum Từ lồi Holospora tìm thấy nhân vi sinh vật có lơng mịn, nhận biết rõ ràng vi khuẩn tiêu hóa diện túi thức ăn Tương tự, FISH sử dụng để chứng minh Paramecium caudatum chứa Caedibacter caryophila, “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà phát triển có liên quan đến loài Rickettsia Gần đây, vi khuẩn nội cộng sinh liên quan đến Rickettsia, điều chứng minh lồi Acanthamoeba[44] Có điều thú vị giống amip tương ứng phân lập từ lớp mô mỏng giác mạc người Sarcobium lyticum, loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến chi Legionella, chứng minh có amip lấy từ mẫu nước bọt bệnh nhân viêm phổi Những chứng minh cho thấy amip xem nguồn gây bệnh cho người mà vật truyền cho nhiều loại vi khuẩn cộng sinh khác Đây trường hợp vi khuẩn nội cộng sinh không bắt buộc Legionella pneumophila tìm thấy tế bào Acanthamoeba castellani Tetrahymena pyriformiscó lơng Trong mơi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae sống sót trạng thái vơ hoạt, chúng khơng bị phát kỹ thuật nuôi cấy thông thường Phục hồi tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động 18 điều khiển thành công FISH tế bào chủ Acanthamoeba castellanii Những nghiên cứu có tác động to lớn ngành dịch tễ học mầm bệnh Sử dụng cách thức lai chỗ (ISH) khác nhau, vi khuẩn nội cộng sinh tìm thấy mang động vật thân mềm hai vỏ Solemya reidii Sinh vật xử lý khuôn mẫu để đánh giá kỹ thuật cố định metacrylate tách acetone nhằm tăng cường độ tín hiệu nâng cao độ nhạy ISH đoạn mơ Gần đây, Methanobrevibacter– lồi có liên quan với vi khuẩn cổ– tìm thấy FISH lượng nội bào Reticulitermes speratus, loài mối cánh thu thập từ quần đảo Nhật III FISH y học 3.1 Các quần thể vi khuẩn phức tạp 3.1.1 Khoang miệng Phân tích quần thể FISH thể đặc biệt hữu ích việc mơ tả hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay hệ vi sinh vật nhiễm tạp Những phân tích cho thấy khoang miệng người có chứa 300 lồi vi khuẩn khác nhau, có nhiều lồi phức tạp tiến hành nuôi cấy chưa nuôi cấy Các bệnh miệng viêm hay viêm lợi có liên quan đến mạng lưới vi khuẩn đặc thù Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt có xem thường đa dạng vi sinh vật Những lợi ích sử dụng kỹ thuật FISH thể vi khuẩn kị khí gram âm, Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythusvà Prevotella intermediatrong thành phần mảng bám bệnh nhân viêm Phân tích sâu môi trường phân tử cho thấy đa dạng không ngờ loại xoắn 19 khuẩn khoang miệng bệnh nhân với phát triển nhanh chóng viêm Số lượng lớn vi khuẩn hình xoắn đa dạng hình thái chúng Hình Nhuộm huỳnh quang lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm (a) lai với đầu dò vi khuẩn EUB338 gắn nhãn FITC (xanh cây) để hiển thị hình thái khác vi khuẩn cấp độ đơn bào TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dị tìm lồi phát sinh thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa ni cấy (b) đối tượng, tiến hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh cây) TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) dị tìm xoắn khuẩn khoang miệng thuộc loài phát sinh nhóm II Cần lưu ý phân loại xoắn khuẩn theo nhóm phát sinh lồi dựa liệu rRNA 16S Hình FISH quan sát màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 TRE I (a) độ phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3 20